EXPRESSION DES ÖSTROGENREZEPTORS α UND AMPLIFIKATION DES ESR1-GENS BEI MESENCHYMALEN NEOPLASIEN DISSERTATION

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1 Institut für Pathologie Universität Hamburg Prof. Dr. med. G. Sauter EXPRESSION DES ÖSTROGENREZEPTORS α UND AMPLIFIKATION DES ESR-GENS BEI MESENCHYMALEN NEOPLASIEN DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg vorgelegt von Sylvia Giese geboren in Potsdam Hamburg 202

2 Angenommen vom Fachbereich Medizin der Universität Hamburg am: 27. Januar 202 Veröffentlicht mit Genehmigung des Fachbereichs Medizin der Universität Hamburg Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende: Prof. Dr. Guido Sauter Prüfungsausschuss: 2. Gutachter/in: Prof. Dr. Fritz Jänicke Prüfungsausschuss: 3. Gutachter/in: PD Dr. Ronald Simon -2-

3 INHALTSVERZEICHNIS EINLEITUNG. Mesenchymale Neoplasien.. Epidemiologie..2 Ätiologie..3 Staging und Grading..4 Therapie..5 Leiomyom..6 Leiomyosarkom..7 Gastrointestinaler Stromatumor..8 Liposarkom.2 Der Östrogenrezeptor.3 Genetische Veränderungen und Kanzerogenese.4 Bedeutung des Östrogenrezeptors in der Kanzerogenese.5 Östrogenrezeptor und mesenchymale Neoplasien.6 Ziele der Arbeit MATERIAL UND METHODEN 2. Zusammensetzung des Arrays: Patienten-/ Tumorkollektiv 2.2 Befunde/ Histologie-Review 2.3 Herstellung des Tissue-Micro-Arrays 2.4 Immunhistochemie (IHC) 2.5 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) 2.6 Auswertung 2.6. Immunhistochemie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung 2.7 Statistik ERGEBNISSE 3. Allgemein 3.2 Technische Probleme und Auswertbarkeit 3.3 Primärtumoren 3.3. Immunhistochemie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung Tumorverhalten Differenzierungsgrad Geschlecht Lokalisation Tumorgröße 3.4 Rezidive 3.5 Leiomyom 3.6 Leiomyosarkom 3.6. Amplifikationen bei Leiomyosarkomen 3.7 Gastrointestinaler Stromatumor 3.8 Liposarkom 3.8. Amplifikationen bei Liposarkomen 3.9 Immunhistochemie und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

4 4 DISKUSSION 4. Proteinebene 4.. Östrogenrezeptorexpression und histogenetischer Ursprung 4..2 Östrogenrezeptorexpression bei Leiomyomen 4..3 Östrogenrezeptorexpression bei Leiomyosarkomen 4..4 Östrogenrezeptorexpression bei Gastrointestinalen Stromatumoren 4..5 Östrogenrezeptorexpression bei Liposarkomen 4..6 Östrogenrezeptorexpression und Geschlecht 4..7 Mesenchymale Neoplasien und Östrogeneinfluss 4..8 Mesenchymale Neoplasien in Zusammenhang mit Hormontherapien 4..9 Östrogenrezeptorexpression und Prognose 4.2 Genebene 4.3 Therapieansätze 4.3. Tamoxifen Therapieversuche bei mesenchymalen Neoplasien 4.4 Methode ZUSAMMENFASSUNG 77 6 LITERATURVERZEICHNIS 79 7 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 89 8 TABELLENVERZEICHNIS 90 9 DANKSAGUNG 9 0 CURRICULUM VITAE 92 ERKLÄRUNG

5 EINLEITUNG. MESENCHYMALE NEOPLASIEN Weichgewebstumoren (Soft Tissue Tumours) sind im Allgemeinen Neoplasien verbindender Gewebe. Sie bilden eine Gruppe heterogener Tumoren, die benigne, maligne und intermediär maligne (Borderline-Tumoren) Neoplasien beinhaltet, 2. Benigne Tumoren zeigen eine große Ähnlichkeit mit gesundem Gewebe, wohingegen maligne mesenchymale Neoplasien (Sarkome) je nach Differenzierung unterschiedlich stark normalen Zellen gleichen. Es gibt verschiedene Klassifizierungssysteme; die gebräuchlichsten, nach World Health Organization sowie Enzinger & Weiss, erfolgen nach dem histologischen Zelltyp, dem der Weichgewebstumor ähnelt in: adipozytäre Tumoren, fibroblastische/ myofibroblastische Tumoren, fibrohistiozytäre Tumoren, Tumoren der glatten perivaskuläre Tumoren der Tumoren, peripheren vaskuläre Tumoren, Nervenscheiden, so genannte und Skelettmuskulatur, chondro-ossäre periphere Tumoren, neuroektodermale Tumoren sowie solche unklarer Differenzierung EPIDEMIOLOGIE Der größte Anteil von Weichgewebstumoren ist benigne 3. Dessen Inzidenz lässt sich nicht genau feststellen, da gutartige Tumoren oftmals keiner chirurgischen Exzision unterliegen und in Krebsregistern nicht eingeschlossen sind, 2. Vermutlich liegt das Verhältnis benigner zu maligner Weichgewebstumoren bei 00 : -3. Maligne Weichgewebstumoren sind relativ selten im Vergleich zu anderen bösartigen Neoplasien wie beispielsweise Karzinomen und machen weniger als % dieser aus 2, 3. Die jährliche Inzidenz maligner mesenchymaler Neoplasien liegt bei ungefähr 3-4/ Einwohner (Europa, USA), 3. Einige Entitäten sind gehäuft bei Männern (wie zum Beispiel synoviales Sarkom, nasopharyngeales Angiofibrom), andere wiederum bevorzugt bei -5-

6 Frauen (beispielsweise Leiomyosarkome, Haemangioperizytom) nachweisbar, 2. Mesenchymale Tumoren betreffen alle Altersgruppen, jedoch ist die Mehrzahl der Sarkome bei Erwachsen zu finden, das mittlere Alter beträgt 65 Jahre Spezielle Tumoren treten allerdings vorherrschend im -3. Kindesalter (Neuroblastom, embryonales Rhabdomyosarkom u. a.) oder bei Jugendlichen (synoviales Sarkom, alveolares Rhabdomyosarkom u. a.) auf. Benigne Weichgewebstumoren liegen meist oberflächlich - dermal oder subkutan - (99%) und sind häufig kleiner als 5 cm (95%) 3. Die häufigsten Subentitäten sind Lipome (33%), fibrohistiozytäre und fibröse Tumoren (33%), dann folgen vaskuläre (0%) und Nervenscheidentumoren (5%) 3. Sarkome sind zu 75% in den Extremitäten lokalisiert und zu jeweils 0% am Rumpf oder retroperitoneal 3. Sie liegen zu zwei Drittel im tiefen Gewebe, der 3 mittlere Durchmesser beträgt hier 9 cm. Nur zu einem Drittel sind sie oberflächlich mit einem mittleren Durchmesser von 5 cm zu finden 3. Drei Viertel aller Sarkome sind Liposarkome, Leiomyosarkome, pleomorphe Sarkome (ehemals maligne fibröse Histiozytome undifferenzierte 4, 5 ), synoviale Sarkome und maligne periphere Nervenscheidentumoren. Drei Viertel sind hochmaligne (G2-3) ÄTIOLOGIE Die Ätiologie von malignen Weichgewebstumoren ist relativ wenig verstanden im Vergleich zu anderen malignen Erkrankungen (wie beispielsweise Lungenkarzinomen), 2. Zu möglichen ursächlichen Faktoren der Kanzerogenese bei Sarkomen zählen unter anderem ionisierende Strahlung (Fibrosarkom, Angiosarkom, peripherer Nervenscheidentumor u. a.), bestimmte onkogenetische Viren (humanes Herpesvirus 8: Kaposi Sarkom, Epstein-Barr Virus: Leiomyosarkom) sowie Chemikalien, 2. Immundefizienz oder therapeutische Immunsuppression werden in Zusammenhang mit dem Auftreten von Sarkomen gebracht 2. Einige Weichgewebstumoren entstehen auch im Rahmen syndromaler, -6-

7 genetischer Erkrankungen wie zum Beispiel der Neurofibromatose Typ (Neurofibrom, maligner peripherer Nervenscheidentumor) oder der familiären adenomatösen Polypose (desmoide Fibromatose) -3. Es wird davon ausgegangen, Weichgewebstumoren allgemein dass nicht sich aus maligne deren Formen benignen von Varianten entwickeln, sondern de novo entstehen 2, 3. Sarkome sind in aller Regel genetisch instabile Tumoren. Bei etwa einem Drittel aller Sarkome sind spezifische genetische Alterationen zu finden 6. Translokationen sind ein häufiges Phänomen wie beispielsweise bei synovialen Sarkomen (t(x;8)(p;q)), bei primitiven neuroektodermalen Tumoren (t(;22)(q24;q2) und t(2;22)(q22q2)) Fibrosarkom (t(2;5)(p3;q25)), 6, 7 oder auch beim kongenitalen. Die durch Translokation entstehenden Fusionsgene involvieren oft Transkriptionsfaktoren, 6. Des Weiteren kann es zur spezifischen Mutation von Onkogenen kommen wie zum Beispiel c-kit bei gastrointestinalen Stromatumoren 6. Diese charakteristischen Merkmale einer Entität erlauben eine bessere Differentialdiagnose und Klassifikation der Weichgewebstumoren sowie zum Teil prognostische Aussagen 6. Bei zirka zwei Drittel aller Sarkome konnten bislang keine spezifischen wiederkehrenden genetischen Alterationen nachgewiesen werden 6. Sarkome weisen häufig vielzählige nummerische Chromosomenaberrationen (darunter Genkopienzahlverluste und -gewinne) auf 6. Die meisten adulten Spindelzellund pleomorphen Sarkome zählen zu dieser Gruppe 6. Keine konstante Korrelation dieser Genveränderungen mit klinisch - pathologischen Parametern konnte aufgezeigt werden 6. Verschiedene Amplifikationen wurden beschrieben wie beispielsweise die der Gene MYC oder der 2q3-5 Region (welche die Gene GLI, MDM2, CHOP, CDK4, SAS und HMGIC beinhaltet) sowie anderer genetischer Regionen, dessen Zielgene bislang unbekannt sind,

8 ..3 STAGING UND GRADING Staging und Grading von malignen Weichgewebstumoren sind essentiell für die Wahl einer geeigneten Therapie sowie deren Prognose und darüber hinaus für wissenschaftliche Untersuchungen. Das Staging von Sarkomen basiert sowohl auf histologischen als auch klinischen Informationen. Gemäß American Joint Committee on Cancer (AJCC) und Union Internationale Contre le Cancer (UICC) beinhaltet die TNM Klassifizierung den histologischen Malignitätsgrad, Tumorgröße und -tiefe, regionalen Lymphknotenstatus sowie Fernmetastasen -3. Das Grading betrachtet histologische Parameter und ermöglicht Aussagen über den Malignitätsgrad des Tumors 2, 3. Insbesondere die zelluläre Differenzierung, Anzahl der Mitosen und Tumornekrosen spielen hier eine Rolle (Fédération Nationale des Centres de Lutte Contre le Cancer - FNCLCC) -3. Es erfolgt eine Unterteilung der malignen Weichgewebstumoren nach dem histologischen Malignitätsgrad in gut differenziert (low grade Sarkome) und schlecht differenziert (high grade Sarkome), um das Risiko von Rezidiven und Metastasen abzuschätzen 2. Low grade Sarkome sind lokal aggressiv, neigen zu Lokalrezidiven, haben jedoch ein eher niedriges Metastasierungsrisiko und daher eine eher gute Prognose. Die Therapie ist in erster Linie chirurgisch, sofern möglich. High grade Sarkome hingegen tendieren sowohl zur lokalen Rekurrenz als auch zu Metastasen, so dass die Therapie chirurgisch und/oder durch Bestrahlung sowie zytostatischer Behandlung erfolgt. Prognostische Parameter mit statistischer Relevanz sind bei Sarkomen Größe, histologischer Malignitätsgrad sowie Staging des Tumors und tumorfreie Resektionsränder 8, 9. Weitere prognostische Faktoren sind Lokalisation des Tumors sowie Alter, Geschlecht, Rasse des Patienten, die voneinander unabhängig mit der Überlebenszeit assoziieren

9 ..4 THERAPIE Die Ansprechraten von Zytostatika sind insgesamt gering (Anthrazykline, Ifosfamid 6-36%, andere 0-20%) und zahlreiche Studien zeigen keinen gesicherten Zusammenhang Radiotherapie und Überleben zwischen 7, 8, 0 zytostatischer Behandlung oder. Lediglich Rhabdomyosarkome und primitive neuroektodermale Tumoren des Weichgewebes reagieren gut auf eine zytostatische Behandlung (Vincristin, Etoposid, Actinomycin D), bei denen diese als Standardtherapie gilt 9, 0. Die Wahl der Therapie ist abhängig vom histologischen Subtyp sowie der anatomischen Lokalisation 7, 8. Die Behandlungsoptionen insbesondere für metastasierte Sarkome sind schlecht. Die Therapie der Wahl von Sarkomen mit statistisch signifikantem Vorteil hinsichtlich Überlebenszeit besteht in erster Linie in der chirurgischen Exzision mit tumorfreien Resektionsrändern (R0 - Resektion) 7, 8, 0. Die klinische Bedeutung neuerer Therapieformen ist bislang größtenteils noch unklar. In Bezug auf neuere, spezifische Therapieansätze ist es hilfreich, Zielgene und -proteine in Schlüsselpositionen zu identifizieren 7,. Denn je spezifischer der Angriffspunkt, seine Prävalenz, seine unabdingbare Rolle für das Zellüberleben und seine Aktivität in den Tumorzellen erforscht ist, desto wahrscheinlicher ist es, eine geeignete Behandlung zu finden und eine Aussage über deren Effektivität zu treffen 7. So konnte für gastrointestinale Stromatumoren (GIST) solch ein Angriffspunkt gefunden werden. Hierbei handelt es sich um die mutierte Tyrosin-Kinase c-kit, deren pathologische Aktivität mittels Imantinibmesylat (STI57/ Glivec) inhibiert, 7, 0 und dadurch das autonome Tumorwachstum gehemmt wird. Erste Resultate zeigen Ansprechraten von 60-70% und dass die Therapie zu einem verlängerten rezidivfreien Intervall sowie ebenfalls bei metastatischem Stadium zu einer besseren Prognose durch ein verlängertes krankheitsfreies Intervall führt 7, 2-4. Die Ein-Jahres-Überlebensrate bei fortgeschrittenem Krankheitsbild lag vor Imatinib bei etwa 35% und konnte jetzt bis auf 90% angehoben werden dank auf ursächliche molekulare Anomalien zielender Therapie Somit konnte

10 bei GISTs im c-kit und dessen Sensibilität für Imatinib ein therapeutisches Schlüsselelement gefunden werden. Molekulare Analysen können Informationen liefern, die sowohl für das Verständnis der Pathogenese bedeutend sind als auch diagnostische und prognostische Relevanz haben. Im Folgenden werden die in der durchgeführten Untersuchung am häufigsten repräsentierten Entitäten kurz vorgestellt...5 LEIOMYOME Leiomyome haben große Ähnlichkeit mit ihrem Ursprungsgewebe, der glatten Muskulatur. Sie sind der häufigste gynäkologische Tumor der Frau im reproduktiven Alter 5. Die häufigste Lokalisation dieser gutartigen Tumore ist der weibliche Genitaltrakt, insbesondere der Uterus, 2. Weitere mögliche Entstehungsorte sind retroperitoneal, peritoneal, im tiefen Weichgewebe, gastrointestinal, vaskulär und dermal, 2. Es ist bekannt, dass auch bei Leiomyomen chromosomale Veränderungen auftreten können 6. Die Therapie besteht in der chirurgischen Resektion, sofern anatomisch bedingt durchführbar 3. Lokale Rezidive nach Entfernung sind möglich LEIOMYOSARKOME Das maligne Pendant der Leiomyome sind Leiomyosarkome. Sie sind histologisch recht ähnlich in Bezug auf ihr Ursprungsgewebe, unterscheiden sich jedoch klinisch - pathologisch erheblich von Leiomyomen. Vom diagnostischen und therapeutischen Standpunkt aus haben Leiomyosarkome trotz ihrer relativen Seltenheit eine große klinische Bedeutung - 0 -

11 aufgrund ihrer unvorhersehbaren Rekurrenz sowie ihrer Möglichkeiten zur Metastasierung. Sie stellen 5-0% der Sarkome dar 2, sind jedoch die häufigsten malignen uterinen Tumoren nicht-epithelialen Ursprungs mesenchymalen Tumoren der Blutgefäße 5 3, die dominierenden malignen und häufige retroperitoneale Sarkome 3. Insbesondere die Differentialdiagnose gegenüber Leiomyomen ist wichtig hinsichtlich therapeutischer Konsequenzen. Leiomyosarkome treten in Abhängigkeit von der Lokalisation häufiger bei Frauen auf (insbesondere uterin, retroperitoneal, vaskulär) Proliferation stehen in Zusammenhang 2, 3 (Schwangerschaft, Östrogenstimulation) mit 2, 3, Wachstum und hormonellem Einfluss. Das Prädilektionsalter ist das 50. bis 60. Lebensjahr 2. Sie werden nach Lokalisation eingeteilt, da sie sich hinsichtlich Klinik und Biologie unterscheiden, 2. Häufig treten sie uterin, retroperitoneal oder intraabdominell auf, andere mögliche Lokalisationen sind Weichgewebe, Extremitäten und Rumpf 2. Leiomyosarkome sind genetisch instabile Tumoren und weisen oft komplexe Karyotypen mit unbeständigen chromosomalen Aberrationen auf 3. Histologisch können Leiomyosarkome in epithelioid, myxoid, inflammatorisch und Granularzellleiomyosarkom unterschieden werden 2. Relevante prognostische Parameter sind Tumorgröße, Lokalisation, histologischer Malignitätsgrad und Invasion in Knochen und Blutgefäße 3. Besonders günstig sind kutane Leiomyosarkome aufgrund ihrer oberflächlichen Lokalisation 2, 7. Ungünstig hingegen sind retroperitoneale Leiomyosarkome, da sie oft wegen ihrer Größe und tiefen Lokalisation nicht im Gesunden reseziert werden können 2. Neben dem Rezidivrisiko besteht darüber hinaus die Gefahr der Metastasierung, bevorzugt in Lunge und Leber 2, 3. Die Therapie von Leiomyosarkomen ist in erster Linie chirurgisch 8. Bestrahlung und Zytostatika (Doxorubicin/Epirubicin und Ifosfamid) sind ohne gesicherten - -

12 Benefit 7, 8. Leiomyosarkome sind zwar relativ selten, jedoch aggressiv und ihre Prognose ist insgesamt im Vergleich mit anderen malignen Weichgewebstumoren eher schlecht (mittlere Überlebenszeit 2 Monate) GASTROINTESTINALER STROMATUMOR Gastrointestinaler Stromatumor (GIST) ist die Bezeichnung für eine Gruppe spezifischer mesenchymaler Tumoren des Gastrointestinaltrakts. GISTs unterscheiden sich von anderen Tumoren der glatten Muskulatur durch klinische, histologische und molekulare Merkmale, speziell durch die Expression von c-kit (CD7). Es gibt benigne und maligne Varianten, 8. Sie sind bevorzugt im Erwachsenenalter (vorrangig über 50 Jahren) vorzufinden, 8. GISTs sind die häufigsten mesenchymalen Tumoren des Gastrointestinaltrakts (80%) und können dort überall vorkommen Magen, 8, 3, 8. Ihre Hauptlokalisation ist der (50-70%), dann folgt Dünndarm und Duodenum (20-30%), Kolon und Rektum (0%) sowie Ösophagus (%), mesenterial (5%) und appendikulär (<%) 3. In der Regel treten sie unifokal auf 3. Charakterisiert sind GISTs, vor allem maligne Formen, durch Mutationen auf dem c-kit-gen, lokalisiert auf Chromosom 4q-q2. Das c-kit-gen gehört zu Familie der Tyrosin-Kinasen (Typ 3), deren Rezeptor normalerweise Dimere bildet, dessen Tyrosin-Kinase durch Liganden aktiviert (phosphoryliert) wird und es schließlich nukleär zum Proliferationssignal kommt. Durch die Mutation wird c-kit ligandenunabhängig, was so zur Autophosphorylierung und damit zum autonomen Wachstum führt, 8. Eine starke Expression des c-kit-gens (CD7) liegt in 85-95% vor 2. Des Weiteren sind andere Genkopienzahlvermehrungen sowie -Verluste bei GISTs zu finden, welche verschiedene Chromosomen betreffen 6, 8. Prognostisch relevante Parameter sind Tumorgröße, Tumornekrose, Expression von Ki67 und Aneuploidie, 8. Darüber hinaus spielt die Lokalisation des - 2 -

13 Primärtumors eine diagnostische Rolle, wobei proximale GISTs (Ösophagus, Magen) günstiger sind als distale (Dünndarm, Kolon) 3. Nach wie vor ist die chirurgische Exzision mit tumorfreiem Resektionsrand (R0 Resektion) die Therapie der Wahl, trotzdem besteht die Wahrscheinlichkeit von Rezidiven 8. Darüber hinaus bildet die mutierte Tyrosin-Kinase c-kit einen Angriffspunkt, deren pathologische Aktivität durch Imantinibmesylat (STI57/, 7 Glivec) inhibiert wird. Dies führt auch bei inoperablem Primärtumor oder fortgeschrittenem Stadium zu einem deutlich verlängertem krankheitsfreien Intervall 2, 3. GISTs gelten als resistent gegenüber zytostatischen Therapien (<0% Ansprechraten auf Mono- oder Polychemotherapien mit Anthrazyklinen) und zeigen auch keine günstige Entwicklung unter Radiotherapie 3. Bei malignen Formen besteht die Gefahr, diffus intraabdominell oder peritoneal zu rezidivieren oder in die Leber, Lunge sowie Knochen zu streuen die hauptsächlichen Lokalisationen von Metastasen, 3, 8. Insbesondere bei Rezidiven oder Metastasen ist die Prognose schlecht LIPOSARKOME Liposarkome sind eine histologisch und genetisch heterogene Gruppe maligner mesenchymaler Neoplasien mit Fettgewebsdifferenzierung, 2. Insgesamt zählen sie mit mehr als 20% zu den häufigsten malignen Weichgewebstumoren im Erwachsenenalter, 9. Häufige Lokalisationen von Liposarkomen, die vorrangig im mittleren und späten Erwachsenenalter auftreten, sind Extremitäten und Retroperitoneum, bevorzugte Metastasierungsorte Weichgewebe, Knochen sowie Lunge. -3. Klinische Parameter sind stark abhängig vom Subtyp des Liposarkoms und können daher sehr zwischen den einzelnen Tumorgruppen variieren. Folgende Subentitäten Untergliederung erfolgt werden nach unterschieden: Enzinger die und histologische Weiss in hochdifferenziert/dedifferenziert, myxoid/rundzellig und pleomorph 2. Darüber hinaus gibt es noch mixed-type Liposarkome - 3-2, 3, die extrem selten auftreten 3

14 und in dieser Arbeit nicht vertreten sind. Dedifferenzierte Liposarkome hochdifferenzierter Liposarkomen Liposarkome stellen dar, die rundzellige fortgeschrittene die von Form myxoiden. Die Subentitäten hochdifferenziert/dedifferenziert sowie myxoid/rundzellig sind auch genetisch verschieden. Die erstere Gruppe charakterisiert ein Rearrangement des Genabschnittes 2q -3, wohingegen für myxoid/rundzellige Liposarkome die Translokation t(2;6)(q3;p) typisch ist -3. Genetische Aspekte pleomorpher Liposarkome sind bislang wenig verstanden. Hochdifferenzierte Liposarkome in subkutaner Lokalisation werden im Rahmen dieser Arbeit als atypische Lipome bezeichnet, da sie nie metastasieren und keine Progression hin zu dedifferenzierten Liposarkomen zeigen -3, 9, 20. Des Weiteren sind sie aufgrund ihrer anatomischen Lage chirurgisch kurativ therapierbar -3, 9 hochdifferenzierten. Dadurch unterscheiden sie sich prognostisch von Liposarkomen anderer Lokalisation, beispielsweise retroperitoneal oder mediastinal, die häufig rezidivieren und deren Risiko einer Progression im Sinne einer Dedifferenzierung deutlich höher ist, so dass diese der Gruppe hochdifferenziert/dedifferenziert zugeordnet werden -3, 5. Die Prognose hängt stark vom histologischen Subtyp ab 9. Tabelle : Prognose in Abhängigkeit des histologischen Subtyps bei Liposarkomen Daten entnommen aus Miettinen Diagnostic soft tissue pathology Churchill Livingstone 2003 und Böcker, Denk, Heitz Pathologie Urban & Fischer SUBENTITÄT HÄUFIGKEIT 5-JAHRES-ÜBERLEBENSRATE hochdifferenziert >50% 90% dedifferenziert 5% 60-70% myxoid/rundzellig 30-40% 40-50% pleomorph 5% 20% Wie bereits oben erwähnt spielt bei Liposarkomen die Lokalisation eine entscheidende prognostische Rolle 3. Des Weiteren beeinflussen histologischer Malignitätsgrad, Nekrosen, TP53-Überexpression bei myxoid/rundzelligen sowie Tumorgröße und -Tiefe, Anzahl der Mitosen, Nekrosen bei pleomorphen Liposarkomen die Prognose 3. Therapie der Wahl mit statistisch signifikantem Benefit ist eine ausgedehnte chirurgische Exzision mit tumorfreiem Resektionsrand (R0 - Resektion), die in - 4 -

15 Abhängigkeit von der Lokalisation nicht immer ausreichend durchzuführen ist 3, 8. So gelten retroperitoneale hochdifferenzierte zweithäufigste Lokalisation dieser Subentität häufige unkontrollierbare Dedifferenzierung, 2, lokale 5., die, als schlecht therapierbar durch Rekurrenz Weitere Radiotherapie sowie Zytostatika -3 Liposarkome,, sowie therapeutische der Fähigkeit Möglichkeiten zur sind 8, wobei hier kein gesicherter Benefit hinsichtlich der Überlebenszeit besteht 7, 8,. Die zytostatischen eingesetzten Substanzen Doxorubicin/Epirubicin und Ifosfamid zeigen bei Monotherapie Ansprechraten von 0-30%, jedoch ohne Erwirkung einer längeren Überlebenszeit 8,. Insbesondere bei Rezidiven oder fortgeschrittener Erkrankung lässt die Effektivität einer zytostatischen Therapie zu wünschen übrig..2 DER ÖSTROGENREZEPTOR Ein besseres Verständnis von Mechanismen, die maßgeblich an der Pathogenese von Weichgewebstumoren beteiligt sind, ist notwendig, um neue und bessere therapeutische Optionen zu finden. Der Östrogenrezeptor wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit Ziel dieser Suche. Der Östrogenrezeptor gehört zur Familie der Steroidhormonrezeptoren. Diese nukleären Rezeptoren können extrazelluläre Signale in eine Transkription eines Genabschnittes überführen. Das Steroidhormon Östrogen entwickelt seine Wirkung über den Östrogenrezeptor, der bis zum Kontakt mit dem Hormon zellulär im inaktivierten Zustand vorliegt, gebunden an zytoplasmatische Proteinkomplexe den Hitzeschockproteinen 2. Bei der Aktivierung der Rezeptoren lösen diese sich von den Hitzeschockproteinen und bilden Dimere, die dann über zwei Mechanismen ihre Wirkung entfalten können 2. Der Östrogenrezeptor kann einerseits direkt als regulativer Transkriptionsfaktor agieren, indem er als Dimer 2 an Zielsequenzen der Zelle bindet aktiviert als auch reprimiert werden die Transkription über. Die Transkription kann dann sowohl 2. Andererseits kann der Östrogenrezeptor Protein-Protein-Wechselwirkungen mit anderen

16 Transkriptionsfaktoren forcieren, beispielsweise durch Bindung an AP- über Fos und Jun, die dann ihrerseits an die DNA binden 2. Abbildung : Funktion des Östrogenrezeptors Grafik entnommen aus Ganten, Ruckpaul Grundlagen der Molekularen Medizin Springer-Verlag Der Östrogenrezeptor hormonabhängiger als indirekter regulativer Transkriptionsfaktor Transkriptionsfaktor 2 steht und daher im Zusammenhang mit einer Expression von Zielgenen, die den Zellzyklus beeinflussen. Östrogenrezeptorabhängig werden stimulierende Wachstumsfaktoren wie TGFα, IGF-II und PDGF sowie der inhibierende Faktor TGF-β exprimiert 22. Auch die Produktion zellulärer Proteine wie Progesteronrezeptor und Proteasen wird durch den Östrogenrezeptor als Transkriptionsfaktor beeinflusst 22. Das ESR-Gen (6q ) ist eine komplexe genomische Einheit mit zahlreichen Möglichkeiten alternativen Spleißens sowie mit Nutzung sechs verschiedener Promotoren 24. Über die Anzahl der aktiven Promotoren in einer Zelle kann die Menge des synthetisierten Östrogenrezeptors reguliert werden 24. Der Östrogenrezeptor wird in hormonsensitiven Geweben der Frau exprimiert wie im Epithel der Brust und des Endometriums, in Stromazellen des Endometriums und im Myometrium des Uterus

17 Die Verteilung der Subtypen α und β des Östrogenrezeptors ist unterschiedlich in verschiedenen Geweben, ebenso ihre Spezifität bezüglich der Bindung von Liganden 25, GENETISCHE VERÄNDERUNGEN UND KANZEROGENESE Es ist heute bekannt, dass genetische Veränderungen wie beispielsweise numerische Chromosomenaberationen, Translokationen, Verlust oder Zugewinn von Genabschnitten Kontrollmechanismen des zellulären Wachstums destabilisieren, eine unkontrollierte Proliferation fördern, die dann schließlich in der Entwicklung benigner und maligner Neoplasien resultieren kann. Amplifikation sowie auch Deletion von genetischem Material sind bei malignen Tumoren ein häufiger Mechanismus, die Expression bestimmter Zielgene zu steigern und sich so einen Wachstums- und Überlebensvorteil zu sichern 9, 24, Es kommt im Rahmen einer Amplifikation zu einer Vermehrung von normalerweise zwei vorhandenen Kopien eines Gens auf bis zu mehrere tausend 24. Die Amplifikation stellt sich zytogenetisch als homogene Struktur dar, die sich in anderen Chromosomen integrieren (intrachromosomal) oder als paarige, extrachromosomale Genpakete vorliegen kann, 24. Das Produkt, also das Protein, liegt bei einer Genamplifikation unverändert, aber bei entsprechender Expression in erhöhter Konzentration vor 28. Durch die unphysiologisch erhöhten Spiegel dieses Genproduktes, beispielsweise die vermehrte Bildung unveränderter Wachstumsfaktoren, kann ein Verlust der kontrollierten Zellproliferation erfolgen 28. Die Identifikation von genetischen Veränderungen trägt zum besseren Verständnis der Kanzerogenese bei, kann diagnostisch genutzt werden und führt zur Entwicklung selektiver Therapien. Möglicherweise ergeben sich prognostische Assoziationen der Genveränderung..4 BEDEUTUNG DES ÖSTROGENREZEPTORS IN DER KANZEROGENESE - 7 -

18 Der Einfluss von Östrogen sowie Östrogenrezeptorblockern (trans- hydroxytamoxifen) auf die Wachstumsrate von Zellen ist in vitro nachgewiesen 30. Zelllinien von ER-positiven Mammakarzinomen reagieren auf das Fehlen von Östrogen unmittelbar mit einer verringerten Wachstumsrate 30. Diese kann nach kurzfristigem Entzug von Östrogenen durch Gabe von Östradiol gesteigert werden 30. Östrogenrezeptorblocker wirken dosisabhängig als vollständiger Antagonist bei einer durch Östradiol stimulierten Proliferation und führen zu einem verminderten Zellwachstum 30. Es konnte ein Zusammenhang zwischen Anwesenheit von Östrogen und Expression des Östrogenrezeptors in Form einer Up-/Down-Regulation nachgewiesen werden 30. Zellen unter östrogenfreien Bedingungen zeigen höhere Östrogenrezeptorspiegel 30. Im Tiermodell wurde gezeigt, dass Östrogen und sein Rezeptor auch bei primär östrogenunabhängigem Wachstum über andere Mechanismen proliferationsfördernd wirken 3. Des Weiteren wurde an Tiermodellen dargestellt, dass es unter Östrogeneinfluss zu einer erhöhten Inzidenz von Neoplasien (u. a. Liposarkom) sowie zu einem hormonstimulierten Tumorwachstum kommt 32, 33. Das Vorliegen einer Östrogenrezeptorexpression bei Mammakarzinomen gilt als prognostischer Faktor und ist Ziel einer Antiöstrogenrezeptor-Therapie mit Tamoxifen 34, 35. Hierdurch kann eine statistisch signifikante Verlängerung des krankheitsfreien sowie des rezidivfreien Intervalls erreicht werden, was sich insgesamt in einer verlängerten Überlebenszeit widerspiegelt Vor kurzem wurde nachgewiesen, dass ESR-Amplifikationen in 20% und eine geringe Vermehrung Mammakarzinomen der vorliegen. Genkopienzahl In fast allen in weiteren Fällen sind Amplifikationen mit einer Östrogenrezeptorexpression assoziiert 5% die bei ESR- 27. Außerdem scheinen Patientinnen mit ESR-Amplifikation und Östrogenrezeptorexpression mehr von einer Therapie mit Tamoxifen zu profitierten als Patientinnen ohne Amplifikation ÖSTROGENREZEPTOR UND MESENCHYMALE NEOPLASIEN Für einige Entitäten mesenchymaler Neoplasien wurde eine Expression des - 8 -

19 Östrogenrezeptors α beschrieben. Dies gilt insbesondere für uterine und retroperitoneale Leiomyome weiblicher Patienten, uterine Leiomyosarkome, Angiomyofibroblastome, aggressivem Angiomyxome sowie genitale Stromatumore der Frau (wie Stromasarkome des Endometriums). Trotz der früher durchgeführten Untersuchungen geben die publizierten Studien in ihrer Gesamtheit nur ungenügende Aufschlüsse über die tatsächliche Häufigkeit von Östrogenrezeptorexpressionen bei Weichgewebstumoren. Auffällig sind große Diskrepanzen zwischen den Resultaten der einzelnen Studien. So variieren die angegebenen Häufigkeiten beispielsweise bei Leiomyosarkomen zwischen 0% und 00%, bei Liposarkomen zwischen 0% und 60%. Die Beurteilung ist durch diese doch recht unterschiedlichen Aussagen stark erschwert. Einige Entitäten wie zum Beispiel atypische Lipome oder Rhabdomyome wurden bislang keiner Analyse unterzogen, sodass das Wissen über Östrogenrezeptorexpressionen bei Weichgewebstumoren zudem unvollständig ist. Interessant ist die Tatsache, dass in einigen Studien und Fallberichten die Entstehung von Sarkomen (u. a. Liposarkom, Leiomyosarkom, StromazellSarkom) unter Tamoxifen-Therapie geschildert wurde Mechanismen die für eine Östrogenrezeptorexpression ursächlich sind, wurden bislang an mesenchymalen Tumoren nicht entdeckt. Eine mögliche Ursache wäre eine Genkopienzahlvermehrung des ESR-Gens, welches den Östrogenrezeptor α ü kodiert, wie dies bei Mammakarzinomen kürzlich beschrieben wurde

20 .6 ZIELE DER ARBEIT Da bislang noch keine gezielte Untersuchung an Weichgewebstumoren hinsichtlich Östrogenrezeptoren sowohl auf Protein- als auch auf Genebene an einer größeren Tumorpopulation, die zahlreiche Subentitäten repräsentiert, durchgeführt wurde, ist dies Ziel der vorliegenden Arbeit. Eine standardisierte Analyse unter Verwendung der gleichen Methode, des gleichen Protokolls sowie identischer Materialien soll eine bessere Vergleichbarkeit der Daten realisieren. Dies wird hier mittels Tissue-Microarray-Technik erreicht. Im Fokus stehen die Entitäten Leiomyome, Leiomyosarkome und Liposarkome, bei denen Expressionen des Östrogenrezeptors sowie teils auch Genkopienzahlveränderungen des ESR-Gen gezeigt wurden, jedoch keine einheitlichen Angaben in der Literatur zu finden sind. Insbesondere Zusammenhänge zwischen Genveränderung und Proteinexpression wurden bei mesenchymalen Tumoren nur unzureichend untersucht. Die Rolle einer ESR-Amplifikation für die Expression des Östrogenrezeptors wurde bei 743 Proben mesenchymaler Neoplasien von 632 Patienten analysiert. Es erfolgte die Konstruktion eines Tissue Microarrays (TMA), der verschiedene mesenchymale Neoplasien enthielt sowie eines TMAs, der unterschiedliche Fettgewebstumoren beinhaltete. Diese wurden hinsichtlich der Expression des Östrogenrezeptors immunhistochemisch und bezüglich der ESR-Amplifikation mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung analysiert. Die durchgeführten Untersuchungen sollen dazu beitragen, die Pathogenese von Weichgewebstumoren besser zu verstehen. Bekannte Proteinexpressionen oder Genveränderungen könnten bei der Differentialdiagnose der Subentitäten hilfreich sein. Letztlich könnte die Expression des Östrogenrezeptors einen neuen gezielten Therapieansatz ermöglichen

21 2 MATERIAL UND METHODEN 2. ZUSAMMENSETZUNG DER ARRAYS: PATIENTEN-/ TUMORKOLLEKTIV Für die Untersuchung standen zwei verschiedene Weichgewebstumor-TMAs zur Verfügung. Freundlicherweise konnte auf einen durch E. von Friderici und M. Hochreiter im Rahmen ihrer Doktorarbeit hier im Institut gefertigten Array zurückgegriffen werden. Ein weiterer TMA mit Fettgewebstumoren wurde eigens für diese Arbeit zusammengestellt. Die Multitumorarrays beinhalten verschiedene Entitäten von Weichgewebstumoren sowie standardisiertes Kontrollgewebe. Insgesamt sind 20 Tumortypen vertreten. Tabelle 2: Übersicht Entitäten Angiosarkome 00 Chondrosarkome (extraskelettal) 008 Dermatofibrosarkoma protuberans 022 desmoide Fibromatose 02 primitive neuroektodermale Tumoren des Weichgewebes (PNET) 003 Fibrosarkome 072 gastrointestinale Stromatumoren (GIST) 02 Granularzelltumoren 04 Haemangioperizytome 077 Leiomyome 00 Rhabdomyom 072 Leiomyosarkome 20 Liposarkome 02 atypische Lipome 035 maligner peripherer Nervenscheidentumor (malignes Schwannom) 074 Non Specified Sarkome (NOS) 007 Osteosarkome (extraskelettal) 007 Rhabdomyosarkome 003 Synovialsarkome 050 Lipome 000 Standardkontrollgewebe Das Standardkontrollegewebe setzte sich aus Gewebe von Herz, Niere, Lunge, Kolon, Endometrium, Prostata, Lymphknoten, quergestreifter Muskulatur, Haut, Fett, Mamma-, Lungen-, Kolon- und Prostatakarzinomen zusammen

22 Abbildung 2: Schema des TMA Angiosarkom Chondrosarkom Dermatofibrosarkoma protuberans Desmoide Fibromatosis PNET Fibrosarkom GIST Granularzelltumor Haemangioperizytom Leiomyom Rhabdomyom Leiomyosarkom Liposarkom Atypisches Lipom Malignes Schwannom Standardkontrollgewebe NOS Osteosarkom PNET Rhabdomyosarkom Synovialsarkom Standardkontrollgewebe Lipom Atypisches Lipom Liposarkom Standardkontrollgewebe

23 2.2 BEFUNDE/ HISTOLOGIE-REVIEW Aus den Berichten des Instituts für Pathologie Hamburg Eppendorf wurden Angaben zur Diagnose und Lokalisation der Tumoren entnommen, bezüglich der Sarkome ebenfalls Größe (pt-stadium), Differenzierungsgrad (Grading), Lymphknotenstatus (pn-stadium) und Metastasierungsgrad (pm-stadium). Allgemeine Daten wie Operationsdatum, Alter und Geschlecht der Patienten sowie Angaben über rezidivierendes Auftreten des Tumors gehörten ebenso dazu. Des Weiteren wurden alle histologischen Präparate des Fettgewebstumorarrays noch einmal hinsichtlich der Entität sowie eventuell genaue Charakterisierung 3 von Untergruppen nach aktuellen Kriterien der World Health Organization befundet. 2.3 HERSTELLUNG DES TISSUE MICROARRAYS Das Tissue-Micro-Array-Verfahren ermöglicht die Untersuchung eines großen Gewebekollektivs auf Proteinebene (Immunhistochemie) sowie mittels molekularer Methoden (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung). Zunächst erfolgt die Rekrutierung potentiell verwendbarer Fälle aus der Datenbank des Instituts für Pathologie des Universitätsklinikums Hamburg Eppendorf. Entsprechende histologische Schnitte werden aus den Archiven herausgesucht und von einem erfahrenen Pathologen beurteilt. Auf dem hematoxylin-eosin-gefärbten Objektträger werden repräsentative Anteile des Gewebes markiert. Anschließend werden die korrespondierenden Gewebeparaffinblöcke aus den Archiven zu den Objektträgern sortiert. Ein Datenfile wird erstellt, der folgende patientenbezogene Informationen aus den pathologischen Befunden beinhaltet: Geburtsdatum, Geschlecht, jeweiliges Datum der Probenentnahme, Lokalisation sowie Angaben zum Staging und Grading. Nach Erstellung eines Datenfiles (Punch-File) beginnt das Stanzen des Arrays: aus dem repräsentativen Areal eines Gewebeparaffinblocks (DonorBlock) werden Gewebezylinder (Durchmesser 0,6 mm, Höhe 3-4 mm mittels einer Hohlnadel entnommen. Die Gewebezylinder vorgefertigte Löcher im Empfängerparaffinblock eingebracht , 4 werden ) in

24 Abbildung 3: Herstellung des TMA entnommen aus Human Molecular Genetics 200, Vol.0, Abbildung 4: Stanzgerät und dessen Funktion entnommen aus Nature reviews drug discovery 2003, Vol. 2,

25 Abbildung 5: Übersichtsaufnahme des Stanzgerätes Abbildung 6: Detailaufnahme des Bohrers Abbildung 7: Detailaufnahme der Stanze Mittels eines selbst hergestellten X-Y-Achsen-Präzisionsinstruments werden die einzelnen Gewebezylinder im Empfängerblock (45 x 20mm) eingebettet; der Abstand zwischen den einzelnen Spots beträgt 0,8 mm. Auf diese Art können bis zu 000 Gewebestanzen hochpräzise in einen einzigen Empfängerblock angeordnet werden 4,

26 Abbildung 8: Beispiel eines Tissue Microarrays Der Array wird mit einem Mikrotom in histologische Schnitte mit einer variablen Dicke von 4-8 µm geschnitten und mit Hilfe eines adhesive-coated tape sectioning system (Instrumedics, Hackensack, NJ/USA) auf einen Objektträger aufgebracht 40, 44. Abbildung 9: Gefärbte HE-Schnitte der TMAs

27 2.4 IMMUNHISTOCHEMIE (IHC) Für die immunhistologische Färbung wurde das standardisierte indirekte Immunoperoxidase-Verfahren (ABC-Elite, Vector Laboratories, Berlingame, CA, USA) angewandt. MATERIALIEN45 ER pharmdx-kit von DAKO (Glostrup, Dänemark): Mix aus Antikörper-Klone D5 und ER-2-23 Waschpuffer (code S3006) Dual Endogenous Enzyme Block (code S2003) Target Retrieval Solution (code S699) kalibrierter Dampfkocher EnVision+ Mouse, HRP (code K4000) DAB+ (Diaminobenzidin, code K3468) Haemalaun entparaffinieren und rehydrieren der Probe eintauchen in Target Retrieval Solution kalibrierter Dampfkocher: 5 min bei 25 C inkubieren 30 min abkühlen lassen (keine Zugluft) Druck ablassen und Objektträger entnehmen abgießen der Target Retrieval Solution und spülen mit Waschpuffer 5 min einweichen der Objektträger in frischem Waschpuffer Färbung im DAKO-Färbeautomat (DAKO-Autostainer) Gegenfärbung mit Haemalaun 5 s trocknen, reinigen und eindeckeln der Objektträger Für die Negativkontrolle wurde der primäre Antikörper weggelassen. Die Positivkontrolle wurde durch Färbung von Standardkontrollgewebe auf dem Array mit bekannter Östrogenrezeptor-Expression (Mammakarzinome) erzielt

28 2.5 FLUORESZENZ IN SITU HYBRIDISIERUNG (FISH) TAG I MATERIALIEN Pretreatment Solution (Vysis VP 2000 Pretreatment Reagent # , Abbott Molecular Inc., IL/USA): NaSCN, ph 5,4, 50 ml, auf 80 C erwärmt Protease Solution ( L Vysis VP 2000 Protease Buffer # (0,0 N HCl, ph 2,0) + Vysis Protease I # (Pepsin 250 mg), Abbott Molecular Inc., IL/USA): auf 37 C erwärmt Sonden-Hybridisierungsmix für 20 µl: 4,0 µl Basismix 2,0 µl COT-DNA ( µg/µl) 3,5 µl ESR-Sonde DNA (0,03µg/µl) (BAC RP-450E24, RZPD) 0,5 µl CEP6-Sonde Spektrum Orange (Abbott Molecular Inc., IL/USA) Paraffinschnitt des Gewebearrays auf Superfrost plus TM über Nacht bei 40 C backen, anschließend mit einem Diamantschreiber das Areal markieren 3 x 0 min Xylol, 2 x 5 min in 96% Ethanol entparaffinieren 3 min Lufttrocknung auf Heizplatte, Alkohol entfernen 5 min Pretreatment bei 80 C 2 min in demineralisiertem Wasser waschen 50 min in Proteaselösung bei 37 C andauen 2 min Wasserspülung (demineralisiertes Wasser) 3 min 70% Ethanol in Küvette gießen 3 min 80% Ethanol in Küvette gießen 3 min 96% Ethanol in Küvette gießen 3 min Lufttrocknung auf Heizplatte (48 C) 0 µl Sonden-Hybridisierungsmix auf den Gewebearray pipettieren und mit Deckgläschen eindeckeln, mit Rubbercement versiegeln 5 min bei 72 C im ThermoBrite (Abbott Molecular Inc., IL/USA)

29 denaturieren über Nacht Schnitt im HYBrite bei 37 C inkubieren TAG II MATERIALIEN Waschpuffer-Küvette: 2 x SSC (Saline-Trinatriumcitrat: 0,4M NaCl, 0,05M Trinatriumcitrat; 4 x 66 g auf L = 20 x SSC, dann :0 verdünnen) (Abbott Molecular Inc., IL/USA), 0,3% NP40 (Octylphenoxypolyethoxyethanol; Abbott Molecular Inc., IL/USA), ph 7,25 (ph 7-7,5), auf 72 C erwärmen Fluorescent Antibody Enhancer Set (Roche, Basel/Schweiz) Waschpuffer: x PBS (Phopshate-Buffered saline), 0,2% Tween20, auf 37 C aufwärmen x Blocking-Lösung 500 µl + 3 x 50 µl/objektträger (0 x Blocking aus KitFlasche #4 auftauen und mit PBS :0 verdünnen) DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol) - Antifade 000 mg/ml (Abbott Molecular Inc., IL/USA) Antikörperaliquots vor Verdünnung mit Blocking-Lösung 5 min bei circa 0000 rpm zentrifugieren Kleber und Deckgläschen vorsichtig entfernen Objektträger in den Waschpuffer bei Raumtemperatur stellen bis Wasserbad aufgeheizt, 2 min bei 72 C Objektträger in den Waschpuffer ins Wasserbad stellen Objektträger nach der Post-Hybridisierung kurz in x PBS (00 ml in Objektträger-Küvette) waschen Objektträger mit 500 µl Blocking-Solution eindecken, 30 min bei Raumtemperatur inkubieren Blocking-Solution abkippen 50 µl Maus-Anti-DIG-Antikörper-Lösung (2 µl Antikörper-Lösung aus KitTube # in 48 µl x Blocking) auf Objektträger-Küvette pipettieren, mit Parafilm abdecken, h bei 37 C in feuchter Kammer inkubieren 3 x mit 00 ml Waschpuffer (x PBS, 0,2% Tween20) bei 37 C jeweils etwa min kurz nacheinander waschen (3 Küvetten), zwischendurch etwas

30 schütteln 50 µl Anti-Maus-Antikörper-DIG-Lösung (2 µl Antikörper-Lösung aus KitTube #2 in 48 µl x Blocking) auf Objektträger pipettieren, mit Parafilm abdecken, h bei 37 C in feuchter Kammer inkubieren 3 x mit 00 ml Waschpuffer (x PBS, 0,2% Tween20) bei 37 C jeweils etwa min kurz nacheinander waschen (3 Küvetten), zwischendurch etwas schütteln 50 µl Anti-DIG-Fluorescein-Lösung (2 µl Antikörper-Lösung aus Kit-Tube #3 in 48 µl x Blocking) auf Objektträger pipettieren, mit Parafilm abdecken, h bei 37 C in feuchter, dunkler Kammer inkubieren 3 x 5 min mit 00 ml Waschpuffer ( x PBS, 0,2% Tween20) waschen, Küvetten dunkel halten lufttrocknen der Objektträger im Dunkeln bei Raumtemperatur eindecken der luftgetrockneten Objektträger mit 50 µl DAPI (4',6-Diamidino2-Phenylindol) - Antifade, mit Deckgläschen (24x32 mm) abdecken, möglichst dunkel halten 2.6 AUSWERTUNG 2.6. IMMUNHISTOCHEMIE Die Auswertung erfolgt nach dem Allred-Score 35. Der Anteil der positiven Tumorzellen wird zunächst geschätzt und ein Proportionsscore ermittelt Anschließend wird ein Intensitätsscore vergeben, der sich an 35. der durchschnittlichen Färbeintensität positiver Zellen orientiert 35. Tabelle 3: Definition des Allred-Scores 35 SCORE PROPORTIONSSCORE 0 negativ < % 2-0% % % 5 > 66% INTENSITÄTSSCORE negativ schwach positiv mittelstark positiv stark positiv Proportions- und Intensitätsscore werden addiert, so dass ein Gesamtscore von 0 bis 8 erreicht werden kann 35. Tabelle 4: Interpretation des Allred-Scores 35 ALLRED-SCORE AUSSAGE

31 ER-negativ ER-positiv Bei allen immunhistochemisch positiven Tumoren wird die Untersuchung an Schnitten der Großfläche des Tumors wiederholt FLUORESZENZ-IN-SITU-HYBRIDISIERUNG Die Auswertung erfolgt manuell. Die Zellkerne werden mit DAPI blau gefärbt. Als Vergleich wird eine ZentromerSonde (Cep6) verwendet, so dass eine ESR-Amplifikation vorliegt, wenn das Verhältnis von grünen (ESR) zu roten (Cep6) Signalen >2 ist. Im Falle intrachromosomaler ESR-Amplifikationen stellen sich diese als grüne Cluster dar. Bei einer Ratio zwischen und 2 handelt es sich um eine Polysomie. Entspricht die Anzahl der ESR-Gen-Signale denen der Centromersonde, so liegt keine spezifische Veränderung des ESR-Gens vor. Ist die Ratio kleiner kann von einer Deletion des ESR-Gens ausgegangen werden. Die Evaluierung basiert auf dem etablierten Scoring-System für HER2- Amplifikationen beim Test-Kit PathVysion (akzeptiert durch US Food and Drug Administration (FDA)) 46. Amplifikationen und Polysomien werden im Rahmen dieser Arbeit als FISHpositiv bezeichnet. Deletionen wie auch normale Genkopienanzahlen des ESR-Gens werden hier als FISH-negativ eingeordnet. Tabelle 5: Definition und Interpretation der FISH-Ergebnisse RATIO AUSSAGE >2 Amplifikation 2 Polysomie normal < Deletion BEZEICHNUNG FISH-positiv FISH-positiv FISH-negativ FISH-negativ Bei allen FISH-positiven Neoplasien wird ebenfalls an weiteren Schnitten der Großfläche nochmals eine FISH-Analyse sowie mehrfach Immunhistochemie durchgeführt

32 2.7 STATISTIK Mittels Kontigenztabellen-Analyse Zusammenhänge zwischen und klinisch - Chi-Quadrat-Test pathologischen werden Daten und Östrogenrezeptorexpression sowie ESR-Amplifikation dargestellt. Lediglich der erste Spot eines Patienten wird bei Vorhandensein mehrerer Gewebeproben (Primarius/Rezidiv/Metastase) für die statische Analyse genutzt

33 3. ERGEBNISSE 3. ALLGEMEIN Es wurden 743 Tumoren von 632 Patienten untersucht. Davon sind 33 Patienten männlich (49,50%) und 39 weiblich (50,50%). Das durchschnittliche Alter liegt bei 55,32 Jahren, der Median bei 57,25 Jahren; der jüngste Patient war Jahr, der älteste 98 Jahre alt. Es ergibt sich folgende zu untersuchende Gesamttumorpopulation: Tabelle 6: Übersicht der Gesamttumorpopulation ENTITÄT ANZAHL ANZAHL ANZAHL PATIENTEN PRIMÄRREZIDIVE TUMOREN ADIPOZYTÄRE TUMOREN Lipom Atypisches Lipom 2 Liposarkom 20 2 FIBROBLASTISCH/MYOFIBROBLASTISCHE TUMOREN Desmoide Fibromatose Haemangioperizytom 4 9 Fibrosarkom 3 FIBROHISTIOZYTÄRE TUMOREN Dermatofibrosarkoma 8 6 protuberans GLATTMUSKULÄRE TUMOREN Leiomyom Leiomyosarkom GIST SKELETTMUSKULÄRE TUMOREN Rhabdomyom Rhabdomyosarkom 7 4 VASKULÄRE TUMOREN Angiosarkom 2 9 CHONDRO-OSSÄRE TUMOREN Chondrosarkom 0 6 Osteosarkom 7 4 PERIPHERE NERVENSCHEIDENTUMOREN Granularzelltumor 2 2 malignes Schwannom PERIPHERE NEUROEKTODERMALE TUMOREN PNET 2 8 TUMOREN UNKLARER DIFFERENZIERUNG Synovialsarkom 3 NOS TOTAL ANZAHL METASTASEN Die Entität Malignes Fibröses Histiozytom (MFH) wurde des Öfteren als solche

34 in Frage gestellt, so dass diese Tumoren im Rahmen dieser Arbeit als pleomorphe undifferenzierte high grade Sarkome bezeichnet werden und der Gruppe Non-other-specified-Tumoren (NOS) zugeordnet sind 4, 5. Von 38 Patienten konnten sowohl Primarius als auch Rezidiv untersucht werden, bei weiteren 3 Patienten war es möglich Primarius, Rezidiv und Metastase zu analysieren. Tabelle 7: Übersicht Entität, Primarius, Rezidiv und Metastase ENTITÄT PRIMARIUS UND PRIMARIUS, REZIDIV REZIDIV UND METATASE Liposarkom 6 Desmoide Fibromatose 3 Dermatofibrosarcoma 3 protuberans Leiomyom 2 Leiomyosarkom 2 GIST Angiosarkom 2 Chondrosarkom Osteosarkom Granularzelltumor malignes Schwannom 2 PNET NOS 6 TOTAL Nach Enzinger und Weiss 38 2 PRIMARIUS UND METASTASE erfolgt eine Einteilung der Tumoren in benigne, intermediär (so genannte Borderline-Tumoren) und maligne: benigne: Lipom, Leiomyom, Rhabdomyom, Granularzelltumor intermediär: atypisches Lipom, desmoide Fibromatose, Dermatofibrosarcoma protuberans maligne: Liposarkom, Haemangioperizytom, Fibrosarkom, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Angiosarkom, Chondrosarkom, Osteosarkom, malignes Schwannom, PNET, Synovialsarkom, NOS. GISTs werden entsprechend ihrer pathologischen Parameter wie Tumorgröße, Nekrosen, Mitosenanzahl etc. eingeordnet. Insgesamt konnten 74 Tumoren als benigne, 6 als intermediär und 397 als maligne eingeordnet werden. Bei 297 malignen Primärtumoren konnte die Tumorgröße ermittelt werden: 98 (33,00%) Weichgewebstumoren waren kleiner als fünf Zentimeter (entspricht

35 pt) und 99 (67,00%) größer (entspricht pt2). Die Lokalisationstiefe konnte bei 290 malignen Primarii bestimmt werden: wobei 45 (5,52%) Weichgewebstumoren suprafaszial (entspricht pta) und 245 (84,48%) tief (d.h. unterhalb der Muskelfaszie, entspricht ptb) auftraten. Die einzelnen Neoplasien waren wie folgt lokalisiert: Tabelle 8: Übersicht Lokalisation LOKALISATION PRIMARII Kopf/Hals Rumpfwand Lunge Mediastinum Gastrointestinaltrakt intraperitoneal retroperitoneal obere Extremität untere Extremität Genitaltrakt Skelettsystem andere Lokalisation ohne Angabe REZIDIVE METASTASEN Bei 35 malignen Tumoren konnte anhand der eingesandten Präparate ein Lymphknotenstatus erhoben werden; bei 22 (6,27%) malignen Weichgewebstumoren wurden Lymphknotenmetastasen nachgewiesen (pn). Das Grading konnte bei 304 der malignen Tumoren aus den Unterlagen entnommen werden, wobei 46 Primarii G, 87 G2 und 7 G3 klassifiziert wurden. Bei Liposarkomen konnten folgende Subentitäten untersucht werden: Tabelle 9: Übersicht Subentität bei Liposarkomen SUBENTITÄT ANZAHL DER FÄLLE hochdifferenziert/ dedifferenziert myxoid/ rundzellig pleomorph unklar

36 3.2 TECHNISCHE PROBLEME UND AUSWERTBARKEIT Immunhistochemisch konnten insgesamt 665 von 743 (89,50%) untersuchten Gewebeproben ausgewertet werden. Fehlende Resultate sind dem Mangel an Gewebe im Spot oder dem Fehlen des Spots geschuldet (78 = 0,50%). Die FISH-Analyse war in 532 von 743 (7,60%) untersuchten Gewebeproben erfolgreich. Fehlende Resultate sind dem Mangel an Gewebe im Spot oder dem Fehlen des Spots geschuldet (2 = 28,40%). 3.3 PRIMÄRTUMOREN 3.3. IMMUNHISTOCHEMIE 466 von 526 Primarii (88,59%) waren im immunhistochemischen Verfahren interpretierbar. Es wiesen 62 Primärtumoren (3,30%) ein positives immunhistochemisches Ergebnis auf. Davon waren 38 (8,6%) schwach und 24 (5,5%) stark positiv anfärbbar (Allred Score s. S. 29). Die Ergebnisse sind tabellarisch auf der folgenden Seite dargestellt. Insbesondere bei glattmuskulären Tumoren (Leiomyom, Leiomyosarkom und GIST trat häufig eine Expression des Östrogenrezeptors auf). Bei der überwiegenden Zahl von östrogenpositiven Tumoren handelt es sich um Leiomyome und Leiomyosarkome, größtenteils aus dem Uterus stammend. Daneben war bei Haemangioperizytomen, malignen peripheren Nervenscheidentumoren häufig sowie Liposarkomen und NOS - Tumoren gelegentlich ein Vorhandensein des Östrogenrezeptors darstellbar

37 Tabelle 0: Übersicht der IHC-Ergebnisse bei Primärtumoren ENTITÄT ANZAHL IHC NEGATIV IHC SCHWACH POSITIV ADIPOZYTÄRE TUMOREN Lipom % Atypisches Lipom 00% Liposarkom % 6% FIBROBLASTISCH/ MYOFIBROBLASTISCHE TUMOREN Desmoide 3 3 Fibromatose 00% Haemangioperizytom 7 5 7% 4% FIBROHISTIOZYTÄRE TUMOREN Dermatofibrosarkom 4 4 protuberans 00% GLATTMUSKULÄRE TUMOREN Leiomyom % 4% Leiomyosarkom % % GIST % 20% SKELETTMUSKULÄRE TUMOREN Rhabdomyom 00% Rhabdomyosarkom % VASKULÄRE TUMOREN Angiosarkom % CHONDRO-OSSÄRE TUMOREN Chondrosarkom % Osteosarkom % PERIPHERE NERVENSCHEIDENTUMOREN Granularzelltumor % malignes Schwannom % 2% PERIPHERE NEUROEKTODERMALE TUMOREN PNET % TUMOREN UNKLARER DIFFERENZIERUNG Synovialsarkom 00% NOS % 6% TOTAL % % IHC STARK POSITIV 4% 20 34% 3 6% 24 5%

38 Abbildung 0: IHC mit schwach positiver Östrogenrezeptorexpression in einem Liposarkom Abbildung : IHC mit schwach positiver Östrogenrezeptorexpression in einem Liposarkom FLUORESZENZ IN SITU HYBRIDISIERUNG

39 Mittels FISH-Analyse waren 375 von 526 (7,29%) der Primarii interpretierbar. 32 (8,53%) Primärtumoren wiesen eine Genkopienveränderung auf. Davon waren 25 (6,67%) Polysomien, 6 (,60%) Amplifikationen sowie Deletion (0,27%) nachweisbar. Die Ergebnisse sind tabellarisch auf der folgenden Seite dargestellt. Genkopienzahlveränderungen nachweisbar. Darüber waren hinaus am stellen häufigsten sich diese bei NOS-Tumoren bei Liposarkom, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Granularzelltumoren sowie malignen periphereren Nervenscheidentumoren dar. Die Amplifikationen Leiomyosarkoms betrafen sowie ein 2 Liposarkome, Rezidiv und 3 ein Primärtumor NOS-Tumoren. eines Detaillierte Informationen und Fallbeschreibungen sind weiter unten aufgeführt. Abbildung 2: FISH ESR-Amplifikation bei einem Liposarkom Bla u: Nuklei, grün: ESR, rot: Centromer 6. Die ESR-Amplifikation ist als Cluster grüner Signale zu sehen bzw. wenn das Verhältnis von grünen zu roten Signalen >2 ist

40 Tabelle : Übersicht der FISH-Ergebnisse bei Primärtumoren ENTITÄT ANZAHL FISH NEGATIV POLYSOMIE ADIPOZYTÄRE TUMOREN Lipom % Atypisches Lipom % Liposarkom % % FIBROBLASTISCH/ MYOFIBROBLASTISCHE TUMOREN Desmoide 2 2 Fibromatose 00% Haemangioperizytom % FIBROHISTIOZYTÄRE TUMOREN Dermatofibrosarkom 4 4 protuberans 00% GLATTMUSKULÄRE TUMOREN Leiomyom % Leiomyosarkom % 5% GIST % SKELETTMUSKULÄRE TUMOREN Rhabdomyom 00% Rhabdomyosarkom 2 50% 50% VASKULÄRE TUMOREN Angiosarkom % CHONDRO-OSSÄRE TUMOREN Chondrosarkom % Osteosarkom 00% PERIPHERE NERVENSCHEIDENTUMOREN Granularzelltumor 0 9% 9% malignes 7 6 Schwannom 94% 6% PERIPHERE NEUROEKTODERMALE TUMOREN PNET % TUMOREN UNKLARER DIFFERENZIERUNG Synovialsarkom 00% NOS % 29% TOTAL % % AMPLIFIKATION 2 2% 3% 3 9% 6 2%

41 3.3.3 TUMORVERHALTEN Benigne Tumoren exprimierten den Östrogenrezeptor in unserem Kollektiv generell häufiger und stärker als intermediäre oder maligne Weichgewebsneoplasien. Dies ist statistisch hochsignifikant (p < 0,00) und gilt auch bei alleiniger Betrachtung glattmuskulärer Tumoren. Eine ER-Positivität war hier signifikant häufiger bei Leiomyomen (28 von 59 positiv, 47,46%) als bei Leiomyosarkomen (8 von 47 positiv, 7,02%) (p = 0,00). Eine definitive Aussage zu uterinen Tumoren ist nicht möglich aufgrund der geringen Anzahl maligner Neoplasien in dieser Region. benigne PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC schwach positiv PRIMÄRTUMOR IHC stark positiv TOTAL Tumorverhalten intermediär ,86% 95,24% 9 2 6,25% 4,76% 20 3,89% TOTAL maligne ,89% 27 9,68% 4,43% Abbildung 3: IHC Primärtumoren und Tumorverhalten Genkopienzahlveränderungen traten vor allem bei malignen Tumoren, selten oder gar nicht bei benignen oder intermediären Neoplasien auf. Dieser Zusammenhang ist statistisch hoch signifikant (p < 0,00). benigne PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL Tumorverhalten intermediär maligne ,06% 00% 86,28% 3 0,94% 3,72% TOTAL

42 Abbildung 4: FISH Primärtumoren und Tumorverhalten DIFFERENZIERUNGSGRAD Die ER-Expression der malignen Weichgewebsneoplasien zeigt geringe Assoziationen zum Differenzierungsgrad (statistisch nicht signifikant, p = 0,494). Grading G PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC schwach positiv PRIMÄRTUMOR IHC stark positiv TOTAL G ,86% 4,43% 2 5,7% 35 TOTAL G ,89% 7,48%,64% ,09%,00% 0,9% 0 Abbildung 5: IHC Maligne Primärtumoren und Differenzierungsgrad

43 Jedoch zeigten insbesondere niedrig differenzierte Neoplasien Genkopienzahlveränderungen des ESR-Gens. Der Zusammenhang zwischen Differenzierungsgrad des Tumors und Genveränderung ist statistisch signifikant (p = 0,030). Grading G PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL G ,67% 3,33% 30 TOTAL G ,3% 8 5,69% ,3% 8 20,69% Abbildung 6: FISH Maligne Primärtumoren und Differenzierungsgrad GESCHLECHT Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Geschlecht und Expression des Östrogenrezeptors ist darstellbar (p < 0,00). Neoplasien weiblicher Patienten exprimieren den ER-Rezeptor deutlich häufiger als bei männlichen Patienten. GESCHLECHT weiblich PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC schwach positiv PRIMÄRTUMOR IHC stark positiv TOTAL TOTAL männlich 94 8,86% 20 8,44% 23 9,7% ,70% 8 7,86% 0,44%

44 Abbildung 7: IHC Primärtumoren und Geschlecht Es besteht ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Geschlecht sowie Genkopienzahlveränderung (p = 0,008). Diese treten deutlich häufiger bei Männern als bei Frauen auf. Eine Hypothese zu diesem unerwarteten Ergebnis findet sich im Diskussionsteil. GESCHLECHT weiblich PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL TOTAL männlich 78 95,70% 8 4,30% ,83% 23 2,7% Abbildung 8: FISH Primärtumoren und Geschlecht Der anhand des Alters angenommene Menopausenstatus weiblicher Patienten (jünger als 45 Jahre = prämenopausal, Jahre = menopausal, älter als 55 Jahre = postmenopausal 47, 48 ) weist weder einen statistisch signifikanten Zusammenhang zur ER-Expression noch zur Genkopienzahlveränderung auf

45 3.3.6 LOKALISATION In einigen Geweben kommt es häufiger und stärker zu einer Östrogenrezeptorexpression. Dies gilt insbesondere für den Genitaltrakt. Tabelle 2: IHC ER-Expression und Tumorlokalisation LOKALISATION ANZAHL IHC NEGATIV Kopf/ Hals Rumpfwand Lunge Mediastinum Gastrointestinaltrakt intraperitoneal retroperitoneal obere Extremität untere Extremität Genitaltrakt Skelettsystem ohne Angabe % 93% 00% 00% 86% 78% 78% 96% 98% 34% 00% IHC SCHWACH POSITIV 004 7% 003 4% 04 3% 06 7% 0 4% 0 % 06 7% 0- IHC STARK POSITIV % 02 6% 00 % 7 49% 0- Zwischen FISH-Ergebnis und Lokalisation des Tumors lässt sich eine deutliche Assoziation herstellen. Tabelle 3: FISH Genkopienzahlveränderung und Tumorlokalisation PolyLOKALISATION ANZAHL FISH FISH somie NEGATIV POSITIV Kopf/ Hals % 3% 2 Rumpfwand % Lunge % 7% Mediastinum % Gastrointestinaltrakt % % intraperitoneal % 2 9% 4 retroperitoneal % 5 5% 3 obere Extremität 2 7 8% 4 9% 8 untere Extremität % 9 4% Genitaltrakt % Skelettsystem 00% ohne Angabe Amplifikation - Deletion -

46 3.3.7 TUMORGRÖßE Häufiger exprimierten maligne Tumoren den Östrogenrezeptor, die größer als 5 Zentimeter waren (entspricht pt2). Dies ist allerdings ohne statistische Signifikanz (p = 0,538). T-STADIUM pt PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC positiv TOTAL TOTAL pt2 8 9,0% 8 8,99% ,57% 22 2,43% Abbildung 9: IHC Primärtumoren und Tumorgröße Auf Genebene jedoch, stellt die Tumorgröße eine statistisch signifikante Einflussgröße dar (p = 0,30). Eine Genkopienzahlveränderung ist insbesondere bei malignen Tumoren größer als 5 Zentimeter zu finden. T-STADIUM pt PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL TOTAL pt ,75% 5 7,25% ,6% 23 4,84%

47 Abbildung 20: FISH Primärtumoren und Tumorgröße 3.4 REZIDIVE In 38 Fällen wurden Primärtumoren und zugehörige Rezidive untersucht, diese waren hinsichtlich des Östrogenrezeptors in 36 Fällen identisch (p = 0,03). REZIDIV IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC positiv TOTAL TOTAL IHC positiv 34 97,4% 2,86% 35 33,33% 2 66,67% In 28 Fällen konnten Primärtumor und zugehöriges Rezidiv mittels FISH analysiert werden. Dabei fanden sich Unterschiede bezüglich Amplifikationoder Polysomiestatus im zeitlichen Verlauf. REZIDIV FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL TOTAL FISH positiv 8 90,00% 2 0,00% ,50% 2,50% Im Folgenden werden die im Fokus stehenden Entitäten Leiomyom, Leimoysarkom sowie Liposarkom näher dargestellt. Ein Kapitel zu Gastrointestinalen Stromatumoren bietet sich ebenfalls an aufgrund der überraschenden Ergebnisse in der Immunhistochemie

48 3.5. LEIOMYOM 59 Primärtumoren konnten immunhistochemisch analysiert werden, von denen 28 (47,46%) positiv waren. Eine stark positive Färbung war bei 20 (34,90%) Leiomyomen zu finden. Leiomyome stammten von männlichen Patienten, die keine Expression des Östrogenrezeptors (0%) zeigten; 28 von 48 (58,33%) Leiomyomen weiblicher Patienten waren ER-positiv. Die Assoziation von ER-Expression und Geschlecht ist bei Leiomyomen hoch signifikant (p = 0,002). GESCHLECHT weiblich PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC schwach positiv PRIMÄRTUMOR IHC starkpositiv TOTAL TOTAL männlich 20 4,67% 8 6,67% 20 4,67% 48 00% Abbildung 2: IHC Leiomyom Primärtumoren und Geschlecht

49 Die Lokalisation des Leiomyoms ist ein statistisch hoch signifikanter Faktor in Bezug auf das Vorhandensein des Östrogenrezeptors (p < 0,00). Leiomyome exprimieren diesen bevorzugt im weiblichen Genitaltrakt. Tabelle 4: IHC Leiomyom und Tumorlokalisation LOKALISATION ANZAHL IHC SCHWACH POSITIV Kopf/ Hals 0 0Lunge 0 0Mediastinum 0 0Gastrointestinaltrakt % intraperitoneal 05 0retroperitoneal % untere Extremität 03 0Genitaltrakt % davon Uterus % IHC STARK POSITIV % 0 33% % % Abbildung 22: IHC Leiomyom Primärtumoren und Lokalisation IHC NEGATIV % 00% 00% 95% 40% 33% 00% 2% 4%

50 3.6 LEIOMYOSARKOM Es waren 47 Primärtumoren immunhistochemisch auswertbar, von denen 8 (7,02%) positiv, davon 3 (6,38%) stark positiv, anfärbbar waren. Bei 3 von 39 (7,69%) interpretierbaren Primärtumoren traten Genkopienzahlveränderungen auf; dabei handelt es sich um 2 Polysomien (5,3%) und um Amplifikation (2,56%). Das Geschlecht war in unserem relativ kleinen Kollektiv nicht signifikant mit der Östrogenrezeptorexpression assoziiert (p = 0,269). GESCHLECHT weiblich PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC positiv TOTAL TOTAL männlich 20 76,92% 6 23,08% ,48% 2 9,52% Abbildung 23: IHC Leiomyosarkom Primärtumoren und Geschlecht Ebenso sind keine Assoziationen zwischen einer Genkopienzahlveränderung und Geschlecht bei Leiomyosarkomen darstellbar (p =,000)

51 Die Lokalisation ist keine statistisch signifikante Einflussgröße in Bezug zur ERExpression (p = 0,33). Tabelle 5: IHC Leimyosarkom und Tumorlokalisation LOKALISATION ANZAHL IHC SCHWACH POSITIV Kopf/ Hals 03 0Rumpfwand % Lunge 02 0Gastrointestinaltrakt 07 0intraperitoneal % retroperitoneal % obere Extremität 02 0untere Extremität 08 0Genitaltrakt 03 0Skelettsystem 0 0ohne Angabe 05 IHC STARK POSITIV % 0 33% 0- IHC NEGATIV % 00% 00% 83% 78% 00% 88% 67% 00% Die Polysomien waren bei Primarii der Lunge und der unteren Extremität, die Amplifikation intraperitoneal zu finden. Es besteht keine statistische Signifikanz zwischen Genkopienzahlveränderung und Lokalisation des Tumors (p = 0,385). Der Differenzierungsgrad von Leiomyosarkomen zeigte eine Tendenz zur quantitativen ESR-Veränderungen ohne statistische Signifikanz. Grading G PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL G2 7 00% 7 TOTAL G3 6 94,2% 5,88% ,67% 2 3,33% 5 Abbildung 24: FISH Leiomyosarkom Primärtumoren und Differenzierungsgrad

52 3.6. AMPLIFIKATIONEN BEI LEIOMYOSARKOMEN Das erste amplifizierte Leiomyosarkom stammt von einer 63-jährigen Patientin. Der Primärtumor war im Mesenterium lokalisiert und ist vermutlich auf dem Boden einer peritonealen Leimyomatose entstanden. Er ist als pt2b N0 M0 und G2 zu klassifizieren. Die Amplifikationsratio beträgt 4 bei 8 ESR- zu 2 Centromer-6-Kopien. Die Immunhistochemie erbrachte in diesem Fall ein schwach positives Ergebnis. Im zweiten Fall handelt es sich um ein Leimoysarkom einer 50-jährigen Frau mit peritonealer Lokalisation im Sinne einer peritonealen Karzinose, klassifiziert als ptx N0 M G3. Es wurden 5 ESR-/ 2 Centromer-6-Kopien mit einer Ratio von etwa 3 gefunden. Die immunhistochemische Untersuchung ergab ein stark positives Resultat bezüglich einer Östrogenrezeptorexpression. Die Patientin verstarb 9 Monate später an nach klinischen Angaben dialysepflichtiger Niereninsuffizienz, bei Zustand nach beidseits, uterines Leiomyosarkom sowie Peritonealkarzinose Mammakarzinom

53 3.7 GASTROINTESTINALER STROMATUMOR Es konnten 56 Primärtumoren immunhistochemisch aufgearbeitet werden, von denen (9,64%) schwach positiv waren. Die Expression des Östrogenrezeptors scheint in Beziehung zum Tumorverhalten zu stehen. Maligne GISTs exprimierten den ER häufiger als benigne. Dies erreicht jedoch kein statistisches Signifikanzniveau (p = 0,087). TOTAL benigne PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC schwach positiv TOTAL intermediär 7 94,44% 5.56% 8 maligne 2 85,7% 2 4,29% ,67% 8 33,33% Abbildung 25: IHC GIST Primärtumoren und Tumorverhalten Das Geschlecht scheint kein statistisch signifikanter Einflussfaktor zu sein (p = 0,8). Bei Tumoren männlicher Patienten trat eine Expression des Östrogenrezeptors interessanterweise häufiger auf als bei Frauen. Bei allen 3 Patientinnen mit positivem ER-Status ist ein postmenopausales Alter anzunehmen. GESCHLECHT weiblich PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC positiv TOTAL TOTAL männlich 24 82,76% 3 0,35% ,78% 8 29,63%

54 Abbildung 26: IHC GIST Primärtumoren und Geschlecht Sowohl im Gastrointestinaltrakt als auch außerhalb lokalisierte GISTs weisen vereinzelt eine Expression des Östrogenrezeptors auf. Innerhalb des Verdauungstrakts treten positive GISTs in allen untersuchten Abschnitten auf, jedoch mit statistisch signifikant unterschiedlicher Häufigkeit (p = 0,040). LOKALISATION ANZAHL gastrointestinal Ösophagus Magen Dünndarm Colon/ Rektum extragastrointestinal IHC SCHWACH POSITIV 0 9% 0 00% 06 5% 02 8% 0 00% 0 33% IHC STARK POSITIV Abbildung 27: IHC GIST Primärtumoren und Lokalisation IHC NEGATIV 43 8% % 09 82% %

55 Die Tumorgröße ist eine statistisch signifikante Einflussgröße (p = 0,028); insbesondere bei GISTs größer als 5 Zentimeter lag ein positiver ER-Status vor. T-Stadium pt PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC positiv TOTAL TOTAL pt ,63% 3 9,38% ,6% 7 36,84% 9 Abbildung 28: IHC GIST Primärtumoren und Tumorgröße

56 3.8 LIPOSARKOM In der Immunhistochemie konnte bei 6 von 08 Primärtumoren ein schwach positives Ergebnis erzielt werden (5,56%). Tabelle 6: IHC Liposarkom nach verschiedenen Subentitäten Anzahl ENTITÄT 08 Liposarkom 57 hochdifferenziert/ dedifferenziert 36 myxoid/ rundzellig 5 pleomorph IHC - POSITIV 6 6% 3 5% 3% 2 4% Auffällig ist, dass alle 3 ER-positiven hoch-/dedifferenzierten Liposarkome nur im hochdifferenzierten Anteil den Östrogenrezeptor exprimierten. Der Differenzierungsgrad der Liposarkome scheint im Allgemeinen jedoch kein signifikanter Einflussfaktor bezüglich des ER-Status zu sein (p = 0,337). Bei 3 (3,98%) von 93 interpretierbaren Primärtumoren wurden Genkopienzahlveränderungen dargestellt: 0 (0,75%) Polysomien, 2 (2,5%) Amplifikationen und (,08%) Deletion. Genkopienzahlveränderungen sind in unterschiedlicher Häufigkeit bei den jeweiligen Subentitäten zu finden. Dies verfehlt knapp das statistische Signifikanzniveau (p = 0,083). Tabelle 7: FISH Liposarkom nach verschiedenen Subentitäten Anzahl ENTITÄT 93 Liposarkom 48 hochdifferenziert/ dedifferenziert 3 myxoid/ rundzellig 4 pleomorph FISH - POSITIV 3 4% 9 9% 3% 3 2% Abbildung 29: FISH Liposarkom Primärtumoren und Subentitäten

57 Kein statistisch signifikanter Zusammenhang lässt sich zwischen Geschlecht und Rezeptorpositivität herstellen (p =,000). Bei allen Patientinnen mit ERpositiven Tumoren ist ein postmenopausaler Status anzunehmen, dies ist statistisch nicht signifikant (p = 0,75). ESR-Vermehrungen waren bei weiblichen Patienten häufiger zu finden, allerdings ohne statistische Signifikanz (p = 0,373). GESCHLECHT weiblich PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL TOTAL männlich 39 90,70% 4 9,30% ,00% 8 6,00% Abbildung 30: FISH Liposarkom Primärtumoren und Geschlecht Ein statistischer signifikanter Bezug zur Lokalisation ist weder auf Protein- noch auf Genebene nachweisbar. Es ist kein eindeutiger Einfluss des Tumordifferenzierungsgrads auf die Häufigkeit der ER-Expression noch einer nachweisbar Genkopienzahlveränderung

58 Die Tumorgröße zeigt geringe Assoziationen zum positivem FISH-Status, ohne statistische Signifikanz (p = 0,325). T-STADIUM pt PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL TOTAL pt2 7 00% ,72% 0 2,27% Abbildung 3: FISH Liposarkom Primärtumoren und Tumorgröße 3.7. AMPLIFIKATIONEN BEI LIPOSARKOMEN Der erste amplifizierte Tumor ist ein dedifferenziertes Liposarkom von einer 86jährigen Patientin, war am Unterarm subkutan sowie muskulär lokalisiert und pt2 M0 N0 G3 klassifiziert. Die FISH-Ratio beträgt etwa 5 bei 0-2 ESR- zu 2-3 Centromer-6-Kopien. Das Ergebnis der Immunhistochemie bezüglich einer Östrogenrezeptorexpression fiel negativ aus. Es handelt sich im zweiten Fall um ein dedifferenziertes Liposarkom, einer 64jährigen Frau, das im Verlauf rezidivierte. Sowohl der Primärtumor als auch die Rezidive wiesen in der Kontrolle am Großflächenschnitt eine ÖstrogenrezeptorAmplifikation auf. Die FISH-Ratio des Primarius ist mit 0-20 ESR- zu 2 Centromer-6-Kopien größer als 5. Der Tumor war retroperitoneal lokalisiert und pt2b M0 N0 G2 klassifiziert. Es lag bei diesem Liposarkom keine Expression des Östrogenrezeptors vor (Immunhistochemie negativ)

59 3.8 IMMUNHISTOCHEMIE UND FLUORESZENZ-IN-SITU-HYBRIDISIERUNG In 368 von 526 (69,96%) Fällen konnten sowohl ein immunhistochemisch als molekular-genetisch werden. Es interpretierbares Ergebnis des Primärtumors erzielt sind keine eindeutigen Zusammenhänge zwischen Genveränderung und Expression des Proteins darstellbar (p = 0,733). PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC schwach positiv PRIMÄRTUMOR IHC stark positiv TOTAL PRIMÄRTUMOR FISH negativ Polysomie ,60% 92,00% ,50% 8,00% 20 5,94% Abbildung 32: IHC und FISH TOTAL Amplifikation 5 83,33% 6,67%