HLA-B27 Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Konjugierter Monoklonaler Antikörper Best.-Nr. B27F50X (10 µl/test)

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1 21001 Kittridge Street, Canoga Park, CA , USA Tel: +1 (818) Fax: +1 (818) P R O D U K T I N F O R M A T I O N HLA-B27 Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Konjugierter Monoklonaler Antikörper Best.-Nr. B27F50X (10 µl/test) Für die In-vitro-Diagnostik VERWENDUNGSZWECK Ein qualitatives Vollblutverfahren für direkte Immunfluoreszenz-Färbung von HLA-B27 Oberflächenantigenen mit durchflusszytometrischer Analyse. ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG HLA-B27 FITC-konjugierter monoklonaler Antikörper reagiert spezifisch auf B27 Human-Leukozyten-Antigen. Das Reagenz dient zur Verwendung bei der Immunfärbung humaner Lymphozyten in Vollblut. Die Fluoreszenz-Intensität von Lymphozyten kann auf einem Flowzytometer im Anschluss an die Lysierung und Trennung von Erythrozyten analysiert werden. HLA-B27 steht nachweislich in engem Zusammenhang mit ankylosierender Spondylitis (M. Bechterew). Die Testung auf das Vorhandensein von HLA-B27 Antigen bei einem Patienten wird für die Bestätigung der Diagnose von M. Bechterew verwendet. PRINZIP HLA-B27 FITC-konjugierter monoklonaler Antikörper weist Zellen nach, die das B27 Antigen auf ihren Membranen tragen. Vollblut wird zuerst mit dem HLA-B27 FITC-konjugierten monoklonalen Antikörper gefärbt, gefolgt von Lyse der roten Blutkörperchen und Fixation der weißen Blutkörperchen mit Formaldehyd. Nach Entfernen der Rückstände wird eine durchflusszytometrische Analyse auf weiße Blutkörperchen durchgeführt. REAGENZIEN A. Identifizierung 1. Spezifität: HLA-B27 2. Klon: FD705-9E1E10 wird durch die Hybridisierung von Maus-P3X63Ag8.653-Myelomzellen mit Milzzellen einer CB6F1 Maus, die mit einer HLA-B27-positiven humanen Zelllinie immunisiert ist, hergestellt. 2 Der Antikörper wird anhand von Protein- G-Affinitäts-Chromatographie von Aszitesflüssigkeiten gereinigt. 3. IgG-Ketten-Zusammensetzung: Maus-IgG2b schwere Kette und Kappa leichte Kette. B. Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen 1. Für die In-vitro-Diagnostik. 2. Warnung: Alle Blutprodukte sind als potenziell infektiöses Material zu behandeln. Das Material, aus dem dieses Produkt hergestellt ist, wurde bei Tests im Rahmen der derzeit von der FDA auferlegten Tests als negativ befunden. Es kann jedoch keine Testmethode mit absoluter Sicherheit garantieren, dass aus menschlichem Blut hergestellte Produkte keine infektiösen Substanzen übertragen. 3. Warnung: Dieses Reagenz enthält 0,1 % Natriumazid, das unter sauren Bedingungen die hochtoxische Verbindung Hydrazonsäure hervorbringt. Natriumazidhaltige Reagenzien sollten vor der Entsorgung in laufendem Wasser verdünnt werden. Dies empfiehlt sich, um Ablagerungen in Abflussrohren zu vermeiden, die zu Explosionen führen können. 4. Warnung: Formaldehyd ist toxisch und allergen sowie karzinogenverdächtig. Formaldehyd wird in Kalifornien als Karzinogen eingestuft. Kontakt mit Augen, Haut und Kleidung vermeiden. 5. Vorsicht: Reagenz nicht verwenden, wenn Präzipitat beobachtet wird. D. Lagerungshinweise Im Dunkeln bei 2-5 C lagern. Vor dem auf der Verpackung aufgedruckten Verfallsdatum verwenden. E. Hinweise auf Instabilität Nicht verwenden, wenn Präzipitat beobachtet wird. Rev 2A: October 2003 Seite 1 von 5

2 INSTRUMENTELLE ANFORDERUNGEN FACScan oder Äquivalent. PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG Die Blutprobe sollte in ein EDTA (K3) Vacutainer Blutprobenröhrchen gewonnen und innerhalb von drei Tagen analysiert werden. Es können jedoch auch ACD und Natriumheparin verwendet werden. VERFAHREN A. Mitgelieferte Materialien HLA-B27 FITC-konjugierter monoklonaler Antikörper. B. Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien 1. FACS Brand Lysing Solution 10X Konzentrat (Becton Dickinson, Best.-Nr ) oder Äquivalent. 2. Phosphate Buffered Saline (PBS) (Irvine Scientific, Best.-Nr. 9242) oder Äquivalent. 3. Fixierlösung: PBS mit 0,5 % Formaldehyd; 1,35 ml 37 % Formaldehyd zu 100 ml PBS hinzufügen. 4. Negativkontrolle: Maus-IgG2b FITC-konjugierter monoklonaler Antikörper. (OLI Best.-Nr. G2BF50X) 5. Positivkontrolle: HLA-Klasse-I FITC-konjugierter monoklonaler Antikörper. (OLI Best.-Nr. HLA1F50X) C. Arbeitsanleitung. Siehe GEBRAUCHSANWEISUNG in Kästchen oben. GEBRAUCHSANWEISUNG 1. Um einen Volumenverlust zu vermeiden, Phiole vor dem Öffnen ein paar Sekunden lang in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren (Beim Versand kann sich Flüssigkeit im Deckel ansammeln) µl Vollblutprobe in ein 12x75 mm Röhrchen pipettieren µl HLA-B27 FITC-konjugierten monoklonalen Antikörper in das Röhrchen pipettieren und unter vorsichtigem Vortexen mischen. 4. Röhrchen im Dunkeln bei 2 5 C 15 Minuten unter leichtem Drehen inkubieren X Lyse-Lösung 1:10 mit glas-destilliertem Wasser verdünnen. 3 ml 1X Lysepuffer in das Röhrchen geben. 6. Vortexen und das Röhrchen im Dunkeln bei Zimmertemperatur 10 Minuten lang inkubieren. 7. Das Röhrchen bei 300 g 5 Minuten lang zentrifugieren. 8. Den Überstand aspirieren. 9. Das Pellet in 2 ml PBS resuspendieren und das Röhrchen vortexen. 10. Das Röhrchen bei 300 g 5 Minuten lang zentrifugieren. 11. Den Überstand aspirieren. 12. Das Pellet in 0,5 ml Fixierlösung resuspendieren. Die Zellen sind zur sofortigen durchflusszytometrischen Analyse bereit, oder sie können im Dunkeln bei 2-5 C für bis zu 24 Stunden vor der Analyse gelagert werden. GRENZEN DES VERFAHRENS A. EDTA ist das bevorzugte Antikoagulans. Es können jedoch auch ACD und Natriumheparin verwendet werden. B. Sterile Blutproben sollten bei Raumtemperatur aufbewahrt und innerhalb von drei Tagen nach der Blutentnahme analysiert werden. C. Das empfohlene Volumen der Reagenzien basiert auf Untersuchungen von normalem menschlichem Blut. D. Labors, die ein anderes Verfahren und/oder Instrument als hier angegeben verwenden, müssen das für jede Probe erforderliche Volumen der Reagenzien für optimale Ergebnisse anpassen. DATENERFASSUNG A. Das Flowzytometer täglich gemäß den vom Hersteller empfohlenen Einschaltverfahren abgleichen und eine Qualitätskontrolle durchführen. B. Erstanwender sollten mindestens 5 bekannte HLAB27-positive und 10 bekannte HLA-B27-negative Proben auf dem Flowzytometer testen, um den Bereich des gesteuerten Höchstkanals und des durchschnittlichen Kanals für B27-positive und -negative Phänotypen zu etablieren. C. HLA-B27 Positiv- und Negativkontrollen sollten täglich vor der Durchführung der Probenanalyse durchlaufen. Wenn sich die Kontrollen außerhalb des Bereichs befinden, neu abgleichen und eine Qualitätskontrolle des Flowzytometers durchführen. Die bekannt positive Kontrolle kann von einer frischen Blutentnahme stammen oder aus einem Pool kryo-konservierter Lymphozyten aliquotiert sein, die gemeinsam mit den Testproben aufgetaut und gefärbt werden. Werden große Mengen an Proben analysiert ist es ratsam, eine Qualitätskontrolle häufiger durchzuführen. Es wird empfohlen die Fluoreszenz der Negativpopulationen auf zwischen Kanal 10 und 20 anzupassen. D. Eine grüne Fluoreszenz für Ereignisse für jede Probe nehmen. E. Um den Lymphozyten-Bereich herum messen und Höchstkanal und Durchschnittskanal (Abb. 1, 2 und 3) ablesen. F. HLA-B27-Phänotyp auf Grundlage der etablierten Kriterien zuweisen. Rev 2A: 09/29/99 Seite 2 von 5

3 ERWARTETE WERTE A. HLA-B27-positive Proben werden, basierend auf einer in unserem Labor durchgeführten Studie unter Verwendung eines Flowzytometers der Marke FACS, einen gesteuerten Durchschnittskanal von > 70 haben und HLA-B27-negative Proben einen gesteuerten Durchschnittskanal von < 40. Die erwarteten Werte können je nach den Testbedingungen und der Kalibrierung des Flowzytometers im jeweiligen Labor abweichen. Jedes Labor sollte den Normalbereich für HLA-B28-positive Zellen und HLA-B27- negative Zellen unter seinen eigenen Testbedingungen für jeden Probenstapel etablieren. B. Die meisten Proben, die für die Messung der Durchschnittskanalwerte verwendet wurden, stammen von Spendern der kaukasischen Rasse. Der Wertebereich kann für Proben von Spendern anderer Rassen anders ausfallen. C. Die meisten getesteten Untertypen (B27-01, 02, 03, 04, 05, 06, 07 und 09) zeigten positive Reaktionen; B2708 zeigte jedoch negative Reaktionen. Im Gegensatz zu den meisten B27 Untertypen, die sich serologisch wie Bw4 verhalten, steht B2708 mit Bw6 in Verbindung. D. Bestimmte Proben mit B44, B57 können einen höheren Hintergrund erzeugen. Daher sollten ein paar Proben mit diesen Typisierungen für die anfängliche Etablierung der Positiv- und Negativbereiche eingeschlossen werden. E. Einzelne Chargen B27 FITC können eine unterschiedliche Durchschnittskanalverschiebung aufweisen. Daher muss der Positiv-/Negativ-Cutoff evtl. entsprechend der Leistung der jeweiligen Charge angepasst werden. LITERATURHINWEISE 1. HLA and Disease Associations, Eds. Tiwari, JL and Terasaki, PI. Springer-Verlag, New York, Pei, R, et al. A monospecific HLA-B27 fluorescein isothiocyanate-conjugated monoclonal antibody for rapid, simple and accurate HLA-B27 typing. Tissue Antigens, 41: , NCCLS Tentative Standard. Leukocyte Differential Counting. Publication Number H20-T, NCCLS Vol. 4, No. 11, Ward, AM and Nikaein, A. Comparison of monoclonal antibodies for flow cytometric analysis of HLA-B27 antigen. Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 22:65-69, IN DIESEM DOKUMENT VERWENDETE ABKÜRZUNGEN ACD Säurezitratdextrose CV Variationskoeffizient EDTA Äthylendiaminetetraessigsäure FITC Fluorescein-Isothiocyanat FSC Vorwärtsstreuung HLA Human-Leukozyten-Antigen PkChl Höchstkanal SD Standardabweichung SSC Seitenstreuung IN DIESEM DOKUMENT VERWENDETE WARENZEICHEN FACS Eingetragenes Warenzeichen von Becton-Dickinson. Vacutainer Eingetragenes Warenzeichen von Becton-Dickinson. BEVOLLMÄCHTIGTER VERTRETER FÜR EUROPA MDSS GmbH, Burckhardstrasse 1, D-30163, Hannover, Germany, Rev 2A: 09/29/99 Seite 3 von 5

4 REFERENZHISTOGRAMME UND -PUNKTEDIAGRAMME B27(+) und B27(-)-Proben Histogramme (Gemessen) Abb. 1. Punktediagramm (FSC vs. SSC) stellt lysiertes Vollblut dar (Lymphozyt gesteuert). Abb. 2. B27(+)-Probe FL-1-Histogramm und -Statistiken (gesteuert). Abb. 3. B27(+)-Probe FL-1-Histogramm und -Statistiken (gesteuert). Beispiel-Punktediagramm für lysiertes und nicht-lysiertes Blut Abb. 4a. Lysiertes Blut Abb. 4b. Nicht lysiertes Blut Abb. 4c. Teilweise lysiertes Blut. Abb. 5. Teilweise lysierte B27(+)-Probe FL-1-Histogramm und -Statistiken (gesteuert). Rev 2A: 09/29/99 Seite 4 von 5

5 PROBLEMBESEITIGUNG Problem Mögliche Ursachen Lösung 1. Abnormales Punktediagrammmuster a. FACS-Parameter sind nicht richtig eingestellt. a. Sicherstellen, dass die FACS- Parameter richtig sind. Dies kann unter Verwendung irgendeines frischen Vollblutes erfolgen. b. Das Vollblut wurde nicht gut lysiert. b. Den Lysepuffer und die Lysebedingungen prüfen. Wenn korrekter Lysepuffer und bedingungen verwendet wurden: Bei der nicht-lysierten Probe die Zellen nach unten zentrifugieren und das Lyseverfahren wiederholen. Die Menge an Lysepuffer auf 4 ml erhöhen. Die Lyse-Inkubationstemperatur auf 37 C erhöhen. Die Lyse-Inkubationszeit auf 20 Minuten erhöhen. 2. Niedriges Signal der B27-positiven Proben 3. Hoher Hintergrund der B27-positiven Proben. a. Das Flowzytometer muss abgeglichen werden. b. Das Vollblut wurde evtl. nicht gut lysiert. c. Das Blut war nicht gut mit dem Antikörper gemischt. a. Das Vollblut wurde evtl. nicht gut lysiert. b. Die Antikörperinkubationszeit kann über 15 Minuten liegen. c. Die FITC-Antikörperkonzentration kann über dem empfohlenen Wert liegen. d. Die für den Test verwendete Antikörpermenge lag höher als der empfohlene Wert. a. Das Instrument neu abgleichen. b. Das Punktediagramm für die Probe prüfen. Wenn es abnormal erscheint oder das Histogramm zwei Spitzen aufweist, die Probe nochmals lysieren. Siehe 1b in der Tabelle oben. c. Sicherstellen, dass das Blut gut mit dem Antikörper gemischt ist. a. Siehe Abhilfe 1b oben. b. 15 Minuten lang inkubieren. c. FITC-Antikörperkonzentration prüfen. d. Menge des verwendeten Antikörpers prüfen. Rev 2A: 09/29/99 Seite 5 von 5