The life cycle of caveolae - from assembly to disassembly

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1 DISS. ETH NO The life cycle of caveolae - from assembly to disassembly A dissertation submitted to ETH ZURICH for the degree of Doctor of Sciences presented by ARNOLD LUDWIG HAYER Dipl. Biotech., Ecole Supérieure de Biotechnologie de Strasbourg (ESBS) born on October 9 th, 1978 citizen of Austria accepted on the recommendation of Prof. Dr. Ari Helenius, examiner Prof. Dr. Yves Barral, co-examiner Prof. Dr. Daniel Gerlich, co-examiner 2009

2 1 Summary Caveolae are small, omega-shaped membrane invaginations present on the surface of many mammalian cell types. They are enriched in cholesterol and sphingolipids and therefore represent lipid-raft microdomains. Caveolae function in a variety of cellular and physiological processes including endocytosis, transcytosis, lipid regulation, signaling, pathogen entry and cancer. Caveolin-1, an integral membrane protein, is the major coat protein of caveolae. There is evidence that caveolar transport follows principles distinct from known vesicular transport mechanisms. Unlike clathrin-, COPI-, and COPII- mediated transport, caveolar transport does not involve cycles of coat assembly and disassembly. Instead, once assembled, the caveolar coat remains stable throughout transport. The main questions addressed in this thesis were; how are caveolae assembled, where are they assembled, and how are they disassembled and degraded. In the first part of this thesis, the cellular location where caveolae initially form was investigated. By using various light microscopy techniques in cells expressing GFP-tagged caveolin-1 (CAV1-GFP) we could consistently visualize newly assembled caveolar domains departing from the Golgi complex as distinct spots, and proceeding to the plasma membrane following curvilinear tracks. Unlike VSVG-protein-carrying vesicles, these were homogenous and their fluorescence intensity was indistinguishable from surface caveolae. Upon arrival at the surface, the CAV1-GFP did not diffuse away, in contrast to VSVG-protein. Taken together with previous observations, the results indicated that caveolar domains assemble in the Golgi complex, that they are individually transported as caveolar vesicles to the plasma membrane, and that upon arrival and thereafter they remain stable. In the second part, we studied the assembly of CAV1 in more detail by a combination of biochemical and live-cell microscopy approaches. Using sucrose gradient centrifugation we identified a novel oligomeric complex of CAV1 that forms during transit of CAV1 through the secretory pathway. Characterization of this complex indicated that it likely represents mature caveolae. FRAP analysis of newly synthesized CAV1 revealed that an essential oligomerization step for caveola

3 2 formation occurred in the Golgi. We furthermore present evidence for differential molecular requirements for Golgi exit of CAV1 and GFP-GPI versus VSVG and that newly assembled caveolar domains can incorporate cargo for surface delivery. Finally, the recently discovered caveolar coat component PTRF is shown to require newly synthesized CAV1 for association with caveolae. The third part investigates degradation of caveolae. We first show that saturation of caveolae assembly in the Golgi caused delivery of non-assembled caveolin to the plasma membrane and subsequent degradation in the endo/lysosomal pathway. Moreover, we found that CAV1 also entered the endo/lysosomal pathway in unperturbed cells and that inhibitors of lysosomal degradation caused accumulation of CAV1 in endosomal organelles. Coexpression of GFP- and RFP-tagged CAV1 allowed monitoring of how CAV1 was targeted to the lumen of acidic endosomal organelles in living cells, as GFP-fluorescence is more sensitive to acidic ph than RFP. Taken together, our results are consistent with degradation of CAV1 in the endo/lysosomal pathway. In the last part we studied assembly and biosynthetic trafficking of flotillins that were found to be related to caveolins in several aspects. Live-cell imaging showed that Golgi-derived flotillin-domains were stable when they arrived at the cell surface. Similar to caveolae, they formed microdomains in the plasma membrane that were stable over several hours. We propose that flotillin microdomains and caveolae may follow similar underlying principles.

4 3 Zusammenfassung Caveolae können als mikroskopisch kleine, sackförmige Einstülpungen an der Oberfläche vieler Säugerzelltypen beobachtet werden. Sie haben eine einzigartige Lipidzusammensetzung und werden wegen ihres hohen Gehalts an Cholesterin und Sphingolipiden als lipid-raft betrachtet. Caveolae sind an zahlreichen zellulären und physiologischen Prozessen beteiligt, z.b. Endozytose, Transzytose, Fettstoffwechsel, Signaltransduktion, Virus-Wirt-Interaktion und Krebs. Das integrale Membranprotein Caveolin-1 stellt den Grundbaustein einer Proteinhülle dar, die Caveolae umgibt. Es gilt als erwiesen, dass sich Caveolae-abhängiger Membrantransport grundsätzlich von bislang bekannten vesikulären Transportmechanismen unterscheidet. Anders als bei Clathrin- und COPI/II- vermitteltem Transport bleibt die Caveolin-Hülle mit dem Vesikel während des Transports assoziiert und ist keinem zyklischen Auf- und Abbau unterworfen. Sie stellt demnach ein stabiles Gerüst dar, welches über lange Zeit mit dem Membranvesikel verbunden bleiben kann. Die vorliegende Arbeit untersucht diese einzigartige Eigenschaft von Caveolae, indem sie der Frage nach der Biogenese dieser Strukturen nachgeht. Im ersten Teil wurde der Ort in der Zelle untersucht, an dem Caveolae gebildet werden. Mithilfe von Lichtmikroskopie und Zellen, die GFP-markiertes caveolin-1 (CAV1) exprimieren, konnten wir zeigen, dass Caveolae im Golgi gebildet werden. Diese neu gebildeten Vesikel sprossen zahlreich von Golgi-Zisternen und bewegten sich rasch zur Zelloberfläche, wo sie nach der Fusion mit der Plasmamembran als stabile Einheiten erhalten blieben. Im Gegensatz dazu verteilte sich VSVG in der Plasmamembran unmittelbar nachdem es die Zelloberfläche erreicht hatte. Daraus schlossen wir, dass Caveolae im Golgi gebildet werden und danach als stabile Einheiten vielfältigen Aufgaben im Zellverband nachgehen können. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich eingehender mit der Biogenese von Caveolae unter Verwendung von biochemischen und Lichtmikroskopie- Methoden. Mithilfe von Sukrosegradientenzentrifugation konnte ein neuer oligomerer Komplex von CAV1 identifiziert werden, der sich während des Transports von CAV1 durch

5 4 die sekretorischen Organellen bildet. Die Charakterisierung dieses Komplexes legte nahe, dass es sich damit um reife, voll ausgebildete Caveolae handelt. FRAP- Analysen an neu synthetisiertem CAV1 haben darüber hinaus gezeigt, dass im Golgi ein wichtiger Oligomerisierungsschritt stattfindet, im Einklang mit unseren früheren Beobachtungen. Schließlich haben wir noch festgestellt, dass die Exozytose von den lipid-raft-assoziierten CAV1 und GFP-GPI nicht abhängig von Dynamin-2 ist, diejenige von VSVG hingegen schon. Nachdem neu gebildete CAV1-Domänen im Golgi mit Proteinen für den Transport zur Zelloberfläche beladen werden, könnte dies auf eine Funktion von CAV1 in der Regulierung von exozytotischen Transportund Sortierprozessen hinweisen. Schließlich zeigen wir noch, dass das erst kürzlich im Zusammenhang mit Caveolae entdeckte PTRF spezifisch an neu gebildete Caveolae an der Zelloberlfläche bindet. Im dritten Teil haben wir den Abbau von Caveolae untersucht. Zunächst zeigen wir, dass unter bestimmten Bedingungen freies, nicht mit Caveolae assoziiertes Caveolin vom Golgi an die Zelloberfläche transportiert werden kann, insbesondere dann, wenn der Caveolae-Bildungsprozess gesättigt ist. Dieses freie Caveolin wird schnell in die Zelle aufgenommen, wo es mit Markern der endosomalen Organellen kolokalisiert. Wir konnten nun zeigen, dass Caveolin auch unter physiologischen Bedingungen in den endosomalen/lysosomalen Weg eintritt. Eine neue experimentelle Strategie hat uns erlaubt, die Translokation von Caveolin ins saure Lumen von endosomalen Organellen mit Mikroskopie zu beobachten. Dabei werden GFP- und RFP-markiertes CAV1 zusammen exprimiert; wegen der höheren ph- Empflindlichkeit verliert GFP zunehmend an Fluoreszenz, was am Mikroskop verfolgt werden kann. Aus diesen Beobachtungen schließen wir, dass CAV1 in späten Endosomen oder Lysosomen abgebaut wird. Im letzten Teil haben wir biosynthetischen Transport und Biogenese von Flotillin- Domänen untersucht. Flotilline sind mit Caveolinen in mehrerlei Hinsicht verwandt. Beispielsweise benutzen Flotilline wie Caveoline den Golgi im biosynthetischen Transport, wo sie Domänen bilden, die dann an der Zelloberfläche für viele Stunden stabil bleiben können. Möglicherweise unterliegt Flotillinen und Caveolinen ein gemeinsames Funktionsprinzip in der Domänenbildung und im Membrantransport.