Merkblatt Prüfung von Aseptikanlagen: Entkeimung des Sterilbereichs des Maschineninnenraums

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1 VDMA-Fachverbandsschriften Nahrungsmittelmaschinen und Verpackungsmaschinen Merkblatt Prüfung von Aseptikanlagen: Entkeimung des Sterilbereichs des 2003/ Nr. 8 Juli 2003 Verband Deutscher Maschinenund Anlagenbau e.v. Nahrungsmittelmaschinen Fachverband und Verpackungsmaschinen Vorsitzender: Ernst H. Berndl Geschäftsführer: Richard Clemens Lyoner Straße 18 D Frankfurt am Main Telefon Telefax nuv@vdma.org Internet VDMA Wir, die Investitionsgüterindustrie

2 Inhaltsverzeichnis 1 VORBEMERKUNGEN BEGRIFFE ANFORDERUNGEN AN TESTKEIME ZUR ÜBERPRÜFUNG VON VORRICHTUNGEN ZUR ENTKEIMUNG DES STERILBEREICHS DES MASCHINENINNERAUMS ASEPTISCH ARBEITENDER ABFÜLLMASCHINEN ENTKEIMUNG MITTELS WASSERSTOFFPEROXID ENTKEIMUNG MITTELS WASSERDAMPF MEDIEN ZUM SUSPENDIEREN DER SPOREN...5 PRÜFVERFAHREN TEST MIT KEIMTRÄGER ALLGEMEINE VORGEHENSWEISE PRÜFVERFAHREN PRÜFBERICHT ANWENDUNG DES MERKBLATTS AUF DIE ÜBERPRÜFUNG NICHTASEPTISCH ARBEITENDER ABFÜLLMASCHINEN MIT VORRICHTUNGEN ZUR PACKSTOFFENTKEIMUNG LITERATUR ZITIERTE NORMEN...7 ANHANG I TESTKEIME FÜR ASEPTISCHE ANLAGEN...9 ANHANG II HERSTELLUNG UND BEIMPFUNG DER KEIMTRÄGER...10 HERSTELLUNG DER KEIMTRÄGER...10 BEIMPFUNG...10 ANHANG III ANZUCHTBEDINGUNGEN DES TESTSTAMMES BACILLUS SUBTILIS SA 22 UND HERSTELLUNG DER SPORENSUSPENSION...11 Dieses Merkblatt wurde im VDMA-Arbeitskreis Schnittstellenproblematik bei Aseptikanlagen erarbeitet. An der Erstellung des Arbeitsblatts haben mitgewirkt: Herr Rainer Ammann Herr Dr. Cornelius Herr Dr. Hongan Duong Herr Rudolf Flörke Herr Dr. Peter Golz Herr Reinhard Kupfer Herr Andreas Lörcks Herr Michael Luippold Herr Gerd Müller Herr Thomas Niehr Herr Dr. Ingo Sabotka Herr Dr. Christoph Schuch Herr Willibald Weber Herr Helmut Weber Herr Joachim Wunderlich Frau Regina Zschaler Anregungen zum Inhalt des Merkblatts können gerichtet werden an den Verband Deutscher Maschinen- und Anlagenbau e.v. (VDMA), Fachabteilung Verpackungsmaschinen, Lyoner Straße 18, Frankfurt/M. (Fax: 0069/ ) / gz/ FS_08_2003_deutsch.doc Fachverband Nahrungsmittelmaschinen und Verpackungsmaschinen, Seite 2/11

3 1 Vorbemerkungen Aseptisch arbeitende Abfüllmaschinen (Aseptikanlagen) sind Verpackungsmaschinen, die ein steriles Füllgut (z.b. Lebensmittel) rekontaminationsfrei in ein zumeist auf der Maschine entkeimtes Packmittel füllen. Um dies zu erreichen, werden hohe Anforderungen an den Wirkungsgrad der Entkeimungsvorrichtungen für das Packmittel, den Sterilbereich des sowie die produktführenden Teile gestellt (s. VDMA 8742). So wird für die Packmittelentkeimung eine Keimreduktion für das jeweilige Entkeimungsverfahren geeigneter Testkeime von mindestens vier Zehnerpotenzen als notwendig erachtet. Für die Entkeimung des Sterilbereichs des Maschineninneraums werden gleich hohe Anforderungen gestellt. Gegenstand dieses Merkblatts ist die Überprüfung des mikrobiologischen Wirkungsgrads von Vorrichtungen zur Entkeimung des Sterilbereichs des einer aseptisch arbeitenden Abfüllmaschine. Es handelt hierbei um einen sogenannten Challenge-Test, der die künstliche Verkeimung des Sterilbereichs des beinhaltet. Ausgangspunkt der Prüfung ist die erfolgreich durchgeführte Reinigung der Maschine. Nach erfolgter künstlicher Verkeimung des Sterilbereichs des wird das Entkeimungsprogramm der Abfüllmaschine gestartet und nach dessen Abschluss die Anzahl der überlebenden Keime bestimmt. Bei dem in diesem Merkblatt beschriebenen Test handelt es sich um einen sogenannten End-Punkt-Test (End-Point-Test). 1 Dieses Merkblatt erstreckt sich nicht auf die Überprüfung der Aufrechterhaltung des keimfreien Zustands des Sterilbereichs des während der Produktion. Der Auswahl des für das jeweilige Entkeimungsverfahren geeigneten Testkeims kommt eine besondere Bedeutung zu. Auswahlkriterium ist die Resistenz der Keime und deren Sporen gegenüber dem Entkeimungsmedium. In diesem Merkblatt werden daher Testkeime benannt, die zur Überprüfung von in Aseptikanlagen zur Drucklegung des Merkblatts eingeführten Entkeimungsverfahren geeignet sind. Die Entkeimungsleistung einer aseptischen Abfüllmaschine ist abhängig von einer Vielzahl von Maschinenparametern wie z.b. Konzentration und Temperatur des Wasserstoffperoxids, Feuchtigkeitsgehalt und Temperatur des Dampfes, Einwirkungszeit des Entkeimungsmittels u.a.m.. Diese Randbedingungen sind vor der Prüfung festzulegen. Der im Prüfbericht angegebene Wirkungsgrad bezieht sich stets auf die zuvor festgelegten Randbedingungen. Diese sind daher in den Prüfbericht aufzunehmen. Die Durchführung der hier beschriebenen Prüfverfahren setzt erhebliche Sachkenntnis voraus und sollte daher nur von Instituten,Labors oder Maschinenherstellern vorgenommen werden, die mit den Prüfmethoden vertraut sind. 2 Die Einbeziehung des Herstellers der zu überprüfenden Maschine wird empfohlen. An dieser Stelle sei auch darauf hingewiesen, dass grundsätzlich nur mikrobiologisch ausgebildetes Fachpersonal unter Hinweis auf die einschlägigen Sicherheitsvorschriften mit der Beschaffung, mit der Lagerung sowie mit dem Umgang mit den für die Prüfverfahren benötigten hochkonzentrierten mikrobiologischen Testkeimsuspensionen betraut werden sollte. Die hier beschriebenen Prüfmethoden können sinngemäß auch auf die Überprüfung weiterer Entkeimungsverfahren übertragen werden. Vergleiche hierzu Abschnitt 6. 1 Eine Alternative zu dem in diesem Merkblatt beschriebenen Test stellt der sogenannte Count-Reduction-Test dar, dessen Grundzüge z.b. im 'Merkblatt - Prüfung von Aseptikanlagen mit Packmittelentkeimungsvorrichtungen auf deren Wirkungsgrad' beschrieben sind. 2 Eine Referenzliste mit unabhängigen Instituten, die mit den Prüfmethoden vertraut sind, kann beim Herausgeber des Merkblatts angefordert werden. Fachverband Nahrungsmittelmaschinen und Verpackungsmaschinen, Seite 3/11

4 2 Begriffe Aseptisch arbeitende Abfüllmaschinen (Aseptikanlagen) Aseptisch arbeitende Abfüllmaschinen (Aseptikanlagen) sind Verpackungsmaschinen, die ein steriles Füllgut (z.b. Lebensmittel) rekontaminationsfrei in ein zumeist auf der Maschine entkeimtes Packmittel füllen. Um dies zu erreichen, werden hohe Anforderungen an den Wirkungsgrad der Entkeimungsvorrichtungen für das Packmittel, den Maschineninnenraum sowie die produktführenden Teile gestellt (s. VDMA 8742). So wird für die Packmittelentkeimung eine Keimreduktion für das jeweilige Entkeimungsverfahren geeigneter Testkeime von mindestens vier Zehnerpotenzen als notwendig erachtet. Aseptisch arbeitende Abfüllmaschinen finden typischerweise Anwendung bei der Abfüllung schwach saurer Produkte (ph 4,6), die ohne Kühlung über eine längere Zeit haltbar sein sollen. Sterilbereich des : Derjenige Bereich des Maschineninneraums einer aseptisch arbeitenden Abfüllmaschine, der nach erfolgter Entkeimung keimfrei gehalten werden muss, um eine Rekontamination des sterilen Produkts während der Abfüllung zu verhindern. Testkeim Testkeime dienen der Überprüfung von Entkeimungsvorrichtungen. Sie sollen eine hohe, möglichst definierte Resistenz gegenüber dem untersuchten Entkeimungsverfahren aufweisen, leicht nachzuweisen und gesundheitlich unbedenklich sein. Die Beschreibung eines Testkeims sollte folgende Merkmale enthalten: Name, D-Wert, genaue Stammesbezeichnung (ATTC-Nr. oder DSM-Nr.), Lot- Nr. (bei fertigen Sporensuspensionen) Beimpfen Künstliche Verkeimung eines Keimträgers mit Testkeimen. 3 Anforderungen an Testkeime zur Überprüfung von Vorrichtungen zur Entkeimung des Sterilbereichs des aseptisch arbeitender Abfüllmaschinen 3.1 Entkeimung mittels Wasserstoffperoxid Gebräuchlich ist die Verwendung von Sporen von Bacillus subtilis SA 22 (identisch mit NCA und mit DSMZ 4181). 3 3 Eine Anweisung zur Herstellung der Sporensuspension findet sich in Anhang IV zu diesem Merkblatt Fertige Sporensuspension dieses Stammes können u.a. bezogen werden von: The National Food Laboratory, Inc. Process Research & Microbiology Division 6363 Clark Avenue Dublin California Fax: BAG - Biologische Analysensystem GmbH Amtsgerichtstraße Lich Fax: 06404/3087 Merck KGaA Frankfurter Straße 250 Fachverband Nahrungsmittelmaschinen und Verpackungsmaschinen, Seite 4/11

5 3.2 Entkeimung mittels Wasserdampf und trockener Hitze Gebräuchlich ist die Verwendung von Sporen des Stammes Bacillus stearothermophilus NCA 1518 (identisch mit DSM 5934) 4. Zur Anwendung kommt bei der Entkeimung mittels Wasserdampf auch Clostridium sporogenes PA (SC-218). 3.3 Entkeimung mittels Peressigsäure Gebräuchlich ist die Verwendung von Sporen des Stammes Aspergillus niger (ATCC 16404) Medien zum Suspendieren der Sporen Ethanolische Lösung (70%) oder destilliertes Wasser 6. Weitere Zusätze sind im Prüfbericht anzugeben. 4 Prüfverfahren Test mit Keimträger 4.1 Allgemeine Vorgehensweise Bei diesem Prüfverfahren werden in drei verschiedenen Konzentrationsstufen beimpfte Keimträger (Herstellung siehe Anhang II) an den für den Sterilisationsprozess relevanten Stellen des Sterilbereichs des befestigt. Nach Ablauf des Entkeimungsprogramms der aseptisch arbeitenden Abfüllmaschine wird in jeder Konzentrationsstufe die Anzahl der eingesetzten Keimträger bestimmt, die ohne Wachstum blieben Darmstadt Fax: 06151/ (Bacillus subtilis (BGA) Sporensuspension für den Hemmstofftest, Merck Art. Nr ) Da sich die Art der Sporengewinnung auf deren Resistenzeigenschaften auswirkt, sollte die zugrunde gelegte Herstellvorschrift bzw. die Bezugsquelle der Sporensuspension im Prüfbericht vermerkt werden. Eine Überprüfung der Sporenresistenz gegenüber dem zu untersuchenden Entkeimungsmittel ist zu empfehlen. 4 Fertige Sporensuspensionen können u.a bezogen werden von: The National Food Laboratory, Inc. Process Research & Microbiology Division 6363 Clark Avenue Dublin California Fax: BAG - Biologische Analysensystem GmbH Amtsgerichtstraße Lich Fax: 06404/3087 Da sich die Resistenz der Sporen gegenüber feuchter Hitze von Charge zu Charge unterscheiden kann, sollte im Prüfbericht der D 121-Wert unter Nennung des Berechnungsverfahrens angegeben werden. (Zur Beschreibung biologischer Indikatoren für Resistenz gegenüber feuchter Hitze s. DIN EN ISO 14161) 5 Aspergillus niger ATCC Sporen können bezogen werden über HS System- und Prozesstechnik PF Kelkheim 6 Die Aufbringung der Testkeime sollte möglichst aus destilliertem Wasser oder 70%igem Alkohol erfolgen, da bei Verwendung von Puffern oder Kochsalzlösung hohe Salzkonzentrationen im Verlauf der Trocknung entstehen können und dadurch potentiell gebildete Schutzschichten falsche Abtötungsraten vortäuschen. 7 In der Praxis sind auch andere Verfahren gebräuchlich, z.b. die Direktbeimpfung der zu untersuchenden Stellen und Untersuchung der beimpften Stellen nach erfolgter Entkeimung mittels Abstrich Fachverband Nahrungsmittelmaschinen und Verpackungsmaschinen, Seite 5/11

6 4.2 Prüfverfahren i) Vor der Prüfung sind die für die Sterilisation relevanten und damit zu überprüfenden Stellen des Sterilbereichs des zu identifizieren. Hierbei ist die Einbeziehung des Maschinenherstellers zu empfehlen. ii) Bereitstellung der jeweils mit 10 5, 10 4 und 10 3 Keimen beimpften Teststreifen (Herstellungsvorschrift siehe Anhang II) in der benötigten Anzahl iii) Einbringen der Teststreifen in die gereinigte und getrocknete Maschine unter besonderer Berücksichtigung der unter i) identifizierten relevanten Stellen für die Sterilisation. iv) Protokollierung der mit Teststreifen belegten Stellen des Sterilbereichs des. v) Durchführung des Sterilisationsprogramms der aseptische arbeitenden Abfüllmaschine im definierten Wirkungsbereich. 8 vi) Sterile Entnahme der Teststreifen. Anschließend Trennen der drei mit unterschiedlichen Keimkonzentrationen beimpften Abschnitte unter sterilen Bedingungen. Jeder Abschnitt wird in ein Röhrchen mit einer für den Testkeim geeigneten Nährlösung 9 eingelegt. Die Röhrchen werden 3-5 Tage bei 30 bebrütet. Eine Gelbfärbung der Bouillon im Röhrchen sowie eine leichte Hautbildung auf der Oberfläche zeigt Wachstum an. Durch Ausstriche muss bestätigt werden, ob es sich um den eingeimpften Testkeim handelt. vii) Feststellen der Gesamtzahl der sterilen Keimträger in der jeweiligen Konzentrationsstufe bezogen auf die Gesamtzahl der in die Maschine eingebrachten Teststreifen. (= Prüfergebnis). Sind alle Proben der Konzentrationsstufe 10 4 negativ, ist die Anforderung aus VDMA 8742 für aseptisch arbeitende Abfüllmaschinen - Keimreduktion 4 Logzyklen - sicher erfüllt Prüfbericht Im Prüfbericht sind unter Hinweis auf dieses Merkblatt anzuführen: Ausführendes Prüfinstitut Kurzbeschreibung der geprüften Aseptikanlage (Hersteller, genaue Typbezeichnung, Art der Packstoffentkeimungsvorrichtung, Abgrenzung des Sterilbereichs des ) Einstellungen entkeimungsrelevanter Maschinenparameter in Abstimmung mit dem Maschinenhersteller Anforderung an die Keimreduktionsleistung der Aseptikanlage Art und Konzentration des Entkeimungsmittels Datum der Testläufe Genaue Bezeichnung des Testkeims, sofern verfügbar Angabe der Werte der Resistenzprüfung Beschreibung der Sporensuspension (Konzentration, Herstellungsvorschrift bzw. Bezugsquelle) 8 Eine Überprüfung der kritischen Prozessparameter vor dem Testlauf ist zu empfehlen (z.b. Konzentration des Wasserstoffperoxids, Temperaturen) 9 Bacillus subtilis und Bac. stearothermophilus: Glucose-Caseinpepton-Lösung, Zusammensetzung in g/l: Caseinpepton 10,0; Glucose 5,0; Bromkresolpurpur 0,04 / ph 6,9 ± 0,2 Aspergilus niger: Sabouraud-2% Glucose Bouillon, Zusammensetzung in g/l: Pepton aus Fleisch 5,0; Pepton aus Casein 5,0; D(+) Glucose 20,0; ph-wert 5,6 ± 0,1 10 In diesem Fall ist die rechnerische logarithmische Keimabtötungsrate deutlich höher als die geforderten 4 Logzyklen. Eine quantitative Angabe der Keimreduktionsrate ist möglich, wenn ein Keimreduktionstest in Analogie zur Vorgehensweise in VDMA (2002) durchgeführt wird. Im Unterschied zur dort praktizierten Durchschnittsbildung über alle Prüfpunkte ist allerdings die erreichte Keimreduktion für jeden Prüfpunkt anzugeben. Fachverband Nahrungsmittelmaschinen und Verpackungsmaschinen, Seite 6/11

7 Gesamtzahl der in den Sterilbereich des eingebrachten Keimträger Dokumentaion der für die Sterilisation relevanten Stellen im Sterilbereich des. Dokumentation der Verteilung der Keimträger im Sterilbereich des Dokumentation des Ablaufs des Sterilisationsprogramms Angabe Prüfergebnis (Gesamtzahl der sterilen Keimträger in der jeweiligen Konzentrationsstufe bezogen auf die Gesamtzahl der in die Maschine eingebrachten Keimträger) Ggf. Abweichungen von der Prüfvorschrift Beteiligtes Prüfpersonal Unterschrift des Prüfverantwortlichen 6 Anwendung des Merkblatts auf die Überprüfung nichtaseptisch arbeitender Abfüllmaschinen Die in diesem Merkblatt dargelegten Prüfvorschriften lassen sich sinngemäß auch zur Überprüfung von Entkeimungsvorrichtungen in hygienischen Abfüllmaschinen anwenden, die den strengen Anforderungen von VDMA 8742 nicht genügen. 11 Hierbei ist der Testkeim auf das Entkeimungsverfahren und ggf. auf den Anwendungsbereich abzustimmen. 7 Literatur D.T. Bernard u.a.: Validation of Aseptic Processing and Packaging, Food Technology, December 1990, pp VDMA FV NuV, 1997 VDMA-Checkliste Qualitätssicherung und Wartung erschienen in Verpackungs-Rundschau 7/97 S und 9/97, S VDMA FV NuV, Frankfurt, 2000 VDMA Fachverbandsschriften Nahrungsmittelmaschinen und Verpackungsmaschinen 2000/Nr. 2 Hygienische Abfüllmaschinen für flüssige und pastöse Nahrungsmittel Kategorisierung und typische Anwendungsfelder, als Download erhältlich unter VDMA FV NuV, Frankfurt 2002 VDMA-Fachverbandsschriften Nahrungsmittelmaschinen und Verpackungsmaschinen 2002/Nr. 6 Merkblatt - Prüfung von Aseptikanlagen mit Packmittelentkeimungsvorrichtungen auf deren Wirkungsgrad, als Download erhältlich unter VDMA 8742 Aseptische Verpackungsmaschinen für die Nahrungsmittelindustrie - Mindestanforderungen und Rahmenbedingungen für einen bestimmungsgemäßen Betrieb, 1996, Beuth-Verlag, Berlin 8 Ausgewählte Normen DIN EN ISO Biologische Indikatoren - Leitfaden für die Auswahl, Verwendung und Interpretation von Ergebnissen 11 Eine Kategorisierung hygienischer Abfüllmaschinen für die Nahrungsmittelindustrie findet sich in der VDMA- Veröffentlichung Hygienische Abfüllmaschinen für flüssige und pastöse Nahrungsmittel Kategorisierung und typische Anwendungsfelder (VDMA FV NuV 2000) Fachverband Nahrungsmittelmaschinen und Verpackungsmaschinen, Seite 7/11

8 DIN EN 1650 Quantitativer Suspensionsversuch zur Bestimmung der fungiziden Wirkung chemischer Desinfektionsmittel und Antiseptika in den Bereichen Lebensmittel, Industrie, Haushalt und öffentliche Einrichtungen DIN Bestimmung des Oberflächenkeimgehalts auf Einrichtungs- und Bedarfgegenständen im Lebensmittelbereich - Teil 2: Semiquantitatives Verfahren DIN Teil 3 Begriffe für Verpackungswesen - Packmittel Fachverband Nahrungsmittelmaschinen und Verpackungsmaschinen, Seite 8/11

9 Anhang I Testkeime für aseptische Anlagen Übersicht nach Bernard et al. (1990) Entkeimungsverfahren Testkeim Superheated steam Bacillus stearothermophilus B. polymyxa Dry heat B. stearothermophilus H 2 O 2 + heat B. subtilis A or B. subtilis var. globigii H 2 O 2 +UV B. subtilis A. Heat of formation B. stearothermophilus Gamma radiation B. pumilus Wet heat B. stearothermophilus Clostridium sporogenes Fachverband Nahrungsmittelmaschinen und Verpackungsmaschinen, Seite 9/11

10 Anhang II Herstellung und Beimpfung der Keimträger Herstellung der Keimträger Aus einem geeigneten Trägermaterial z.b. einer Aluminiumfolie (Dicke 0,09 mm) werden Streifen von 1 x 5 cm geschnitten. Mit einem Filzschreiber werden diese Streifen in 3 Abschnitte à 1 cm und 1 Abschnitt à 2 cm eingeteilt. Die Streifen werden für 3 Stunden bei 180 C im Trockensterilisator sterilisiert. Die sterilisierten Keimträger werden mit doppelseitigem Klebeband in eine sterile Plastikschale eingeklebt. Dabei wird der Schutzstreifen des Klebebandes so auf der Rückseite der Klebestreifens platziert, dass der Klebestreifen nicht vollständig am Boden der Plastikschale ankleben kann. Der Klebestreifen wird so eingeschnitten, dass die Keimträger mitsamt Klebestreifen einzeln entnehmbar sind. Beimpfung Vor der Verwendung wird die Keimsuspension auf eine Keimdichte von ca. 2 x 10 7 Keime pro ml (rechnerisch) eingestellt und weitere Verdünnungen (10 6 und 10 5 ) angelegt. Die Beimpfung erfolgt in einer sterilen Werkbank. Es werden 3 Konzentrationsstufen aufgeimpft: 10 5, 10 4 und Dazu werden mit einer geeigneten Pipette 10 µl einer entsprechend konzentrierten (10 7, 10 6, 10 5 ) Keimsuspension auf die Abschnitte getropft. Die Teststreifen werden in der sterilen Werkbank getrocknet. Anschließend wird der Deckel der Plastikschale aufgelegt und zugeklebt. Von 2 Keimträgern werden von jeder Verdünnungsstufe die Keimzahlen ermittelt. Dazu werden die Keimträger zerschnitten und die beimpften Abschnitte jeweils in 10 ml Verdünnungslösung + 0,1 % Tween gegeben. Die Abschnitte werden für 30 Sekunden auf dem Whirl-Mix geschüttelt. In 1ml der Spülflüssigkeit wird die KBE bestimmt und auf die KBE des Abschnittes hochgerechnet ( x 10). 12 Handelsprodukt der Firma Merck-Schuchardt. Bestell-Nr Fachverband Nahrungsmittelmaschinen und Verpackungsmaschinen, Seite 10/11

11 Anhang III Anzuchtbedingungen des Teststammes Bacillus subtilis SA 22 und Herstellung der Sporensuspension Bacillus subtilis SA 22 wird zunächst in Tryptone Soya Broth 24 Stunden bei 30 C vorkultiviert, bevor jeweils 0,1 ml dieser Vorkultur mittels Drigalskispatel auf Plate Count Agar ausgespatelt und 5 Tage bei 30 C bebrütet werden. Die mit dem Testkeim bewachsenen Petrischalen werden jeweils mit 3 ml 0,9 %iger steriler Kochsalzlösung überschichtet, wonach der Bakteriensporenrasen mit einem Drigalskispatel vorsichtig abgeschwemmt wird. Die Sporenernte von mehreren Petrischalen wird gesammelt und bei g ca. 20 Minuten zentrifugiert. Anschießend wird der Überstand dekantiert und die sedimentierten Sporen mit sterilem 0,14 m Sørensenphosphatpuffer (K 2 HPO 4 /KH 2 PO 4, ph 7) resuspendiert. Anschließend wird zweimal in gleicher Weise zentrifugiert und resuspendiert, bevor letztlich das Sporensediment in sterilem Phosphatpuffer fein suspendiert und die so erhaltene Sporensuspension 20 Minuten bei 80 C erhitzt wird, um vegetative, unversporte Zellen abzutöten (Pasteurisation). Die so erhaltene Sporensuspension kann bei 4 C ca. 3 Monate aufbewahrt werden. Die Sporenzahl sollte zwischen 10 8 und 10 9 /ml betragen. Fachverband Nahrungsmittelmaschinen und Verpackungsmaschinen, Seite 11/11