Praktikumsteil Charakterisierung und Genotypisierung floraler homöotischer Mutanten

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1 Praktikumsteil Charakterisierung und Genotypisierung floraler homöotischer Mutanten Im diesem Praktikumsteil sollen homöotische Mutanten von Arabidopsis untersucht werden. Abb 1, Aufbau einer Blüte einer wt Pflanze und die homöotischen Mutanten der Klasse A, B, C und E Die Aufgabe im Praktikum ist es zum einen Pflanzen phänotypisch zu analysieren und eine Genotypisierung der Pflanzen vorzunehmen. In diesem Praktikum wird mit Klasse B-Gen mutierten Pflanzen gearbeitet, daher wird der AP3- bzw. PI-Locus genotypisiert. Dabei werden 2 verschiedene Methoden, CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences) und dcaps (derived cleaved amplified polymorphic sequences) verwendet. Es wird mit Pflanzen, die das pi-1 Allel tragen gearbeitet: Abb 2, B-Gen knock-out in Arabidopsis pi-1 Allel, Mutation in 1. Exon führt zu Stopcodon Diese Pflanzen werden mit der CAPS-Methode genotypisiert: 1

2 Abb 3, Nachweis des pi-1 Allels mittels CAPS-Analyse Des Weiteren wird mit Pflanzen, die das ap3-3 Allel tragen gearbeitet: Abb 4, B-Gen knock-out in Arabidopsisap3-3 Allel, Mutation in 1. Exon führt zu Stopcodon Diese Pflanzen werden mit der dcaps-methode genotypisiert: Abb 5, Nachweis des ap3-3 Allels mittels dcaps-analyse 2

3 Nach der Analyse des Genotyps, sollen diese Ergebnisse mit den phänotypischen Analysen verglichen werden und auf die Vererbung des mutanten Allels geschlossen werden (dominant/rezessiv). In einem zweiten Versuchteil soll die Expression der mrna von ap3 und pi in wt Pflanzen und in den Mutanten untersucht werden. Dazu soll RNA isoliert werden, um dann cdna zu synthetisieren. Anhand einer semiquantitativen RT-PCR soll dann die Expression von AP3 und PI in Pflanzen bestimmt werden. Abb 5, Funktionsweise der RT-PCR (Chen et al.1999, Brain Research Protocols) Zusammenfassung Der Praktikumsversuch ist in 2 Versuchsteile gegliedert, die an den 2 Tagen zusammen abgearbeitet werden Teil 1, Analyse des Genotypisierung der Pflanzen 1. DNA-Isolierung aus 5 Pflanzen unbekannten Genotyps und eines Wildtyps 2. PCR mit der DNA aller 6 Pflanzen, zur Amplifikation des AP3- oder PI-Allels 3. Restriktionsverdau der PCR-Produkte 4. Agarose-Gelelektrophorese und Analyse der Genotypen Teil 2, Analyse der Expression von Ap3 und PI 1. RNA-Isolierung aus 2 Pflanzen bekannten Genotyps 2. RNA Konzentrationsbestimmung 3. RNA Gelelektrophorese 4. cdna Synthese aus der isolierten RNA 5. semiquantitative Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) 6. Agarose-Gelelektrophorese und Analyse 3

4 Tag 1 1. Einleitung und S1 Belehrung 2. RNA-Isolierung aus 2 Pflanzen bekannten Genotyps 3. RNA Konzentrationsbestimmung 4. RNA Geleletrophorese 5. Morphologische Analyse von 6 Pflanzen unter besonderer Berücksichtigung des Blüten- Phänotyps. 6. DNA-Isolierung aus 5 Pflanzen unbekannten Genotyps und eines Wildtyps (Summe 6 Pflanzen) 7. PCR mit der DNA aller 6 Pflanzen, um das AP3- oder PI-Allel zu amplifizieren Tag 2 8. Restriktionsverdau der PCR-Produkte aus Schritt 5 vom Vortag 9. cdna Synthese aus RNA aus Schritt 3 vom Vortag (nur 5 Gruppen) 10. semiquantitative Reverse Transcriptions-PCR (RT-PCR), um die Expression von AP3 und PI mittels RT-PCR in Pflanzen bekannten Genotyps zu untersuchen. 11. Restriktionsverdau auf Agarose-Gel auftragen und analysieren 12. RT-PCR auf Agarose-Gel auftragen und analysieren 13. Ergebnisse aller Gruppen zusammentragen und analysieren 4

5 I. Vorbereitung Beantworten Sie zur Vorbereitung auf das Praktikum folgende Fragen (schriftliche Beantwortung nicht notwendig): - Was versteht man unter homöotischen Mutationen? - Wie ist eine Arabidopsis-Blüte aufgebaut (Anzahl und Anordung der Organe)? - Was sind die grundlegenden Aussagen des ABC-Modells der Blütenentwicklung und welchen Phänotyp erwarten Sie für eine florale homöotische Mutante der Klasse B? - Wie funktioniert PCR? - Was sind Restriktionsenzyme? Anmerkung: Die Fragen dienen als Hilfestellung zum Protokollschreiben und für das Testat. II. Arbeitsplan Jede Gruppe erhält fünf Pflanzen, die Nachkommen entweder eines geselbsteten Elters sind, der ein mutantes APETALA3 (AP3) oder ein mutantes PISTILLATA (PI)-Allel trägt und ansonsten genotypisch einem Wildtyp entspricht. Die Eltern der bereitgestellten Pflanzen sind also entweder ap3/ap3; PI/PI ( AP3-Heterozygote ) oder AP3/AP3; pi/pi ( PI-Heterozygote ). Außerdem erhält jede Gruppe eine Wildtyp Pflanze als Referenz. Aufgabe im Praktikum ist es - die bereitgestellten Nachkommen phänotypisch zu analysieren und - hinsichtlich des AP3- bzw. PI-Locus zu genotypisieren - RNA zu isolieren, cdna zu synthetisieren und - mittels RT-PCR die Expression von AP3 und PI in Pflanzen bekannten Genotyps zu analysieren - die Ergebnisse aller Gruppen zusammenzutragen und gemeinsam zu analysieren 1. Einleitung und S1 Belehrung Tag 1 2. RNA-Isolierung aus 2 Pflanzen bekannten Genotyps Gruppennumer Genotyp der Pflanzen 1-3 AP3/AP3; PI/PI Wildtyp 4-6 ap3/ap3; PI/PI ap3 homo 7-9 AP3/ap3; PI/PI ap3 hetero AP3/AP3; pi/pi pi homo AP3/AP3; PI/pi pi hetero AP3: wildtypisches AP3-Allel ap3: mutantes AP3-Allel PI: wildtypisches PI-Allel pi: mutantes PI-Allel - Mit einem grünen Plastikmörser Pflanzenmaterial zerkleinern, dabei ab und zu vorsichtig flüssigen Stickstoff dazugeben, damit das Gewebe kalt bleibt, dann die Eppis bis zur weiteren Verarbeitung in flüssigen Stickstoff lagern (SCHON VORBEREITET) 5

6 - 300 µl cell lysis solution (2% SDS, 68 mm sodium citrate, 132 mm citric acid, 1 mm EDTA) dazugeben und schnell für mehrere Sekunden vortexen und Eppi invertieren bis das Gewebe im Puffer homogenisiert ist - 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren (stehen lassen) µl protein-dna precipitation solution (4 M NaCl, 16 mm sodium citrate, 32 mm citric acid) dazugeben und Eppis invertieren - Für mindestens 10 Minuten bei 4 C (auf Eis) inkubieren. Dann bei 4 C für 10 Minuten zentrifugieren. - Den Überstand sauber in ein neues RNA-Eppi übertragen (Pipette). 300 µl Isopropanol dazugeben und gut mischen durch Invertieren des Eppis. - 4 Minuten bei 4 C zentrifugieren, und den Überstand durch abpipettieren, verwerfen. - Das Pellet mit 600 µl 70% Ethanol waschen (d.h. Zugabe von EtOH und vorsichtig invertieren) und erneut 4 Minuten bei 4 C zentrifugieren. Ethanol sauber und vollständig abpippetieren. - Das Pellet trocknen lassen (offener Deckel, ca 5 min) und anschließend in 26 µl DEPC-Wasser auflösen. - 3 µl 10x DNase Puffer and 1 µl (5 units) DNase I (Roche, DNase I, RNase-free) dazugeben und für 30 Minuten bei 37 C inkubieren (Thermomixer) µl DEPC-Wasser, 50 µl 7.8 M NH 4 Ac ph 6.0 und 400 µl 100% Ethanol dazugeben und gut mischen Minuten bei 4 C zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet mit 600 µl 70% Ethanol waschen, danach 5 Minuten bei 4 C zentrifugieren. - Ethanol sauber und vollständig abpippetieren - Pellet trocknen lassen (offener Deckel, ca 5 min) und 20 µl DEPC-Wasser dazugeben und durch anschnipsen lösen. 3. RNA Konzentrationsbestimmung - 1 µl RNA zusammen mit 99 µl DEPC-Wasser in ein 1,5 ml RNA-Eppi geben - Gut mischen und alles in eine Küvette pipettieren - Photometrische Konzentrationsbestimmung mit DEPC-Wasser als blank 4. RNA Gelelektrophorese Gießen eines Agarose-Gels (wird vom Betreuer durchgeführt) Die Konzentration von Agarose-Gelen wird in weight per volume (w/v) angegeben, das heißt, für ein 1 %iges Gel müssen 1 g Agarose in 100 ml Laufpuffer resuspendiert werden. Durchführung: - Agarose Gel abwiegen, in eine Schott-Flasche geben - Laufpuffer zugeben, mischen - Gemisch in Mikrowelle aufkochen, dabei Flaschendeckel leicht öffnen. Vorsicht: Siedeverzug - Heiße Agaroselösung kurz (5 min) abkühlen lassen, dann in Gelschlitten gießen - Für ein großes Gel 6 µl Ethidiumbromid-Lösung, für ein kleines Gel 2 µl Ethidiumbromid- Lösung zugeben und mit Pipettenspitze in der Lösung verteilen. - Ethidiumbromid ist mutagen, immer blaue Handschuhe tragen, Hautkontakt vermeiden; Gele, die Ethidiumbromid enthalten, nur mit blauen Handschuhen anfassen - Kämme einsetzen - Gel auspolymerisieren lassen (ca min) 6

7 Gelelektrophorese RNA - 1 µl RNA zusammen mit 9 µl DEPC-Wasser in ein 1,5 ml RNA-Eppi geben - 2 µl RNA Ladepuffer dazugeben - Auf ein 1% Agarosegel laden, 6 µl DNA Marker in einen extra Slot dazu geben 5. Morphologische Analyse von 6 Pflanzen unter besonderer Berücksichtigung des Blüten-Phänotyps. - Notieren Sie ihre Beobachtungen. Was erwarten sie bezüglich Anzahl und Anordnung der Blütenorgane im Wildtyp? Weichen Pflanzen von dieser Erwartung ab, wenn ja, inwiefern? 6. DNA-Isolierung aus 5 Pflanzen unbekannten Genotyps und eines Wildtyps (Summe 6 Pflanzen) Wichtige Vorbemerkung: als erstes ist jeder Pflanze ist eine Nummer zuzuordnen (auf den jeweiligen Topf schreiben). Diese Nummer bei der DNA-Isolierung weiter verwenden, um nach der Genotypisierung jede Pflanze eindeutig zu identifizieren. Durchführung: - je ein Blättchen der Pflanzen abschneiden, in 1,5ml-Eppi geben und bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis lagern µl DNA-Extraktionspuffer (0,2 M Tris-HCl ph 8, 0,4 M LiCl, 20 mm EDTA ph 8, 1%SDS) zugeben (Pipette) - Blättchen mit Plastikmörser zerkleinern, bis keine größeren Blattbestandteile mehr sichtbar sind, Homogenisat bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis lagern - 5 min bei max. rpm zentrifugieren - Überstand (300 µl) in neues 1,5ml-Eppi pipettieren, 300 µl Isopropanol zugeben, gut mischen durch invertieren des Eppis (nicht vortexen) - 10 min bei max. rpm zentrifugieren - Überstand entfernen (abschütten), Eppi kurz auf sauberem Papiertuch vorsichtig abklopfen, 300 µl 70% EtOH zugeben - 5 min bei max. rpm zentrifugieren - Überstand entfernen (abschütten), Eppi gut auf sauberem Papiertuch abklopfen, Eppi so umgedreht stehen lassen (bis der Alkohol auf dem Papiertuch getrocknet ist) - Eppi umdrehen und Pellet bei geöffnetem Eppi-Deckel bei Raumtemperatur weiter trocknen lassen (ca min) - Pellet in 50 µl ddh 2 O aufnehmen (mit Pipettenspitze durchrühren, nicht auf- und abpipettieren) und für mind. 15 min bei 50 C inkubieren (Thermomixer); eventuell durch Anschnippen Pellet weiter resuspendieren 7

8 7. PCR mit der DNA aller 6 Pflanzen, um das AP3- oder PI-Allel zu amplifizieren a) Bestimmung des Genotyps für PI Genotypisierung mittels Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) PCR Grundlage: verschiedene Allele des gleichen Gens tragen unterschiedlich viele Schnittstellen für ein bestimmtes Restriktionsenzym Sequenz-Ausschnitt aus Wildtyp-PI-Allel:5 -AAA CTA TGG GAT GCT AAG CAT -3 Sequenz-Ausschnitt aus pi-1 Mutante: 5 -AAA CTA TGA GAT GCT AAG CAT -3 Wildtyp Allel trägt Schnittstelle für Restriktionsenzym BseGI (unterstrichen) mutantes Allel: pi-1 EMS-induzierte Punktmutation: TGG (kursiv) TGA; dadurch entsteht vorzeitiges STOP-Codon (trunkiertes Protein ist für mutanten Phänotyp verantwortlich) und: Schnittstelle für BseGI geht verloren Durchführung: a) Amplifikation des entsprechenden DNA-Fragments mittels PCR Wichtig: die Komponenten werden auf Eis zusammengemischt. Das Enzym wird als letztes dazugegeben Ein Reaktionsansatz enthält: Ausgangskonzentration Reaktionspuffer 10fach 1fach dntps 2 mm 0,2 mm Primer pi-1fwd CAPS 5 µm 1 µm (forward Primer) Primer pi-1rev CAPS (reverse Primer) 5 µm 1 µm Konzentration bzw. Menge im Reaktionsansatz taq-polymerase 1 unit/µl 0,75 units DNA-Lösung -- 1,5 µl Gesamtvolumen (mit ddh 2 O auffüllen) µl µl in einem Reaktionsansatz Mastermix X mal der Reaktionsansatz Negativkontrolle, bei der ddh 2 O an Stelle der DNA-Lösung eingesetzt wird, mit ansetzen Da mehrere PCR-Ansätze vorzubereiten sind, kann ein Master-Mix, der alle Reaktionskomponenten für die Einzel-PCRs außer der DNA-Lösung enthält, angesetzt werden; um Pippettierfehler zu korrigieren, wird für den Master-Mix eine Reaktion mehr als eigentlich benötigt angesetzt (6 Pflanzen + 1 Negativkontrolle + 1 Zusatzreaktion) Der Master-Mix wird gut gemischt (vortexen), die einer Einzelreaktion entsprechende Menge wird jeweils auf informativ beschriftete 0,5 ml-eppis verteilt (Gruppennummer 8

9 und Reaktionsansatz), 1,5 µl der DNA-Lösung (bzw. ddh 2 O für die Negativkontrolle) werden zugegeben und die PCR wird gestartet PCR-Programm: 95 C 5 min 95 C 30 sec 58 C 30 sec 35x 72 C 45 sec 72 C 10 min b) Bestimmung des Genotyps für AP3 Genotypisierung mittels derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (dcaps) PCR Grundlage: Allele werden durch PCR amplifiziert, Primer werden dabei so gewählt, dass bei Amplifikation eines Allels eine Schnittstelle vor einem Sequenzunterschied (z.b. Punktmutation entsteht), im anderen Allel aber nicht Reverse complement Wild-type: GAATAAACCATTTCTTCTCTTTGAATACGTCACTTG ap3-3: GAATAAACCATTTCTTCTCTTTGAATACGTCACTTA MunI: CAATTG ap3-3.rev: GAATAAACCATTTCTTCTCTTTGAATACGTCAATT nach PCR: WT-Allel besitzt Schnittstelle für Mun I (5 -CAA TTG-3 ), wird verdaut mutantes Allel: ap3-3 EMS-induzierte Punktmutation: CAA (kursiv) TAA; dadurch entsteht vorzeitiges STOP-Codon (trunkiertes Protein ist für mutanten Phänotyp verantwortlich) und: Schnittstelle für MunI kann durch PCR nicht eingebaut werden, PCR-Produkt wird nicht verdaut Durchführung: a) Amplifikation des entsprechenden DNA-Fragments mittels PCR Wichtig: die Komponenten werden auf Eis zusammengemischt. Das Enzym wird als letztes dazugegeben Ein Reaktionsansatz enthält: Konzentration bzw. Menge im Reaktionsansatz Reaktionspuffer 1fach 10fach dntps 0,2 mm 2 mm Primer ap3-3fwd dcaps (forward Primer) Primer ap3-3rev dcaps (reverse Primer) 1 µm 5 µm 1 µm 5 µm Ausgangskonzentration taq-polymerase 0,75 units 1 unit/µl DNA-Lösung 1,5 µl -- Gesamtvolumen (mit ddh 2 O auffüllen) 25 µl -- µl in einem Reaktionsansatz Mastermix X mal der Reaktionsansatz 9

10 Negativkontrolle, bei der ddh 2 O an Stelle der DNA-Lösung eingesetzt wird, mit ansetzen Da mehrere PCR-Ansätze vorzubereiten sind, kann ein Master-Mix, der alle Reaktionskomponenten für die Einzel-PCRs außer der DNA-Lösung enthält, angesetzt werden; um Pippettierfehler zu korrigieren, wird für den Master-Mix eine Reaktion mehr als eigentlich benötigt angesetzt (6 Pflanzen + 1 Negativkontrolle + 1 Zusatzreaktion) Der Master-Mix wird gut gemischt (vortexen) die einer Einzelreaktion entsprechende Menge wir jeweils auf informativ beschriftete 0,5 ml-eppis verteilt (Gruppennummer und Reaktionsansatz), 1,5 µl der DNA-Lösung (bzw. ddh 2 O für die Negativkontrolle) werden zugegeben und die PCR wird gestartet PCR-Programm: 95 C 5 min 95 C 30 sec 58 C 30 sec 35x 72 C 45 sec 72 C 10 min Tag 2 8. cdna Synthese aus RNA aus Schritt 3 vom Vortag (nur 5 Gruppen) cdna Nummer RNA 1 AP3/AP3; PI/PI Wildtyp 2 ap3/ap3; PI/PI ap3 homo 3 AP3/ap3; PI/PI ap3 hetero 4 AP3/AP3; pi/pi pi homo 5 AP3/AP3; PI/pi pi hetero Die Abkürzung cdna steht für complementary DNA und ist eine zur RNA komplementäre, einzelsträngige DNA. Der Prozess der Umwandlung von RNA in cdna, die Reverse Transkription, geschieht mittels Enzymen, den Reversen Transkriptasen. Durchführung: 2 µg RNA 1 µl (= 0,5 µg) oligo(dt) 18 primer Mit DEPC-Wasser auf 12,5 µl auffüllen 65 C 5 Minuten, auf Eis, kurz an zentrifugieren, wieder auf Eis 4 µl 5x Reaktionspuffer 0,5 µl Ribolock RNase Inhibitor 2 µl dntp Mix (10 µm) 1 µl Revert Aid H Minus Reverse Transkriptase Mischen, kurz zentrifugieren, 60 Minuten bei 42 C inkubieren Reaktion bei 70 C für 10 Minuten abstoppen Mit 20 µl ddh 2 O verdünnen 9. Restriktionsverdau der PCR-Produkte aus Schritt 5 vom Vortag a) Restriktionsverdau der PCR-Fragmente für die PI-Allel PCR 10

11 1 x Reaktionsansatz Mastermix PCR-Produkt 15 µl X 10 x Reaktionspuffer Tango 1fach konzentrierter Puffer µl Enzym BseGI 0,5 µl Gesamtvolumen 20 µl mit ddh 2 O auffüllen µl Ähnlich wie bei der PCR soll auch hier ein Master-Mix, der alle Reaktions-komponenten mit Ausnahme des PCR-Produkts enthält, angesetzt werden Nach Zugabe des Enzyms und nochmals nach Zugabe des PCR-Produkts Reaktionsansatz gut mischen (vortexen) Inkubation der Reaktion für 1,5 h bei 55 C Zugabe von 5 µl Ladepuffer zur Gesamtreaktion 20 µl dieses Gemisches auf 1 % (w/v) Agarose-Gel auftragen Außerdem pro Gel in separaten Slots auftragen (Proben werden bereitgestellt): Zur Größenabschätzung: 6 µl DNA-Marker Erwartung: Bandengröße für WT-Allel: 320 bp mutantes Allel: 670 bp b) Restriktionsverdau der PCR-Fragmente für das AP3-Allel 1 x Reaktionsansatz Mastermix PCR-Produkt 15 µl X 10 x Reaktionspuffer G 1fach konzentrierter Puffer µl Enzym MunI 0,5 µl Gesamtvolumen 20 µl mit ddh 2 O auffüllen µl Ähnlich wie bei der PCR soll auch hier ein Master-Mix, der alle Reaktionskomponenten mit Ausnahme des PCR-Produkts enthält, angesetzt werden Nach Zugabe des Enzyms und nochmals nach Zugabe des PCR-Produkts Reaktionsansatz gut mischen (vortexen) Inkubation der Reaktion für 1,5 h bei 37 C Zugabe von 5 µl Ladepuffer zur Gesamtreaktion 20 µl dieses Gemisches auf 2,5 % (w/v) Agarose-Gel auftragen Außerdem pro Gel in separaten Slots auftragen (Proben werden bereitgestellt): Zur Größenabschätzung: 6 µl DNA-Marker Erwartung: Bandengröße für WT-Allel: 177 bp mutantes Allel: 208 bp 10. semiquantitative Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) Die RT-PCR dient der Abschätzung des Expressionslevels eines Gens in einem bestimmten Gewebe. Dafür wir RNA aus dem entsprechenden Gewebe isoliert und in cdna umgeschrieben. Ausgehend von diesem cdna-pool können dann PCR-Analysen mit verschiedenen, genspezifischen Primern durchgeführt werden. Die Menge des erhaltenen Fragments ist nach Abgleich mit einer internen Kontrolle (APT1) mit der Menge an RNA-Transkript korreliert. 11

12 Jede Gruppe untersucht die Expression von a) APT1 (ADENOSINE PHOSPHOTRANSFERASE1; Haushaltsgen, das in allen Geweben mehr oder weniger gleich stark exprimiert wird) b) AP3 c) PI in Pflanzen mit folgendem Genotyp: cdna Nummer Gruppennumer Genotyp der Pflanzen AP3/AP3; PI/PI Wildtyp ap3/ap3; PI/PI ap3 homo AP3/ap3; PI/PI ap3 hetero AP3/AP3; pi/pi pi homo AP3/AP3; PI/pi pi hetero Durchführung: - jede Gruppe verwendet, wie im Arbeitsplan beschrieben, ein cdna-pool - für diesen Pool werden PCRs durchgeführt, um AP3, PI und APT1 zu amplifizieren; Negativkontrollen für jedes Primerpaar nicht vergessen also 6 PCRs pro Gruppe - Primerpaare für die RT-PCR: (1) AP3fwd RT-PCR; AP3rev RT-PCR (2) PIfwd RT-PCR; PIrev RT-RCR (3) APT1fwd RT-PCR; APT1rev RT-PCR Konzentration bzw. Menge im Reaktionsansatz Reaktionspuffer 1fach 10fach dntps 0,2 mm 2 mm forward Primer 1 µm 5 µm Ausgangskonzentration µl im Reaktionsansatz reverse Primer 1 µm 5 µm taq-polymerase 0,75 units 1 unit/µl cdna-lösung 1 µl -- Gesamtvolumen (mit ddh 2 O auffüllen) 25 µl -- - PCR-Programm: 95 C 5 min 95 C 30 sec 58 C 45 sec 25x 72 C 45 sec 72 C 10 min 11. Restriktionsverdau auf Agarose-Gel auftragen o Welchen Genotyp besitzen die von Ihnen analysierten Pflanzen? Wie ist dieser mit dem Phänotyp korreliert? 12. RT-PCR auf Agarose-Gel auftragen und analysieren - Nach der PCR werden die Reaktionen mit je 6 µl Ladepuffer versetzt, 15 µl dieser Lösung werden auf ein 1%iges Agarose-Gel aufgetragen. - pro Gel 6 µl Marker zur Größenabschätzung mit auftragen 12

13 - Erwartete Bandengrößen: - AP3: 503 bp - PI: 157 bp - APT1: 554 bp a. Ergebnisse aller Gruppen zusammentragen und analysieren (gemeinsame Auswertung) o o o Tragen Sie die Ergebnisse der genotypischen und phänotypischen Analyse aller Gruppen zusammen. Welche Aufspaltung erwarten Sie bei der Selbstung von AP3/ap3- bzw. PI/pi- Eltern? Wie decken sich diese Erwartungen mit dem Ergebnis? Erläutern Sie mögliche Ursachen für eventuelle Abweichungen. Können Sie aus der genotypischen und phänotypischen Analyse der Pflanzen Rückschlüsse auf die Vererbungsform der AP3 oder PI-Allele treffen? Werden die mutanten Allele dominant oder rezessiv vererbt? Begründen Sie ihre Schlussfolgerung. Tragen Sie die Expressionsmuster von AP3 und PI aller Gruppen zusammen. Geben Sie eine mögliche Erklärung für das beobachtete Expressionsmuster an. 13