RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit Benutzerhandbuch

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1 RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit Benutzerhandbuch CE Für diagnostischen In Vitro Gebrauch. Biomatrica, Inc Oberlin Drive, Suite 120 San Diego, CA USA

2 Inhalt RNAgard Blutprodukte und Bestellinformationen 3 Kit-Inhalte 3 Lagerungsbedingungen 3 Sicherheitshinweise 4 Verwendungszweck 4 Einleitung 4 Probeentnahme und Erhaltung 5 RNA Reinigungsvorgang 5 Erforderliches Material und Equipment, welches aber nicht zur Verfügung gestellt ist 5 Wichtige Hinweise 5 Protokoll für RNA Reinigung 6 Einschräkungen der Produktverwendung 8 RNA Reinigungsverfahrenzusammenfassung 9 Erwartete Resultate Anhäng A. Stabilität der Genexpression 10 Anhäng B. Hoher RNA Gehalt und Reinheit 12 Anhäng C. Wiederholbare & reproduzierbare Reinigung der RNA 13 Fehlersuchanleitung 16 Technische Unterstützung 18 Erklärung der Symbole 19 Seite 2 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C

3 RNAgard Blutsystem-Produkte und Bestellinformation Beschreibung Anzahl Katalognummer RNAgard Blutröhrchen 50 Röhrchen CE RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit 50 Vorbereitungen CE RNAgard Blut Reagenz 100 ml CE RNAgard Blut Präzipitations-Puffer 50 Vorbereitungen CE Bestellungen können online unter via unter oder telefonisch zu Biomatrica Customer Support unter getätigt werden. RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit Inhalte RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit (50 Vorbereitungen) Katalognr. CE Bestandteil RNAgard Blut Präzipitations-Puffer Resuspension-Puffer ǂ Waschpuffer 1* Waschpuffer 2* RNase-Freie Wasserflasche DNase I, RNase-Freie; lyophilisierte Puder DNase I Puffer Steriles Wasser (DNase I Resuspension-Wasser) Anzahl 180 ml 21 ml 25 ml 15 ml 12 ml 1 X Ampulle 2 X 2.5 ml 1 ml Reinigungsmodul 50 2 ml Sammelröhrchen 2 X 100 ǂ Nicht kompatibel mit Desinfektions-Reagenzien, die Bleiche enthalten. Enthält Guanidinisothiocyanat. Siehe Seite 5 für Sicherheitshinweise. * Waschpuffer 1 und Waschpuffer 2 sind als Konzentrate geliefert. Vor dem ersten Gebrauch, mit Ethanol verdünnen (96-100%, Analytischer Reagenzgrad oder Reinheitsgrad pro analysi) gemäß der Menge, die auf der Flasche angezeigt ist. Lagerungsbedingungen Entfernen Sie die Ampulle der lyophilisierten DNase I, RNase freies lyophilisiertes Puder und lagern Sie es bei 2-8⁰ C nach Erhalt des Kits (bei Zimmertemperatur geliefert). Nach Wiederherstellung der lyophilisierten DNAse I, aliquotieren und lagern Sie die resultierende Lösung bei -20 C. Lagern Sie alle anderen RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit Bestandteile bei Zimmertemperatur (18-25 C). Nicht einfrieren. Seite 3 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C

4 Sicherheitshinweise Treffen Sie allgemeine Vorsichtsmaßnahmen im Umgang mit dem Produkt. Inhalte dieses Kits können Irritation der Augen, Atemwege und der Haut verursachen. 1. Falls unbeabsichtigte Inhalation eintritt, verschaffen Sie frische Luft und suchen Sie ärztliche Hilfe auf. 2. Im Falle von Hautkontakt, waschen Sie unverzüglich mit Wasser und Seife und spülen Sie gründlich. 3. Im Falle von Hautkontakt, spülen Sie unverzüglich mit reichlich Wasser für mindestens 15 Minuten und suchen Sie ärztliche Hilfe auf. 4. Falls unbeabsichtigtes Schlucken eintritt, suchen Sie unverzüglich ärztliche Hilfe auf. 5. Beziehen Sie sich auf die SDS im Falle von unbeabsichtigter Aufnahme oder Hautkontakt. Alle SDS Informationen sind unter erhältlich. Verwendungszweck Das RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit ist für die Reinigung von intrazellulärer RNA von menschlichen Blutproben, die in RNAgard Blutröhrchen gesammelt und erhalten werden, gedacht. Wenn in Kombination mit RNAgard Blutröhrchen als Teil des RNAgard Blutsystems benutzt, bietet das RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit hohe Erträge von reiner RNA, mit sehr niedrigen Gehalten von genomischer DNA. Die gereinigte RNA ist für RT-PCR Anwendungen, die in molekularen Diagnosetests benutzt wird, geeignet. Die Leistung des RNAgard Blutsystems wurde nur für C-FOS und IL1- Genabschriften gekennzeichnet. Der Benutzer ist für die Kennzeichnung der Leistung des RNAgard- Systems für andere Anwendungen verantwortlich. Einleitung Klinische Forschungsstudien oftmals benötigen Blutentnahmen von vielfachen geographischen Orten unter einer Vielzahl von Bedingungen. RNAgard Blutröhrchen sind konzipiert für die unverzügliche Erhaltung von intrazellulärer RNA in menschlichen Blutproben, eine effiziente Methode für die standardisierte Entnahme, Transport und Lagerung von Vollblutproben bietend. Die Unversehrtheit und die Genabschriftenlevel der RNA sind bis zu 14 Tage bei Zimmertemperatur erhalten, wenn Vollblut in RNAgard Röhrchen gelagert ist, und kann mit dem RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit einfach gereinigt werden. Seite 4 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C

5 Probeentnahme und Erhaltung RNAgard Blutröhrchen enthalten eine proprietäre chemische Erhaltungsreagenz, die Blutzellen lysiert, Nukleasen inaktiviert und RNA Synthese stoppt, somit die Level der RNA Abschriften erhaltend. Sobald RNA gereinigt ist, das RNAgard Blut RNA Reinigungs- Kit benutzend, ist die Genexpression Analyse geeignet, Technologien wie zum Beispiel RT-PCR und Expressionsarrays anwendend. RNA Reinigungsverfahren Erforderliche Materialien und Equipment, welche jedoch nicht zur Verfügung gestellt sind RNAgard Blutröhrchen (Kat. Nr. CE ) Ethanol (96-100%) Pipetten * (5 µl - 3 ml) Sterile, Aerosol-abweisende, RNase-freie Pipettenspitzen 50 ml konische Röhrchen 1.5 ml Microfug Röhrchen Vortex Mischer* Zentrifuge* - drehzahlveränderlich, geeignet um 1,000-14,000 x g zu erlangen Inkubationsschüttler* 400 rpm Wasserbad oder Wärmeblock bei 70 C * Versichern Sie, dass Geräte regelmäßig überprüft, gewartet, und kalibriert wurden gemäß der Empfehlungen des Herstellers. Wichtige Hinweise vor dem Start: Versichern Sie, dass das Blut in RNAgard Blutröhrchen gemäß den Anweisungen in dem Abschnitt Verfahren für Probenvorbereitung für die Analyse in der RNAgard Blutröhrchen Gebrauchsanweisung entnommen wurde. Erlauben Sie mindestens 2 Stunden nach der Blutentnahme um mit dem Reinigungsprozess zu beginnen. Um den RNA Ertrag zu maximieren, erlauben Sie mindestens 8-12 Stunden Lagerung bei Zimmertemperatur vor der RNA-Reinigung. Waschpuffer 1 und Waschpuffer 2 sind als Konzentrate zur Verfügung gestellt; stellen Sie diese mit den Mengen von % Ethanol, welches auf dem Flaschenetikett angegeben ist, vor dem Gebrauch wieder her. DNase I ist empfindlich für physische Denaturierung. Wenn Sie das lyophilisierte Puder wiederherstellen, mischen Sie sanft durch Umdrehen; wirbeln Sie die DNase I Lösung nicht. Versichern Sie, dass die RNAgard Blutröhrchen an Zimmertemperatur angepasst sind bevor Sie mit dem RNA Reinigungsprozess beginnen. Seite 5 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C

6 Protokoll für die RNA Reinigung 1. Invertieren Sie das RNAgard Blutröhrchen mindestens 5 Male, um korrektes Mischen zu gewährleisten, entfernen Sie dann den Verschluss und gieß Sie die Inhalte des Röhrchens in ein sauberes 50 ml konisches Röhrchen. 2. Pipettieren Sie 3 ml des RNAgard Blut Präzipitations-Puffers in ein 50 ml konisches Röhrchen, um das Gesamtvolumen auf ~12 ml zu bringen und schließen Sie den Verschluss des Röhrchens. 3. Inkubieren Sie für 15 Minuten bei Zimmertemperatur mit Schütteln ( rpm). 4. Wirbeln Sie das 50 ml konische Röhrchen feste (maximale Geschwindigkeit) für mindestens 30 Sekunden und stellen Sie sicher, dass die Lösung an die Spitze des Röhrchens wandert, um das korrekte Mischen der Inhalte zu erreichen. 5. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei x g für 30 Minuten bei Zimmertemperatur in einem Ausschwingrotor. Hinweis: Zentrifugierung kann ebenfalls bei x g für 10 Minuten in einem festwinkligen Rotor durchgeführt werden, ohne Auswirkung auf den RNA Ertrag oder die Qualität. 6. Gießen Sie die überstehende Fraktion vorsichtig ab und lassen Sie das Röhrchen umgekehrt auf absorbierendem Papier für 1-2 Minuten. Hinweis: Ein transluzent, rötliches Pellet sollte am Boden des Röhrchens sichtbar sein. 7. Tupfen Sie die verbleibenden Tropfen der Flüssigkeit von dem Rand des Röhrchens mit sauberem, absorbierendem Papier. 8. Fügen Sie 350 µl des Resuspensions-Puffers in das Röhrchen hinzu und mischen Sie 5-10 Male kräftig, um das Pellet zu resuspendieren. 9. Fügen Sie 250 µl von 100% Ethanol in das Röhrchen hinzu und mischen Sie 3-5 Male kräftig, um die Inhalte des Röhrchens zu mischen. 10. Übertragen Sie die Lösung in ein sauberes Reinigungsmodul, schließen Sie den Deckel und zentrifugieren Sie für 1 Minute bei x g. Hinweis: Benutzen Sie für jede Zentrifugierung (Schritte 10 bis 23) ein Bench Top Microfuge. 11. Verwerfen Sie das Entnahmeröhrchen und platzieren Sie das Modul in ein sauberes 2 ml Entnahmeröhrchen. 12. Fügen Sie 400 µl des Waschpuffers 1 in das Modul hinzu, schließen Sie den Deckel und zentrifugieren Sie bei x g für 1 Minute. 13. Verwerfen Sie den Durchfluss, platzieren Sie das Modul in das gleiche 2 ml Entnahmeröhrchen und zentrifugieren Sie bei x g (oder maximale geschwindigkeit) für 1 Minute, um das Modul zu trocknen. Seite 6 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C

7 14. Verwerfen Sie das Entnahmeröhrchen und platzieren Sie das Modul in ein sauberes 2 ml Entnahmeröhrchen. 15. Führen Sie DNase- Behandlung durch: a. Falls DNase I das erste Mal benutzt wird, bereiten Sie die DNase I Stammlösung zu, durch das Hinzufügen von 300 µl steriles, RNase-freies Wasser (bereitgestellt) zu dem DNase I (RNase-Frei) lyophilisierten Puder und mischen Sie sanft durch Inversion; nicht wirbeln. Aliquotieren Sie die DNase I Enzyme und lagern Sie sie bei -20 C für langfristige Lagerung. Hinweis: Der DNase I Vorrat kann bis zu dreimal eingefroren/aufgetaut werden ohne den Verlust von Aktivität. b. Bereiten Sie verdünnte DNase I Lösung vor, indem Sie 5 µl DNase I und 95 µl DNase I Puffer für jede Probe kombinieren, dann sanft durch Inversion mischen. (Fügen Sie 10% hinzu, wenn Sie Lösungen für mehrere Proben vorbereiten). c. Fügen Sie 100 µl DNase I Mischung in jedes Modul und inkubieren Sie bei Zimmertemperatur für Minuten. d. Heizen Sie das RNase-freie Wasser auf 70 C für die Elution der RNA während der DNase I Behandlung. 16. Fügen Sie 400 µl Waschpuffer 1 zu dem Modul hinzu, schließen Sie den Deckel, inkubieren Sie bei Zimmertemperatur für 30 Sekunden und zentrifugieren Sie bei x g für 1 Minute. 17. Verwerfen Sie das Entnahmeröhrchen und platzieren Sie das Modul in ein sauberes Entnahmeröhrchen. 18. Fügen Sie 350 µl Waschpuffer 2 zu dem Modul hinzu, schließen Sie den Deckel und zentrifugieren Sie bei x g für 1 Minute. 19. Wiederholen Sie Schritt 18 mit einer zweiten 350 µl Waschpuffer 2, ohne das Entnahmeröhrchen zu ändern. 20. Verwerfen Sie das Entnahmeröhrchen, platzieren Sie das Modul in ein sauberes 2 ml Entnahmeröhrchen und zentrifugieren Sie bei x g (oder maximale geschwindigkeit) für 2 Minuten, um das Modul zu trocknen. 21. Entfernen Sie das Reinigungsmodul von dem Röhrchen und platzieren Sie es in ein RNase-freies 1.5 ml Microfuge-Röhrchen (nicht im Kit vorhanden), um die RNA zu eluieren. 22. Fügen Sie 100 µl RNase-freies Wasser, vorgeheizt auf 70 C, in das Modul hinzu, schließen Sie den Deckel, und inkubieren Sie für 1 Minute bei Zimmertemperatur und zentrifugieren Sie für 1 Minute bei 6795 x g, um die RNA zu eluieren. 23. Für die maximale RNA Konzentration, fügen Sie die eluierte Lösung wieder in das Modul zurück und zentrifugieren Sie für 1 Minute bei x g. Für maximalen RNA Ertrag, wiederholen Sie Schritt 22 mit neuem 100 µl RNasefreiem Wasser. Seite 7 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C

8 Begrenzung der Produktverwendung 1. Das RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit ist nicht für die Reinigung von RNA von Blutproben, die nicht in RNAgard Blutröhrchen entnommen und gelagert sind, gekennzeichnet. 2. Das RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit ist für die Reinigung von 2.5 ml in RNAgard Blutröhrchen gesammeltem Blut optimiert. Falls die vollen 2.5 ml Blut nicht in die RNAgard Blutröhrchen entnommen wurden, kann der RNA Ertrag und die Qualität beeinträchtigt sein. 3. Das RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit ist nicht für die Reinigung von kleinen RNA Proben wie zum Beispiel mirna optimiert. Seite 8 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C

9 RNA Reinigungsverfahrenzusammenfassung Vorbereitung des RNA Pellet RNA Trockenpellet RNA Reinigung RNAguard Blut- Röhrchen mit Blutprobe Fügen Sie 350 µl Resuspensionspuffer hinzu, schütteln Sie 5-10 Male kräftig Fügen Sie 350 µl Waschpuffer 2 in einem neuen Entnahmeröhrchen hinzu, Drehen Sie es für 1 Minute bei x g Invertieren Sie 5 Mal Fügen Sie 250 µl 100% Ethanol hinzu, schütteln Sie 3-5 Male kräftig Wiederholen Sie den vorangegangenen Schritt, fügen Sie 350 µl Waschpuffer 2 hinzu, drehen Sie es für 1 Minute bei x g Übertragen Sie zu 50 ml konischem Röhrchen Übertragen Sie die Lösung in ein Reinigungsmodul, drehen Sie es für eine Minute bei x g Platzieren Sie die Säule in ein sauberes Entnahmeröhrchen, drehen Sie es für 2 Minuten bei x g (oder maximale Geschwindigkeit), um die Säule zu trocknen Fügen Sie 3 ml des Präzipatitions- Puffers hinzu Fügen Sie 400 µl Waschpuffer 1 in neuem Entnahmeröhrchen hinzu, drehen Sie es für 1 Minute bei x g Fügen Sie 100 µl RNasefreies Wasser zu der Säule hinzu, Inkubieren Sie RT für 1 Minute, Drehen Sie es 1 Minute bei x g um die RNA zu eluieren Wirbeln Sie feste für 30 Sekunden (maximale Geschwindigkeit) Drehen Sie es in einem neuen Entnahmeröhrchen für 1 Minute bei x g, (oder maximale Geschwindigkeit) um die Säule zu trocknen Geben Sie die eluierte RNA Lösung wieder in die Säule, drehen Sie es für 1 Minute bei x g, für maximalen Ertrag, wiederholen Sie die Elution mit neuem 100 µl RNA-freiem Wasser Schleudern Sie x g für 30 Minuten in einem Ausschwingrotor Fügen Sie 100 µl DNase I in einem neuen Entnahmeröhrchen hinzu, inkubieren Sie RT für Minuten Legen Sie das überstehende Trockenpellet für 2 Minuten beiseite Fügen Sie 400 µl Waschpuffer 1 hinzu, inkubieren Sie RT für 30 Sekunden, drehen Sie es für 1 Minute bei x g Figur 3: RNA Reinigungsverfahren. Schematische Sicht der RNA Reinigung von menschlichen Blutproben, die in RNAgard Blutröhrchen entnommen sind, das RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit benutzend. Seite 9 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref A

10 Anhang A: Stabilität der Genexpression Die Erhaltung von Genexpressionsmustern in Vollblut für bis zu 14 Tagen bei Zimmertemperatur wurde durch die gesamte genomische Array-Expressionsanalyse von mehreren Blutspendern bewertet. Figur 2 zeigt einen repräsentativen Vergleich von Expressionsprofilen für mehr als 47,000 Transkripte zwischen frischem Vollblut (X-Achse) und nach 3 Tagen (A) oder 14 Tagen (B) Lagerung bei Zimmertemperatur (Y-Achse). Die grünen Linien definieren die Transkripte des gelagerten Vollbluts mit Expressionlevel innerhalb einer 2-fachen Änderung relative zu frisch entnommenen Blutproben. Die Erhaltung von RNA Level durch das RNAgard Blutsystem war weiterhin gekennzeichnet durch die RT-PCR Analyse der Transkripte für die inflammatorischen Zytokinen IL-1β und C-Fos. Die RNA Level für diese beiden Gene, wurde durch die Ct Werte relativ zu dem 18S RNA Referenzgen (ΔCt) gemessen. Änderungen in den ΔCt Werten relativ zu Tag 0 Werten waren als ΔΔCt ausgedrückt. ΔCt Werte der Blutprobenlagerung sind über 14 Tage bei Zimmertemperatur erhalten worden; ΔΔCt Werte betrugen zwischen -1.0 und +1.0 (Figur 3). Ähnliche Resultate wurden für die Blutproben, die bis zu einem Monat lang bei 2-8 C gelagert wurden, oder die bei -20 C oder -80 C eingefroren wurden, erhalten (Daten sind nicht gezeigt). RN Ag ar d Bl ut Ta g 3 RN Ag ar d Bl ut Ta g 14 Kontroll-RNAgard Blut Tag 0 Kontroll-RNAgard Blut Tag 0 Figur 1: Micro Array Analyse der gesamten Transkriptomexpression in RNA von menschlichen Vollblutproben. Menschliches Blut ist in RNAgard Blutröhrchen von einem gesunden Spender entnommen worden. RNA wurde nach 0, 3 oder 14 Tagen Lagerung bei Zimmertemperatur gereinigt. Gesamte Transkriptomexpression wurde analysiert, menschliches HT12 Bead Array (Illumina Corp., San Diego, CA) benutzend, und normalisierte Transkriptmengen von Proben, gelagert für 3 (A) oder 14 (B) Tage (Y-Achse), wurden mit Transkriptmengen von frischen Vollblutproben desselben Spenders (X-Achse) verglichen. Seite 10 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref A

11 Figur 2: Analyse der IL1- und C-Fos RNA, erhalten von menschlichen Blutproben, die in RNAgard Blutröhrchen entnommen und gelagert wurden, durch RT-PCR. Blut wurde von 5 gesunden Spendern in RNAgard Blutröhrchen entnommen und bei Zimmertemperatur (18-25 C) gelagert. An den Tagen 0, 7 und 14, wurde die RNA RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit gereinigt. C-Fos und IL1-β Transkriptlevel, normalisiert zu 18S Transkripts, wurden durch RT-PCR bestimmt und als ΔCt Werte ausgedrückt. Die Änderung in ΔCt relativ zu dem Level desselben Transkripts an Tag0 Proben von demselben Spender war als ΔΔCt ausgedrückt. Seite 11 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C

12 Anhang B: Hoher RNA Ertrag und Reinheit Das RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit erlaubt die Isolation von mindestens 3 µg der RNA für mindestens 97% der Blutproben, die in RNAgard Blutröhrchen entnommen und gelagert wurden. Wie in Figur 4 gezeigt, wiederholbare hohe RNA Erträge (Figur 4, A) mit hoher Reinheit (Figur 4, B) wurden von Blutproben von denselben 8 Spendern über 2 Wochen in Blutprobenlagerung bei Zimmertemperatur, erzielt. Figur 4: Hoher RNA Ertrag und Reinheit. Blut wurde bei 8 gesunden Spendern in RNAgard Blutröhrchen entnommen und bei Zimmertemperatur (18-25 o C) gelagert. Nach 3, 7 und 15 Tagen wurde die RNA von Duplikat Blutproben je Spender gereinigt, das RNAgard Blood RNA Reinigungs-Kit benutzend. A: RNA Ertrag je Probe war durch UV Spektralfotometrie bestimmt und als Allgemeinwerte der Duplikatproben je Spender aufgezeigt. B: RNA Reinheit für alle Proben war durch UV Spektralfotometrie bestimmt (A260/A280). Seite 12 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C

13 Anhang C: Wiederholbare und Reproduzierbare Reinigung der RNA RNA Reinigung der Blutproben, die in RNAgard Blutröhrchen entnommen wurden, das RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit benutzend, ist hochgradig reproduzierbar, wie bei ähnlichen, erhaltenen RNA Erträgen desselben Blutspenders bei 3 verschiedenen Operatoren, gezeigt (Figur 5). Ähnlich zu dem RNA Ertrag, sind die hohe Reinheit und Qualität der isolierten RNA sehr reproduzierbar, wie von den A260/A280 Werten konstant zwischen 1.8 und 2.2 (Figur 6) gezeigt, ebenso wie der genomische DNA Inhalt unterhalb 0.10 % (w/w) (Figur 7), unabhängig davon welcher der 3 verschiedenen Operatoren die RNA von den Blutproben gereinigt hat. Die Reproduktivität des RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kits wurde ebenfalls durch die RT- PCR Analyse der RNA Transkript Level für C-Fos und IL1- verifiziert. Wie in Figur 8 gezeigt, sind die RNA Level beider C-Fos und IL1- Transkripte relativ zu des Kontroll 18S RNA Transkripts gleich, unabhängig von dem Operator, der die Proben verarbeitet hat. Figur 5: Reproduzierbarer RNA Ertrag. Blut wurde 8 gesunden Spendern in RNAgard Blutröhrchen entnommen und für 3 Tage bei Zimmertemperatur (18-25 o C) gelagert. RNA wurde Duplikat Blutproben je Spender, durch 3 verschiedene Operatoren, gereinigt, das RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit benutzend. Der RNA Ertrag je Probe ist durch UV Spektralfotometrie bestimmt worden und werden als Durchschnittswerte der Duplikatsproben je Spender gezeigt. Seite 13 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C

14 Figur 6: Reproduzierbare Reinheit der RNA. Blut wurde 8 gesunden Spendern in RNAgard Blutröhrchen entnommen und bei Zimmertemperatur (18-25 o C) gelagert. Nach 3 Tagen Lagerung, wurden die Proben bei 3 Operatoren verarbeitet, das RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit benutzend. Die RNA Reinheit für alle Proben wurde durch UV Spektralfotometrie bestimmt (A260/A280). Figur 7: Reproduzierbare Reinheit der RNA. Blut wurde 8 gesunden Spendern in RNAgard Blutröhrchen entnommen und bei Zimmertemperatur (18-25 o C) gelagert. Nach 3 Tagen Lagerung, wurden die Proben bei 3 Operatoren verarbeitet, das RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit benutzend. Der Prozentsatz der genomischen DNA Kontamination wurde für alle RNA Proben durch qpcr Verstärkung der RNAse P des genomischen DNA Amplikon bestimmt, relative zu der Verstärkung desselben Ziels von bekannten Inputs genomischer DNA Proben. Seite 14 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C

15 Figur 8: Kennzeichnung der C-Fos und IL1- Transkript Level durch RT-PCR Prüfung. Blut wurde 8 gesunden Spendern in RNAgard Blutröhrchen entnommen und bei Zimmertemperatur (18-25 o C) gelagert. Nach 3 Tagen Lagerung, wurden die Proben bei 3 Operatoren verarbeitet, das RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kit benutzend. C-Fos und IL1-β Transkript Level, normalisiert zu 18S Transkripten wurden durch RT-PCR, in Proben bei Operator B und Operator C verarbeitet, bestimmt und relativ zu Level desselben Transkripts gezeigt, in Proben desselben Spenders durch Operator A verarbeitet, ausgedrückt als ΔΔCt. Seite 15 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C

16 Fehlersuchanleitung Diese Fehlersuchanleitung enthält Vorschläge für die Aufklärung der folgenden potentiellen Situationen. Biomatrica s Wissenschaftler des Technischen Dienstes sind verfügbar, um Fragen zu den Informationen und Protokollen dieses Benutzerhandbuchs zu beantworten (Siehe S. 16 für Kontaktinformation oder besuchen Sie Situation Kommentar Grund/Vorschlag Das Blut sieht geronnen oder gefällt aus nach Lagerung oder Versand. RNAgard Blutformulation denaturiert Proteine, welche im Zeitverlauf fällen. Die Fällung beeinflusst nicht die RNA stabilisierenden Eigenschaften der Formulation. Versichern Sie dass die Probe vor dem RNA Reinigungsverfahren gemischt ist, durch das Invertieren des Röhrchens für 3-5 Male. Geringer RNA Ertrag Isolierte RNA ist unrein Mögliche Gründe: - Geringe Konzentration von Leukozyten in der Blutprobe. - RNAgard Blutröhrchenprobe ist nicht ausreichend gemischt, bevor der RNA Reinigung. - Wahl des Blutentnahmeröhrchens. Mögliche Gründe: - Wahl des Blutentnahmeröhrchens - Inaktivierung der DNAse I, welche zu genomischer DNA Kontamination führt. - Leukozyten -Konzentrationen können 10-fach zwischen Spendern variieren, resultierend in einer Vielfalt von RNA Erträgen. - Invertieren Sie das RNAgard Blutröhrchen 3-5 Male unverzüglich vor der RNA Isolation. - RNA Isolation mit RNAgard Blut RNA Reinigungs- Kit ist mit dem RNAgard Blutröhrchen optimiert worden. Wir garantieren nicht die Qualität von RNA, welche in anderen Blutentnahmeröhrchen stabilisiert wurde. - RNA Isolation von RNAgard Blutröhrchen wurde mit dem RNAgard Blut RNA Reinigungs- Kit optimiert. Reinigung der RNA, die mit anderen Produkten in RNAgard Blutröhrchen entnommen wurde, wird nicht empfohlen. - Mischen Sie sanft nach der Wiederherstellung der DNAse, nicht wirbeln. Seite 16 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C

17 - Verlust der DNAse I Aktivität, was zu genomischer DNA Kontamination führt. - Begrenzen Sie den Gefrier/Auftau Zyklus auf drei Male, nach der Wiederherstellung der DNAse. Seite 17 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C

18 Technische Unterstützung Biomatrica, Inc. setzt sich dafür ein, herausragende technische Unterstützung zu leisten. Biomatrica s Technischer Kundendienst ist mit erfahrenen Wissenschaftlern besetzt, mit praktischer Erfahrung in Molekularbiologie und den Umgang mit Biomatrica s Produkten. Bitte treten Sie mit Biomatrica direkt in Kontakt, mit jeglichen Fragen bezüglich des RNAgard Blut RNA Reinigungs-Kits. Technischer Hilfsdienst Telefon (US): Web: support@biomatrica.com Seite 18 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C

19 Glossar der harmonisierten Symbole Artikelnummer Nicht für den Wiedergebrauch geeignet Chargennummer Mindesthaltbarkeitsdatum. Vor dem Ende des angegebenen Monats benutzen Temperaturbegrenzung Von Sonnenlicht fernhalten Konsultieren Sie die Gebrauchsanweisung Gefahr Hersteller Sterilisation Bestrahlung nutzend Sterilisation durch eine aseptische Methode Autorisierter Repräsentant in der Europäischen Gemeinschaft RNAgard ist eine gesetzlich geschützte Marke von Biomatrica Biomatrica Inc. Biomatrica Inc Oberlin Drive, #120 San Diego, CA 92121, U.S.A. Seite 19 von 19 Dok. Nr. 8301, Ref C