Protokoll über das mikrobiologische Praktikum

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Wintersemester 2002/03 Seite 1/1 an der LMU München, Lehrstuhl für Mikrobiologie Prof. Dr. V. Müller, Gruppe C 13 Assistent: Tobias Kraxenberger Protokoll über das mikrobiologische Praktikum Zeitraum 3. März bis 14. März 2003 Versuch 1: Eigenisolate Im Laufe des Praktikums sollte jeder Student eigene Bakterien als Luftkeime sammeln, isolieren, analysieren und bestimmen. Am ersten Kurstag haben wir mit verflüssigtem HD-Agar (Hefe-Dextrose-Medium), einem Komplexmedium, das Pepton als Aminosäure-Quelle beinhaltet, pro Gruppe fünf Platten gegossen. Eine davon wurde als Sterilkontrolle bis zum vierten Kurstag bei 30 C inkubiert. Mit weiteren Platten haben wir Proben von Luftkeimen, z.b. aus dem Kühlschrank bzw. vom Schreibtisch genommen und bei 30 C für 3 Tage inkubiert. Bei einigen Studenten sind sehr bunte und unterschiedliche Kolonien gewachsen, bei anderen war der Agar einheitlich, dafür aber zahlreich bewachsen. Dies ist u.a. abhängig vom Ort der Probennahme und dessen Verschmutzungsgrad. In meiner Gruppe haben nur sehr wenige Keime Kolonien gebildet. Dies liegt wahrscheinlich an relativ sauberen Standorten. Mein Partner und ich haben vier verschiedene Kolonien, darunter eine gelbliche und eine weiße Kultur, mit der Impföse zur Vermehrung in je ein Reagenzglas mit Nährlösung gegeben und weiter bebrütet. Nach einer ersten Vorauswahl bezüglich Form, Größe, Beweglichkeit, Farbe und Gram-Färbung wurden von zwei Kolonien Reinigungsausstriche gemacht und über Nacht bebrütet. Jeweils eine einzelne Kolonie davon wurde in einem Kulturröhrchen weiter vermehrt. Am siebten Praktikumstag haben wir die einzelnen Kolonien nochmals auf Gramfärbung, Form und Beweglichkeit überprüft, und entsprechend den Anweisungen der Saalassistenten diverse Röhrchen und Agarplatten mit verschiedenen Medien für individuelle Testreaktionen beimpft. Bei meinem Eigenisolat aus dem Kühlschrank handelte es sich um sehr bewegliche, teils v-förmige Stäbchen. Die Gramfärbung verlief negativ. Deswegen beimpfte ich für weitere physiologische Testreaktionen je eine Caseinat-Agarplatte, Stärke-Agarplatte, Citrat-Agarplatte, EMB-Platte und zwei HD-Platten. Dazu kamen noch je ein Peptonwasserröhrchen, O/F-Testmedium, Nitratröhrchen + Kontrolle, Brila-Röhrchen, Harnstoffröhrchen und ein HD-Röhrchen. Mein Partner, Stephan Behl, hatte gram-positive unbewegliche Kokken, die teils zu Tetraden vereint waren. Er beimpfte ebenfalls je eine Caseinatplatte, Stärke-Agarplatten, Eigelb-Tellurit-Lithiumchlorid-Agarplatte, und weitere Platten und Röhrchen.

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 2/2 Die genauen Anleitungen für diese Testreaktionen stehen im Praktikumsskript und werden auch hier im Protokoll bei den verschiedenen Versuchen weiter unten erklärt. Deswegen möchte ich zu diesem Zeitpunkt nicht weiter auf die jeweiligen Abläufe der Reaktionen eingehen. Am letzten Kurstag haben wir die bebrüteten Platten und Röhrchen ausgewertet. Nach den Angaben im Skript zur Bestimmung von Bakterien, und den Auswertungen und Übereinstimmungen der eigenen Testresultate konnten wir die isolierten Organismen eindeutig als Micrococcus (Stephan Behl) und Pseudomonas (Stefan Rösel) identifizieren. Nachfolgend tabellarisch die Testergebnisse. Eigenisolat Stefan Rösel Eigenisolat Stephan Behl Form, Bewegung Bewegliche Stäbchen Form, Bewegung unbewegliche Kokken Gram-Färbeverhalten gram-negativ Gram-Färbeverhalten gram-positiv O/F-Test oxidativ, keine Säurebildung O/F-Test oxidativ, keine Säurebildung Stärkeabbau + Stärkeabbau Caseinabbau + Caseinabbau + Citratverwertung Telluritverwertung Peptonwasser Mannit-Rhodanit Brila-Röhrchen Blutagar Harnstoff Eigelb-Tellurit Nitrat u. Kontrolle Katalase + Oxidase + Bunte Reihe Glucose Katalase + Saccharose Wachstum auf EMB Mannit Identifiziertes Bakterium: Pseudomonas Micrococcus Eine genauere Einteilung und Zuordnung zu einer Art konnten nicht vorgenommen werden, da zu wenige Daten über weitere Testreaktionen vorhanden waren. Eine genauere Untersuchung der Eigenisolate hätte sicherlich den zeitlichen und finanziellen Rahmen des Praktikums gesprengt. Versuch 2: Milchanalyse Milch aus dem Euter einer Kuh ist an sich keimfrei; sie wird jedoch beim Melken, Abfüllen, Transport oder durch längeres Stehenlassen von Mikroorganismen kontaminiert. In den meisten Fällen sind dies Milchsäurebakterien. Bei der Milchanalyse wird ermittelt, ob und welche Mikroorganismen sich in der Milch befinden. Hierzu haben wir aus Rohmilch, pasteurisierter Milch und Joghurt

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 3/3 jeweils eine Verdünnungsreihe hergestellt. Dabei wurde die Probe mit Saline, einer NaCl-Salzlösung, auf 10-1, 10-2 und 10-3 verdünnt und anschließend davon Proben von jeweils 100 µl mittels dem Kochschen Plattengußverfahren auf Chinablaulaktose-Agar ausplattiert. Hierbei erhöht sich die Verdünnungsstufe um den Faktor 0,1. Dieses weißlich-blaue Medium dient als ph-anzeiger, Lactose als C-Quelle. Säurebildende Organismen färben die Platte blau an, alkalische Bakterien, die Aminosäuren verwerten und dabei Ammoniak freisetzten, dagegen gelb. Nach 3 Tagen bei 30 C ergaben sich folgende Koloniezahlen: Rohmilch Pasteurisierte Milch Joghurt Gruppe Verd. sauer neutral alkalisch s n a s n a A 10-2 4000 < 20 0 0 0 0 nicht zählbar 10-3 < 20 < 20 0 0 0 0 nicht zählbar 10-4 < 20 0 0 0 0 0 nicht zählbar B 10-2 1900 800 0 0 0 0 nicht zählbar 10-3 0 < 20 0 0 0 0 nicht zählbar 10-4 < 20 0 0 0 0 0 nicht zählbar C 10-2 43000 28000 0 0 0 0 nicht zählbar 10-3 92000 48000 24000 0 0 0 nicht zählbar 10-4 < 20 < 20 0 0 0 0 nicht zählbar Die genaue Betrachtung dieser Zahlen zeigt, dass in der Rohmilch etliche Keime enthalten waren. Dies waren z.b. 40 bzw. 19 Kolonien in der niedrigsten Verdünnungsstufe von Gruppe A und B. Bei größeren Verdünnungen war jedoch die genaue Anzahl nicht auswertbar, da sich oft nur wenig Kolonien auf dem Agar befunden haben. Sind es zu wenige Bakterien, die auf einer Agarplatte ausgekeimt sind, also weniger als ungefähr 20 zählbare Kolonien, so kann kein statistisch korrekter Wert ermittelt werden. Gruppe C hatte einen Rest von der Rohmilch der Vormittagsgruppe. Hier befanden sich außer den rd. 5 10 6 Milchsäurebakterien noch weiter Mikroorganismen. Diese bildeten entweder einen neutralen oder einen alkalischen Hof. In der pasteurisierten Milch wuchsen erwartungsgemäß keine oder nur sehr wenige Bakterien. Der Joghurt hingegen enthielt so viele Milchsäurebakterien, dass hier der ganze Agar tief blau gefärbt war, es ließen sich selbst in der stärksten Versdünung keine einzelnen und abgegrenzten Kolonien zählen. Die hier gewonnen Ergebnisse zeigen ein in sich geschlossenes sinnvolles Gesamtbild. Die Rohmilch war mit verschiedene Mikroorganismen, sowohl Milchsäurebakterien als auch mit anderen Bakterien, die keine Säure produzieren, kontaminiert. Bei längerem Stehenlassen haben sich diese stark vermehrt. In der pasteurisierten Milch sind die vorhandenen Mikroorganismen abgetötet worden, im Joghurt hingegen sind Milchsäurebakterien, z.b. Lactococcus oder Lactobacillus enthalten und erwünscht, um den enthaltenen Milchzucker (Lactose) in Milchsäure (Lactat) zu vergären.

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 4/4 Versuch 3: Anreicherungen a) Azotobacter auf Mannitagar Azotobacter ist ein freilebender Stickstofffixierer, der u.a. im Boden vorkommt. Er kann angereichert werden, indem man ihn entweder auf einem Nährboden aufzieht, der selektiv für diesen Mikroorganismus ist, oder der aufgrund seiner Zusammensetzung nur von ihm bevorzugt bewachsen wird. Bei Azotobacter ist dies z.b. ein Mannit-Agarboden. Dieser enthält keinen gebundenen Stichstoff, weder als Nitrat oder Nitrit, noch als Aminosäuren. Die N 2 -Fixierung erfolgt über einen Enzymkomplex, der die Nitrogenase (α 2 β 2 ) und die Nitrogenase-Reduktase (α 2 ) beinhaltet. Da diese Enzyme O 2 -sensitiv sind, bildet Azotobacter zum Schutz Heterocysten und eine Schleimschicht. Zur Versuchsdurchführung wurde frische Erde auf Mannit-Agar gestreut und bei 30 C bebrütet. Nach einem Reinigungsausstrich der schleimigen Kolonien konnten am vorletzten Tag Tuschefärbungen vorgenommen werden, bei der man die Schleimkapseln gut erkennen konnte. b) Clostridium in Kartoffel Clostridien sind anaerobe Endosporenbildner und kommen u.a. im Boden vor. Bei diesem Demonstrationsversuch wurde eine ungewaschene, erdige Kartoffel vom Assistenten mit einem Messer mehrmals eingestochen und somit die stärkehaltige Knolle mit Clostridien beimpft. Diese bilden anaerob Buttersäure und weitere Gase, deswegen wurde der Standzylinder mit Wasser befüllt und in den Abzug gestellt. Um die Clostridien auch wirklich nachzuweisen, wurden von der nach einigen Tagen aufgetriebenen Kartoffel Proben entnommen, in verflüssigten Nähragar eingeimpft und bei 80 C im Wasserbad für 10 Minuten inkubiert. Dieser Vorgang des Weinzirltests tötet anaerobe vegetative Zellen ab. Nur Endosporen von Clostridium können diese Prozedur unbeschadet überdauern und bei weiterer Bebrütung Buttersäure und Gase bilden. Dies zeigt sich am Aufplatzen des dann erstarrten Agars. Die Endosporen können auch mittels der Phasenkontrastmikroskopie oder einer speziellen Färbetechnik mit Malachitgrün identifiziert werden. c) Streptococcus salivarius auf Saccharoseagar Mit einem Wattestäbchen wurden Abstriche vom Zahnhals jedes Kursteilnehmers genommen und auf Saccharoseagar aufgetragen. Diese Platten wurden dann bei 37 C bebrütet, um den Dextran- bzw. Laevanbildner anzureichern. Nach einem Vereinzeln der Kultur durch einen Reinigungsausstrich konnten wir eine Bunte Reihe beimpfen. Die Bunte Reihe besteht aus einem Medium mit ph-indikator und je einem der verschiedenen Zucker Glucose, Saccharose und Mannit. Kann ein Organismus diesen Zucker vergären, so zeigt Gelbfärbung des ph-indikators Säurebildung an. Ein Vergleich mit bekannten Organismen erlaubt eine genauere Klassifizierung des

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 5/5 isolierten Mikroorganismus. Hierzu hat der Assistent Positiv- bzw. Negativkontrollen angefertigt. Untersuchung auf Vergärbarkeit Glucose Saccharose Mannit Lactobacillus plantarum + + + Lactobacillus curvatus + Lactobacillus casei + + Streptococcus salivarius + + Isolat Rösel Isolat Behl + Die Eigenschaften der Isolate von meinem Partner Stephan Behl und mir sind mit keinem der Vergleichsorganismen identisch, sie sind deswegen nicht eindeutig identifizierbar. Um sie genauer klassifizieren zu können, wären weitere Untersuchungen nötig gewesen. Dies ist jedoch aus Zeitgründen im Rahmen des Praktikums leider nicht möglich. d) Staphylococcus aureus auf Telluritagar Zur Isolierung von S. aureus wurden mit Wattestäbchen Abstriche der Ohren- und Nasenschleimhäute genommen und auf rotem Telluritagar aufgetragen. Auch diese Platten wurden bei 37 C bebrütet und am dritten Kurstag ein Kulturröhrchen mit HD- Nährlösung angesetzt. Staphylococcen besitzen die Fähigkeit, Tellurit zu metallischem Tellur zu reduzieren, und sind somit gut schwarz erkennbar. S. aureus S. epidermidis Vorkommen Haut, Nase, Rachen Ohr Pigmente gelb Coagulase + Hämolyse + Für die Unterscheidung zwischen den Arten S. aureus und S. epidermidis gibt es neben der Reduktion und Schwarzfärbung von Tellurit zu Tellur verschiedene Test, u.a. den Test auf Coagulase und auf Hämolyse. Bei der Coagulase-Reaktion wurden 0,3 ml Kaninchenblutplasma, dem zur Vermeidung der Gerinnung Citrat, Oxalat oder EDTA zugesetzt wurde, etwa 0,1 ml einer flüssigen Staphylokokkenkultur zugesetzt und bei 37 C im Wasserbad inkubiert. Nach einigen Stunden haben die Coagulase-positiven Staphylokokken das Plasma gerinnen lassen. Zur Bestimmung der Hämolyse wurden Blutagarplatten, Eigelb-Tellurit-LiCl- Agarplatten und Mannit-Rhodanit-Platten mit einem Impfstrich beimpft und ebenfalls bei 37 C bebrütet. Beim Blutagar zeigte sich zu einem späteren Zeitpunkt ein klarer Hof, bedingt durch die Lyse der Erythrozyten und der Zersetzung des Blutfarbstoffes. Man spricht dann von der β-hämolyse (im Gegensatz zur α-hämolyse, bei der nur eine Vergrünung auftritt). Beim Eigelbagar weist ein klarer Hof um die Kolonie auf die Anwesenheit von Proteasen, einem von zahlreichen Exoenzymen, hin, ein käsiger Niederschlag weist Lecithinasen nach. Den Mannit-Phänotyp erkennt man, wenn sich die Kolonie bzw. der Agar auf dem entsprechenden Medium gelb verfärbt. Die von mir angereicherten und isolierten Staphylokokken zeigten alle Eigenschaften von S. aureus, also Hämolyse +, Coagulase + und Mannit +.

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 6/6 Versuch 4: Mikroskopie Zur Untersuchung von Zellformen verschiedener Bakterienarten haben wir uns der Mikroskopie und einfachen Färbemethoden bedient. Hierzu wurden Reinkulturen verschiedener Mikroorganismen, u.a. Escheria coli, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Streptococcus salivarius, mittels Hitzefixierung auf Objektträger aufgetragen und anschließend mit Safranin oder Methylenblau eingefärbt und unter dem Mikroskop betrachtet. Färbeanleitung siehe Praktikumsskript. E. coli M. luteus (kurze Stäbchen) (vereinzelte Kokken, Tetraden) B. subtilis (Heubacillus) S. aureus (lange Stäbchen) (Haufenkokken) P. mirabilis Str. salivarius (Kurzstäbchen) (Kokken in Ketten) Versuch 5: Bakterielles Wachstum Bakterien vermehren sich durch Zweiteilung. So können aus wenigen Ursprungsbakterien in kurzer Zeit rasch sehr viele Bakterien heranwachsen. Um dies genauer studieren zu können, werden Wachstumsversuche analysiert. Hierbei ist der Unterschied zwischen Bakterienzahl und Bakterienmasse zu beachten. Bei dieser Versuchsgruppe sollte das Wachstum von E. coli in Abhängigkeit von verschiedenen Temperaturen gemessen werden. Die Messung der Massenzunahme erfolgte im Photometer anhand der Absorption von Licht mittels der Bestimmung der Optischen Dichte (OD) bei 580 nm. Die einzelnen Gruppen des Praktikums sollten bei unterschiedlichen Temperaturen messen. Es wurden 100 ml HD-Kulturen von E. coli im Wasserbad mit Temperaturen von 27 C, 37 C und 46 C (nicht bei 42 C wie im Praktikumsskript angegeben) inkubiert und in zeitlichen Abständen vom 20 Minuten Proben entnommen und im Photometer bei 580 nm gemessen. Bei 42 C wäre das Wachstum nicht eindeutig genug von einem der beide anderen Temperaturen unterscheidbar gewesen. Die OD 580 - Werte aller Gruppen des Praktikumssaales wurden an der Tafel zusammengetragen und sind in folgender Tabelle aufgeführt:

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 7/7 Gruppe E Gruppe D Gruppe A Gruppe B Gruppe C Zeit 27 C 27 C 37 C 37 C 46 C 0 0,068 0,066 0,081 0,067 0,070 20 0,066 0,059 0,112 0,130 0,130 40 0,079 0,077 0,187 0,228 0,147 60 0,101 0,099 0,392 0,440 0,233 80 0,121 0,124 0,746 0,696 0,342 100 0,157 0,165 1,450 1,340 0,560 120 0,215 0,235 1,911 1,270 0,720 150 0,330 0,346 3,078 3,000 1,200 Die Werte für je eine Temperatur sind anbei auch graphisch auf halblogarithmischem Papier dargestellt. Die Kurve von E. coli bei 37 C, dem Wachstumsoptimum, zeigt ausgehend von einem ähnlichen Ursprung wie auch die anderen Kulturen, die größte Steigung, und somit die schnellste Massenzunahme, was einem sehr schnellen Wachstum entspricht. Das Wachstum bei 46 C ist geringer, liegt jedoch über dem von 27 C. Auch hier nimmt die OD zu. Um eine weitere Auswertung erstellen zu können, habe ich vom Computer eine exakte Ausgleichsgerade für meine Gruppe (Wachstum bei 46 C) errechnen lassen. Wachstumskurve E.coli 46 C 10,000 1,000 OD (580nm) 0,100 0,010 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Die Wachstumsrate µ errechnet sich nach µ = Zeit [min] log m1 log m loge ( t1 t 0) Nach obigen Zahlenwerten ergibt sich µ = 1,1282 /h und t D = 0,614 h aus t D = 0. ln 2 µ.

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 8/8 Der Wert der Wachstumsrate pro Stunde von µ kann auch graphisch aus der Steigung des Graphen entnommen werden; es sind dann die Differenz zweier Werte der Massenzunahme in Relation mit der Differenz der Zeit zu setzen, was der Steigung der Geraden entspricht. µ hat die Dimension Teilungen pro Stunde. Die Massenverdopplungszeit t D gibt die Zeit an, in der sich die Bakterienmasse verdoppelt hat, und ist der reziproke Wert von µ multipliziert mit ln 2. Bei der Bestimmung der Lebendkeimzahl nach 150 Minuten wurden 0,1 ml-proben von E. coli der Verdünnungen von 10-5, 10-6 und 10-7 auf HD-Agar ausplattiert und bei 37 C inkubiert. Nur noch lebende Zellen können sich vermehren und Kolonien bilden. Diese wurden dann nach 2 Tagen ausgezählt. Es wurden Koloniezahlen zwischen 30 und 300 entsprechend mit der Verdünnungsstufe verrechnet und die Lebendzellzahl pro Milliliter angegeben. In Gruppe C bei 46 C konnten wir 74 einzelne Kolonien in der umgerechneten Endverdünnung 10-6 zählen. Folglich befanden sich in 1 ml der Probe 7,4 10 7 Zellen. Bei der Bestimmung der Gesamtkeimzahl werden hingegen auch tote Lebewesen erfasst. Nach 150 Minuten Wachstum bei den jeweiligen Temperaturen wurden 0,1 ml der Probe mit 0,9 ml Formol versetzt, was die Beweglichkeit der lebenden und beweglichen Bakterien herabsetzen soll, und in eine Thoma-Zählkammer transferiert. Unsere Gruppe mit der 46 C-Kultur hat in einem Großquadrat folgende Bakterienzahlen gezählt: 58, 57, 59, 60 64 und 53. Der Mittelwert ist 58,5. Das Volumen eines solchen Quadrates ist 0,2 mm 0,2 mm 0,1 mm = 0,004 mm 3. Daher ergibt sich für die Gesamtkeimzahl folgender Wert: 58,5 : 4 10 10 6 16 = 2,34 10 9. Dieser Wert ist natürlich größer als die Lebendkeimzahl. Nachfolgend eine Tabelle mit den Werten der anderen Gruppen des Saales für Optische Dichte (OD), Gesamtkeimzahl (GKZ), Lebendkeimzahl (LKZ), Wachstumsrate µ und Massenverdopplungszeit t D. GKZ, LKZ und OD 580 nach 150 Minuten. T OD 580 GKZ LKZ µ t D Gruppe A 37 C 3,039 1,68 10 9 1,16 10 9 1,61/h 0,43h Gruppe B 37 C 3,000 1,04 10 9 4,64 10 7 1,38/h 0,50h Gruppe C 46 C 1,200 2,34 10 9 7,40 10 7 1,13/h 0,62h Gruppe D 27 C 0,346 1,50 10 8 2,26 10 7 0,89/h 0,77h Gruppe E 27 C 0,330 1,13 10 8 7,50 10 7 0,74/h 0,93h Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass die Bakterien der Gruppe A und B die höchsten Wachstumsraten pro Stunde haben, und folglich die kürzesten Verdopplungszeiten. Jedes Bakterien teilt sich statistisch alle 30 Minuten. Auch die OD mit über 3,0 ist deutlich von den anderen Werten abgesetzt. In der Kälte dagegen wächst E. coli nur sehr langsam und benötigt lange, um die Masse zu verdoppeln. Die Ergebnisse der Gruppe C mit der 46 C-Kultur sind dazwischen anzutreffen. Jedoch ist hier die Gesamtkeimzahl doppelt so groß wie bei der Optimumtemperatur und um den Faktor 10 größer als bei 27 C. Die Lebendzellzahl ist immer geringer als die Gesamtkeimzahl. Andere Werte möchte ich an dieser Stelle nicht weiter diskutieren.

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 9/9 Versuch 6: Sterilisation Bakterien wachsen unter optimalem Bedingungen sehr schnell und vermehren sich rasch. Wird das Nahrungsangebot aber knapp, können einige von ihnen, z.b. die Arten Bacillus und Clostridium, Dauerformen, sog. Endosporen, bilden. Diese sind auch gegen Hitzeeinwirkung und gegen Säure oder Austrocknen widerstandsfähig und gegen viele Chemikalien resistent. Gerade in der Lebensmittelindustrie ist aber die Hitzebeständigkeit von Endosporen ein großes Problem, denn die Endosporen überleben oft die Sterilisation und können dann später auskeimen. Die differentielle Hitzesensitivität von vegetativen Zellen und Endosporen sollte in diesem Versuch gezeigt werden. Es wurden drei Proben von E. coli und B. subtilis, der einmal auf HD-Agar angesetzt und einmal auf dem Minimalmedium Casein gezüchtet wurde, in 5 ml HD-Lösung überführt und in ein 80 C heißes Wasserbad gestellt. Zum Zeitpunkt 0 und nach 15, 30 und 60 Minuten wurden mit der Impföse Proben auf sektorierten HD-Agar ausgestrichen und bei 37 C über Nacht bebrütet. Bei der Auswertung sahen wir beim Nullwert, dass alle drei Bakterien gut angewachsen waren. Auf der Agarplatte nach 15 Minuten wuchsen nur noch die beiden Bacillus-Ausstriche, nach ½ Stunde bildete nur noch der auf der Caseinplatte herangewachsene B. subtilis Kolonien, ebenso nach einer Stunde. E. coli ist nicht hitzestabil, d.h. er kann bei großer Wärme nicht lange überleben. Die auf der Caseinplatte angezogene Kultur von B. subtilis ist, da es sich hierbei um einen Mangelnährboden handelt, sporuliert. Diese Dauerformen sind hitzestabil, die 80 C töten die Endosporen nicht ab. B. subtilis ohne Endosporen, also gewachsen auf HD- Böden, ertragen nur für kurze Zeit die Hitze, sie sind nach einer Sunde vollständig abgetötet. Die hier gewonnen Ergebnisse waren zu erwarten gewesen und sind auch in der Literatur so wieder zu finden. Versuch 7: Gramfärbung Im Spektrum der Bakterien gibt es ein wichtiges morphologisches Unterscheidungsmerkmal. Ein Teil der Bakterien besitzt eine dünne Mureinschicht auf der Zelloberfläche, andere hingegen besitzen eine sehr dicke Mureinschicht, die bis zu 40 Lagen eines Mureinnetzes auf der Zellhülle umfassen kann. Diese ist durch eine spezielle Färbetechnik, der Gramfärbung, anfärbar, und somit gram-positiv. Bei der Gramfärbung wird ein Farbstoffkomplex aus Kristallviolett und Jod in der Zelle fixiert und kann selbst durch starken Alkohol, in der Regel 96% Ethanol, nicht ausgewaschen werden. Die Zellen erscheinen dann blau-violett. Ist die Mureinschicht jedoch sehr dünn, kann das Farbstoffgemisch mit Alkohol leicht aus der Zelle entfernt werden und die Zelle mit Safranin rot angefärbt werden. Der Mikroorganismus ist dann gramnegativ. Im Praktikum wurden Escherichia coli und Micrococcus luteus auf einen Objektträger transferiert, hitzefixiert und erst mit Kristallviolett-Lösung, dann mit Lugolscher

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 10/10 Lösung gefärbt. Die Farbe wurde mit Alkohol ausgewaschen und das Präparat dann mit Safranin gegengefärbt. Der Objektträger wurde getrocknet. Die genaue Färbeanleitung ist auch im Praktikumsskript wieder zu finden. Unter dem Mikroskop konnten die Mikroorganismen nun betrachtet werden. Die Zellwand von E. coli färbte sich rot, somit ist E. coli gram-negativ, M. luteus färbte sich violett-blau und ist grampositiv. Bei weiteren Versuchen, z.b. bei Versuch 1, konnten wir nun diese Organismen als Positiv- bzw. Negativkontrolle für weitere Gram-Färbungen verwenden. Versuch 8: Wasseranalyse Wasser, egal ob aus Bächen, Flüssen, Seen oder Grundwasser, ist teils mehr oder weniger stark durch Mikroorganismen kontaminiert. Besonders in Trinkwasser dürfen keine schädlichen Keime enthalten sein. Deshalb sind Grenzwerte für Trinkwasserverunreinigungen erlassen worden. Die Messung und Einhaltung dieser Werte regelt in Deutschland eine Trinkwasserverordnung. Diese besagt, dass in 100 ml Trinkwasser keine E. coli-zelle enthalten sein darf, und dass in 1 ml Wasser eine Gesamtzellzahl von 100 nicht überschritten werden darf. Hierbei ist E. coli ein sog. Fäkalanzeiger, da er allgemein auf Darmbakterien, die Enterobakterien, hindeutet. Bei diesem Versuch sollten wir künstlich kontaminiertes Wasser auf die Anwesenheit von E. coli und Enterobacter aerogenes untersuchen. Mit 0,1 ml Wasser wurde eine Verdünnungsreihe erstellt, und Endverdünnungen von 10-4, 10-5 und 10-6 mit Hilfe eines Drigalski-Spatels auf Eosin-Methylenblau-Agar (EMB-Agar) ausplattiert. Dieser Agar enthält neben Pepton und Lactose als Kohlenstoff- und Aminosäure-Quelle und K 2 HPO 4 als ph-puffer auch Eosin Y, einem Farbstoffe, der das Wachstum von grampositiven Bakterien hemmt, und Methylenblau, ebenfalls einem Farbstoff, der als Reduktions- und Oxidationsmittel dient. Wie wir bereits aus vorangegangenen Versuchen wissen, sind E. coli und E. aerogenes gram-negative Bakterien. Mit dem EMB-Agar erreichen wir somit eine Selektion. Die Platten wurden zwei Tage bei 37 C bebrütet. Bei der Auszählung zeigten sich E. coli Kolonien grünlich-schwarz mit metallischem Glanz, während hingegen Enterobacter aerogenes-kolonien rosa mit rotem Punkt waren. Bei Verdünnungsstufe 10-4 wuchsen zu viele Kolonien, um sie eindeutig zu zählen, bei Verdünnungsstufe 10-5 haben sich 43 E. coli und 33 Enterobacter- Kolonien entwickelt. In der höchsten Verdünnung konnten wir jeweils 5 Kolonien zählen. Somit ergibt sich eine Gesamtkeimzahl von 4,3 10 6 bzw. 3,3 10 6 pro ml. Bei einem Demonstrationsversuch wurde uns die Membranfiltration erklärt. Hierbei wurde Flusswasser, entnommen aus einem Nebenfluss der Isar, mittels Unterdruck durch einen sterilen Filter mit bestimmter Porengröße gesaugt, und der Filter, in dem sich nun die Mikroorganismen befanden, auf einen Nährboden gelegt und inkubiert. Statt der für Trinkwasser vorgeschriebenen 100 ml Wasser zur Untersuchung auf E. coli hat unser Assistent nur ca. 10 ml Wasser verwendet, da das Bachwasser zwar klar erschien, aber sicherlich mehr verunreinigt war als Trinkwasser. Bei der Auswertung nach ca. einem Tag hat sich herausgestellt, dass das Flusswasser stark mit Mikroorganismen kontaminiert war und als Trinkwasser nicht verwendet werden sollte.

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 11/11 Eine einfachere Methode, die zu einem Schätzwert führt und zum Testen auf Abwesenheit von Keimen angewandt wird, ist die Bestimmung des "Colititers". Bei diesem statistischen Verfahren wird die "Höchstwahrscheinliche Keimzahl" (MPN) bestimmt. Hierzu wurden Brillantgrün-Röhrchen (BRILA Bouillon) mit enthaltenen Durhamröhrchen mit Proben der obigen Verdünnungsreihe zu den Endverdünnungen 10-5, 10-6, 10-7 und 10-8 beimpft und ebenfalls bei 37 C für 48 Stunden bebrütet. Der Versuchsansatz wurde pro Gruppe zweimal angesetzt, um bei einer Doppelmessung die Genauigkeit der Aussage zu optimieren. Bei der Auswertung wurden positive und negative Proben in folgender Abbildung festgehalten. Eine Probe ist dann positiv, wenn sich eine Trübung des Brillantgrüns eingestellt hat, und Gasbildung zu einer Blasenbildung in den Durham-Röhrchen geführt hat. Brillantgrün ist gleichzeitig ein Hemmstoff für gram-positive Bakterien. 10-5 10-6 10-7 10-8 2 2 1 0 Aus den beiden Stichzahlen 2 2 1 und 2 1 0 kann man aus der Tabelle im Praktikumsskript (Seite 46) die Keimzahl ablesen. Sie ist 70,0 bei 10-5 und 6,0 bei 10-6. Folglich ist die Höchstwahrscheinliche Keimzahl ungefähr 7 10 6. Die anderen Parallelgruppen haben ähnliche Werte erhalten. Nachfolgend eine Tabelle von allen Gruppen bezüglich der Keimzahlen von E. coli und Enterobacter aerogenes, der Gesamtkeimzahl und der höchstwahrscheinlichen Keimzahl (MPN). Auffällig ist, dass die ermittelten Lebendzellzahlen von E. coli und E. aerogenes in etwa bei allen Gruppen überein stimmen. Ebenso korreliert die MPN- Zahl der Brila-Röhrchen ganz gut mit den über die Gesamtkeimzahl ermittelten Werten überein. Dieses künstlich kontaminierte Wasser dürfte laut Trinkwasserverordnung nicht in Umlauf gebracht werden, die Grenzwerte für die Kontamination mit E. coli sind bei Weitem überschritten. E. coli E. aerogenes GKZ pro ml MPN (Barila) Gruppe A 5,5 10 6 4,7 10 6 1,0 10 7 6 10 6 Gruppe B 3,6 10 6 3,5 10 6 7,1 10 6 6 10 6 Gruppe C 4,3 10 6 3,3 10 6 7,6 10 6 6 10 6 Gruppe D 7,6 10 6 9,1 10 6 1,6 10 7 7 10 7 Gruppe E 1,1 10 7 8,6 10 6 1,9 10 7 2,5 10 7 Ein weiteres Testverfahren zur Unterscheidung zwischen E. coli und E. aerogenes ist der IMViC-Test. Hierbei steht I für Indolbildung aus Tryptophan, M für Methylrot- Probe, V für Voges-Proskauer-Test, einem Nachweis auf Acetoin, und C für die Fähigkeit zur Citratverwertung. Zum Indolnachweis wurde je ein Reagenzglas mit Peptonwasser und den zu untersuchenden Bakterien beimpft und 1 bis 2 ml Kovacs-Reagenz hinzugefügt. Eine Rotfärbung der oberen organischen Phase ist ein positiver Nachweis für die Bildung von Indol aus Tryptophan mittels der Tryptophanase. Bei negativem Verlauf ist

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 12/12 lediglich eine leichte Phasentrennung erkennbar, beide Flüssigkeiten bleiben blass gelblich. Für E. coli ist der Nachweis positiv verlaufen, für E. aerogenes negativ. Methylrot als Indikator soll die anaerobe Bildung von Säure aus Zucker anzeigen. Die beiden Organismen wurden in HD-Röhrchen transferiert und bebrütet. Die Zugabe von ca. 1 ml Methylrot als ph-indikator mit Umschlag von gelb bei ph = 6,0 nach rot bei ph = 4,5 zeigt an, ob das jeweilige Bakterium Säure produziert hat. Da dies anaerob geschehen soll, darf nicht geschüttelt werden. Der Nachweis bei E. coli ist hierfür positiv, bei E. aerogenes negativ. Der Voges-Proskauer-Test dient dem Acetoin-Nachweis. Pyruvat kann zu Acetoin synthetisiert werden; dieses kann weiter zu 2,3-Butandiol oder zu Diacetyl umgesetzt werden. Bei diesem Test wurde ebenso wie bei vorigem Test je ein HD-Röhrchen ohne zu schütteln mit den beiden Kulturen beimpft und die Lösungen α-naphthol und Kreatin mit einer KOH-Lösung, wie im Praktikumsskript angegeben, hinzu gegeben. Nach gut 10 bis 20 Minuten im Wasserbad bei 60 C zeigte eine leichte Rotfärbung bei E. aerogenes den positiven Verlauf des Tests an. Bei der Citratverwertung wurde je eine Citratagarplatte mit den beiden Organismen mit einem Impfstrich beimpft und lange genug bebrütet. Ein Umschlag des Indikators von anfangs grün nach blau zeigt Alkalisierung und damit die Aufnahme von Natriumcitrat und von Protonen an. Die entsprechende Bakterien können Citrat verwerten. Dies ist bei E. aerogenes der Fall, bei E. coli jedoch nicht, hier lieferte der Test kein positives Ergebnis. Die folgende Tabelle gibt kurz zusammengefasst die ermittelten Testergebnisse wieder. Auch eine Diskussion mit dem Assistenten und die Fachliteratur bestätigen nun unsere Erkenntnisse. Somit lassen sich die beiden Mikroorganismen E. coli und Enterobacter aerogenes, z.b. isoliert aus Wasserproben, mit Hilfe des IMViC-Tests leicht und sicher von einander unterscheiden. I M V C E. coli + + E. aerogenes + + Gerade im medizinisch-klinischen Labor ist es wichtig, schnell und einfach Bakterien zu diagnostizieren und sicher zu bestimmen. Mit dem Enterotube II der Fa. Roche ist dies möglich. Dieses Röhrchen bietet unterschiedliche Testverfahren zur Unterscheidung von Enterobakterien an, z.b. Nachweise auf Harnstoffabbau, Glucose- und Citratverwertung, Indolnachweis, Voges-Proskauer-Test u.v.m. Ein kleiner Teil einer Bakterienkolonie wird mit einer beiliegenden Impföse durch das ganze Röhrchen gezogen und alle Kammern, die mit verschiedenen Nährböden gefüllt sind, beimpft. Nach Bebrüten ist am Farbumschlag der einzelnen Nährmedien und einer Farbcode-Tabelle jeweils das positive oder negative Testergebnis ablesbar. Der unbekannte Bakterienstamm unserer Bankreihe zeigte einen Farbumschlag bei Glucose und Ornithin. Der Test verlief jedoch negativ bei der Aminosäure Lysin. Mit Hilfe eines patentierten Zahlencodes, der aus der Auswertung aller Testergebnisse zusammengesetzt ist, bei unserem Versuch 66007, konnte der uns unbekannte Organismus als Proteus mirabilis identifiziert werden.

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 13/13 Versuch 9: Morphologische Diversität Um die große Vielfalt an Bakterien und deren äußeren Unterschiede zu untersuchen, bedient man sich der Mikroskopie. Besonders unter dem Phasenkontrastmikroskop sind Zellformen, Beweglichkeit und viele weitere Merkmale gut erkennbar. Bei Lebendpräparaten wird nicht gefärbt. Rhodospirillaceae: Rhodospirillum rubrum (länglich, unregelmäßig verdickt, hohe Beweglichkeit) Cyanobacteriaceae: Oscillatoria (länglich, fadenartig, mehrzellig, schwingende Bewegungen) Nostoc mit NO 3 - (lange Ketten, teils einzeln, Kokken) Nostoc ohne NO 3 - (Kokken in Ketten, Heterocysten zur N 2 -Fixierung) Anabaena mit NO 3 - (lange Ketten, Kokken, keine Heterocysten)

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 14/14 Anabaena ohne NO 3 - (lange Ketten, längliche Zellen, Heterocysten) Coryneforme Bakterien: Arthrobacter globiformis (exponentielle Phase) (längliche Kugeln bis Stäbchen, einige v-förmig) Arthrobacter globiformis (stationäre Phase) (längliche Stäbchen) Arthrobacter citreus (exponentielle Phase) (große Kokken bis längliche Stäbchen, doppelt bzw. v-förmig) Arthrobacter citreus (stationäre Phase) (sehr kleine, einzelne Kokken, teils Diplokokken) Streptomycetaceae: Streptomyces (luftiges, netzartiges Geflecht, lange einzelne Fäden)

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 15/15 Versuch 10: Biochemisch-physiologische Testreaktionen Zur genauen Bestimmung von Bakterien bedient man sich biochemischphysiologischger Testreaktionen. Die Vergärung von Kohlehydraten wurde in Versuchsgruppe 3 am Beispiel der Bunten Reihe von Streptococcus salivarius bzw. anderer Milchsäurebakterien dargestellt. Bei der Stärke-Hydrolyse wurde eine Stärke-Agarplatte mit Escherichia coli, Bacillus subtilis und Bacillus megaterium beimpft und mehrere Tage lang bei 30 C bebrütet. Zur Auswertung wurde die Platte mit Lugolscher Lösung beschichtet. Das darin enthaltene Jod geht mit der Stärke eine Einschlussverbindung ein und erscheint dunkel violett. Können die Mikroorganismen Stärke durch Exoenzyme, z.b. Amylasen, abbauen, so bleibt um die Kolonien abgegrenzt ein heller Hof, denn hier befindet sich dann keine Stärke mehr. Bei B. subtilis konnten wir einen großen hellen Hof erkennen, bei B. megaterium einen kleinen Hof. E. coli ist aber nicht in der Lage, Stärke extrazellulär abzubauen. Zum Nachweis von Proteasen nutzten wir die Casein-Hydrolyse. Hierzu beimften wir sektorierte Caseinplatten mit E. coli, B. subtilis, M. luteus, Brevibacterium linens und Kulturen von der Rinde einer Scheibe Limburger. Nach einigen Tagen bei 30 C im Brutschrank wurden die Platten zur Auswertung anstelle von Schwefelsäure mit Salzsäure beschichtet. Diese trübt die Agarplatte, da Casein, ein Protein, durch starke Säurezugabe wie auch durch Hitze denaturiert. Sind die Mikroorganismen im Besitz von Proteasen, so können sie Proteine, also Casein, abbauen, und die gewonnenen Aminosäuren aufnehmen. Dies äußert sich darin, dass ebenfalls um diese Kolonien sich ein klarer Hof bildet, der sich gut vom milchig trüben Agar unterscheiden lässt. Positiv für den Besitz von Proteasen sind B. subtilis, Brevibacterium linens und die Kulturen vom Limburger. E. coli und M. luteus konnten die angebotenen Proteine nicht verwerten. Zusammenfassend eine Übersicht über die Möglichkeit des Stärkeabbaus bzw. des Caseinabbaus der untersuchten Mikroorganismen. E. coli B. subtilis B. megat. M. luteus B. linens Käse Stärke + + + Casein + + + + Der O/F-Test soll das verhalten von Mikroorganismen zu Sauerstoff demonstrieren und Säureproduktion über ph-wert-änderungen anzeigen. Das O/F-Testmedium enthält Pepton, Hefeextrakt, Glucose, Bromkresolpurpur und Agar. In dieses Medium wurde mit einer langen Impfnadel Zellen von E. coli, Aeromonas hydrophila und Pseudomonas fluorescens eingestochen, anschließend bebrütet. Aerobe Bakterien wachsen in den oberen Schichten, anaerobe unten im Röhrchen; fakultative Organismen bevölkern das gesamte Röhrchen. Produziert ein Organismus z.b. durch Gärung Säuren, so sinkt der ph-wert, der Indikator schlägt von violett nach gelb um.

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 16/16 Pseudomonas fluorescens, ein aerobes Bakterium, wächst im oberen Teil des Mediums und kann Glucose zu Gluconsäure vergären. E. coli ist fakultativ, es wächst, genau wie Aeromonas hydrophila im ganzen Medium und produziert überall viel Säure, ersichtlich an der gelben Farbe des Mediums. Aeromonas hydrophila kann nur im anaeroben Bereich des Reagenzglases Säure bilden, hier Gelbfärbung. Der Oxidase-Test gibt an, ob Cytochrom c in der Atmungskette bei Mikroorganismen vorhanden ist. Auch hier wurden die schon beim O/F-Test verwendeten Bakterienarten von E. coli, Aeromonas und Pseudomonas verwendet. Junge Kolonien, gewachsen auf einer HD-Agarplatte, wurden auf Filterpapier, das mit dem Oxidasereagenz Tetramethylphenylendiamin (TMPD) getränkt wurde, aufgebracht. Nach kurzer Zeit stellte sich eine leichte violette Färbung an der Stelle von Aeromonas hydrophila ein, die anderen beiden blieben negativ. Eigentlich sollte Pseudomonas fluorescens positiv bei diesem Test auf Cytochrom c reagieren, es war aber auch dem Assistenten unerklärlich, weshalb der Test negativ verlief. Vielleicht war die Kultur von Pseudomonas fluorescens schon zu alt, sie wurde schon vor dem Wochenende angezüchtet, oder das Oxidasereagenz war verunreinigt oder veraltet. Versuch 11: Ammonifikation In der zweiten Praktikumswoche haben wir uns u.a. mit Stoffwechselreaktionen, besonders mit denen des Stickstoffs beschäftigt. Einige Bakterien können bei Abwesenheit von Zuckern Aminosäuren als Substrat verwerten, müssen dann jedoch vermehrt Stickstoff ausscheiden, da der Stickstoffgehalt von Aminosäuren bis zu vier mal größer ist als bei anderen Substraten. Deswegen wird Ammonium freigesetzt. Dieses wird durch Zugabe einer Base, z.b. Natronlauge, als Ammoniak frei, und kann über einen ph-indikator nachgewiesen + werden. ( NH 4 + OH - NH 3 + H 2 O ) Es wurden zwei Peptonwasserröhrchen mit jeweils E. coli und etwas Erde beimpft und bei 30 C bebrütet. Bei Zugabe von Natronlauge (NaOH) wurde Ammoniak (NH 3 ) frei, der ph-indikatorstreifen hat sich sowohl bei E. coli, als auch bei der Erde, blau gefärbt. Dieses Zeichen deutet auf den positiven Verlauf des Tests hin. Versuch 12: Ureasereaktion Liegt in einer Lösung Harnstoff ( H 2 N - CO - NH 2 ) als Substrat vor, so können einige Bakterien diesen mit Wasser in CO 2 und NH 3 umwandeln. Das Enzym, das diese Reaktion katalysiert, ist die Urease. Der entstehende Ammoniak führt zu einer Alkalisierung des Mediums, der ph-indikator Phenolrot schlägt von gelb nach rot um. Es wurden pro Gruppe drei Harnstoffröhrchen mit E. coli, B. megaterium und Proteus mirabilis mit einer Impfnadel beimpft und bebrütet. Am letzten Kurstag stellten wir

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 17/17 bei E. coli keine Farbveränderung fest, bei Proteus dagegen schon, das gesamte Röhrchen war rosafarben gefärbt. Bei Bacillus war die untere Hälfte des Röhrchens gelb, die obere dagegen rosa. E. coli ist nicht in der Lage, Harnstoff zu spalten, er ist Urease negativ. Im Gegensatz dazu besitzt Proteus mirabilis die Möglichkeit, diese Reaktion wie erwünscht durchzuführen. B. megaterium spaltet Harnstoff nur bei Anwesenheit von Sauerstoff, im Anaeroben, und das ist im unteren Teil des Mediums der Fall, wird kein Ammoniak gebildet. Über die Ursachen und Gründe geben Fachbücher, wie z.b. H. Schlegel: "Allgemeine Mikrobiologie", Thieme-Verlag, W. Fritsche: "Mikrobiologie", Spektrum-Verlag und D. Brock, M. Madigan: "Mikrobiologie", Spektrum-Verlag, leider keine Auskunft. Versuch 13: Denitrifikation Eine wichtige Reaktion im Stickstoffhaushalt ist die Denitrifikation, einer Reaktion der anaeroben Nitrat-Atmung. Hier wird in Abwesenheit von Sauerstoff Nitrat (NO 3 - ) als Elektronenakzeptor verwendet und über Nitrit (NO 2 - ) und Lachgas (N 2 O) zu elementaren Stickstoff (N 2 ) reduziert. Laut Literatur können dies z.b. die Mikroorganismen Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas aeruginosa und Thiobacillus denitrificans. Im Praktikum haben wir die beiden Arten B. subtilis und Pseudomonas aeruginosa verwendet. Es wurden drei aufgeschmolzene, flüssige Nitrat-Agarröhrchen mit diesen beiden und mit Erde beimpft, und zur Kontrolle wurde pro Bankreihe zusätzlich Röhrchen, die kein Nitrat enthielten, wie oben beimpft und ebenfalls bei 30 C bebrütet. Wegen der Gasbildung ist die Auswertung leicht am Zerreißen der erstarrten Agarsäule zu erkennen. Die Kontrollen dienten dazu, um zu zeigen, dass die Gasbildung nicht über einen fermentativen Prozess erfolgt ist. In ihnen sollte, bei gleichen Inhaltsstoffen, keine Gasblasen sichtbar sein. Die Agarsäulen von B. subtilis und der Kontrolle zeigten kein Zerreißen oder Gasbildung an, bei Pseudomonas aeruginosa war eindeutig eine N 2 -Produktion festzustellen. Das Medium war in etliche Teile zerrissen worden, während hingegen die Kontrolle negativ war. In den zwei Röhrchen, die mit Erde befüllt wurden, waren in beiden Blasen zu erkennen. Der Bacillus kann anscheinend kein N 2 bilden, sonst wäre dies hier festzustellen gewesen. Pseudomonas ist, wie auch in der Vorlesung zum Praktikum angesprochen wurde, ein typischer Denitrifizierer. Zur Erklärung, wieso im Kontrollröhrchen der Erde, dessen Medium nitratfrei war, es dennoch zur Gasbildung kommen konnte, lässt sich anmerken, dass entweder in der Erde selbst Nitrat enthalten war, der zu Stickstoff verarbeitet wurde, oder dass in der Probe andere Mikroorganismen lebten, die durch Gärung Gase entwickelten. Diese Vermutung bestätigte auch unser Assistent, eine genauere Untersuchung war leider nicht möglich.

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 18/18 Versuch 14: Isolierung von Antibiotikaproduzenten In der Natur gibt es auch Bakterien, die Antibiotika herstellen können. Diese kommen u.a. im Boden vor. Zur Isolierung dieser Arten wurden 10 g frische Erde in 10 ml Wasser suspendiert und gemischt. Nach einer Stunde wurde zudem davon auch eine 1:10 Verdünnung hergestellt und jeweils zwei Tropfen in 10 ml 0,7%ige wässrige Phenollösung eingebracht. Das Phenol tötet vegetative Zellen ab, nicht aber Endosporen. Die Fähigkeit der Antibiotikasynthese hängt nämlich oft mit der Fähigkeit der Endosporenbildung zusammen. 0,1 ml beider Lösungen wurden auf Nystatinagar aufgebracht und bebrütet. Nystatin hemmt das Wachstum von Pilzen. Es sollten nach einigen Tagen mehrere Kolonien von Antibiotikaproduzenten gewachsen sein. Um diese nachzuweisen, wurden die Petrischalen mit einer Suspension aus Weichagar und B. subtilis-kulturen übergossen, zum Eindifundieren des Antibiotikums in den Weichagar für zwei Stunden in den Kühlschrank gestellt und anschließend bebrütet. Einige Tage später hätten sich um die Kolonien der Antibiotikaproduzenten klare Höfe bilden sollen. Dies war jedoch weder bei meiner Gruppe, noch bei anderen Studenten der Fall. Entweder waren gar keine Antibiotikaproduzenten in der Erde und auf der Nystatinplatte, oder die Erdsuspension war zu stark verdünnt worden, oder B. subtilis war resistent gegen das produzierte Antibiotikum. Am wahrscheinlichsten ist eher der Fall, dass die Erdsuspension durch Pipettierfehler zu stark verdünnt wurde, oder das Phenol hat alle Zellen und Sporen abgetötet. Versuch 15: Qualitativer Antibiotika-Test Nicht jede Bakterienart ist gleich sensitiv gegenüber einem Antibiotikum. Um dies zu testen, wurde ein Filterpapierstreifen mit einem Antibiotikum getränkt, auf einen Komplexnährboden gelegt, und verschieden Bakterienstämme wie unten gezeigt von außen gegen das Filterpapier geimpft. Meine Gruppe hat eine 1%ige Streptomycinlösung verwendet, die Gegengruppe Ampicillin. Die von uns verwendeten Bakterien waren M. luteus, B. subtilis, E. coli, S. aureus, P. fluorescens und jeweils das Eigenisolat aus Versuch 1. P. fluorescens Eigenisolat I (Stefan Rösel) Eigenisolat II (Stephan Behl) M. luteus B. subtilis E. coli S. aureus

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 19/19 Bei der Auswertung wurde der Abstand von der letzten sichtbaren Kolonie bis zum Rand des Filterpapierstreifen gemessen. Die Entfernungen waren: M. luteus: 1,6 cm, B. subtilis: 0,9 cm, E. coli: 1,0 cm, S. aureus: 0,0 cm, P. fluorescens: 1,4 cm, Eigenisolat I: 0,7 cm und Eigenisolat II: 2,0. Wie aus den Zahlen leicht ersichtlich ist, ist S. aureus resistent gegen Streptomycin, M. luteus dagegen nicht. Eigentlich könnte man argumentieren, dass ein gramnegatives Bakterium, da es zwei Membranen in der äußeren Zellwand besitzt, im Gegensatz zu einem gram-positiven Bakterium resistenter gegen ein Antibiotikum ist. Wie dieser Versuch jedoch eindeutig zeigt, ist dies nicht immer der Fall, denn E. coli und P. fluorescens sind beide gram-negativ, M. luteus, B. subtilis und S. aureus sind gram-positiv. Der Abstand der Bakterien zum Antibiotikastreifen korreliert also nicht mit der Eigenschaft der Mureinschicht und Gramfärbung, sondern ist anderweitig zu erklären. Wahrscheinlich haben die verschiedenen Bakterienstämme eine unterschiedliche Resistenz gegen das verwendete Antibiotikum bei unterschiedlichen Hemmkonzentrationen. Versuch 16: Antibiotika: Plattendiffusionstest Gerade in der Medizin ist es wichtig, um eine Überdosierung von Antibiotika zu vermeiden, dessen Konzentration abzuschätzen. Hierbei nutzt man den Plattendiffusionstest. Auf sterile Filterplättchen wurden exakt 20 µl von Chloramphenicol bzw. Penicillin G in verschiedenen Konzentrationen pipettiert und die Plättchen auf einen Agar, in dem der Indikatororganismus B. subtilis eingegossen war, gegeben. Zur Vordiffusion wurden die beschickten HD-Platten für zwei Stunden in den Kühlschrank gestellt, und anschließend bebrütet. Bei der Auswertung wurden die klaren Höfe der Kolonien vermessen und semilogarithmisch in ein Koordinatensystem eingetragen. Meine Gruppe hat mit Chloramphenicol gearbeitet. Die Konzentrationen pro 20 µl betrugen 1; 4; 8; 12 und 16 µg. Wir haben anstelle des Durchmessers den Radius der einzelnen Höfe gemessen: Konzentration Chloramphenicol 1 µg/20 µl 4 µg/20 µl 8 µg/20 µl 12 µg/20 µl 16 µg/20 µl Radius des Hemmhofs 0 mm 1 mm 1 mm 3,5 mm 6 mm Der Betreuer hat eine unbekannte Konzentration des gleichen Antibiotikums ebenfalls auf eine B. subtilis-agarplatte gegeben. Wir haben einen Hemmhofradius von 7 mm gemessen und graphisch die Konzentration bestimmt. Es waren ca. 14 bis 15 µg/20µl Chloramphenicol.

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 20/20 Versuch 17: Antibiotika: Empfindlichkeitsspektrum Verschiedene Antibiotika haben unterschiedliche Wirkungen und können bei diversen Mikroorganismen zu Resistenzen führen. Um dies zu testen verwendet man im klinisch-mikrobiologischen Bereich sog. Empfindlichkeitsspektren. Bei diesem Demonstrationsversuch wurden auf bereitgestellten HD-Platten, in die Zellen von E. coli und S. aureus eingegossen waren, mit Hilfe eines sog. Sensi-Disk- Dispensors kommerziell erhältliche Plättchen mit genau definierten Konzentrationen verschiedener Antibiotika aufgebracht, bebrütet, die Hemmhöfe ausgemessen und anhand einer mitgelieferten Tabelle ausgewertet. So können die Bakterien in die Klassen sensitiv, intermediär-resistent oder resistent eingeordnet werden. Der Assistent war so freundlich, den Versuch vorzubereiten und durchzuführen. Die Konzentrationen der einzelnen Antibiotika, sowie ein Auszug aus der Bewertungstabelle und die ausgemessenen Durchmesser der Hemmhöfe habe ich in nachfolgender Tabelle zusammengefasst. Antibiotikum Konzentration resistent intermediär sensitiv E. coli S. aureus Ampicillin (E. coli) (S. aureus) 25 µg <13 <18 14-16 --- >29 17 mm 25 mm Carbenicillin 100 µg 19 20-22 23 18 mm 25 mm Erythromycin 15 µg 13 14-22 23 0 mm 26 mm Gentamicin 5 µg 12 13-14 15 18 mm 13 mm Novobiocin 23,75 µg 17 18-21 22 0 mm 22 mm Sulfometoxacol + Trimethoprin 1,25 µg 10 11-15 16 26 mm 9 mm Wie aus obiger Tabelle leicht zu entnehmen ist, reagieren die beiden Mikroorganismen E. coli und S. aureus unterschiedlich auf die sechs Antibiotika. Während E. coli gegen viele der verwendeten Hemmstoffe resistent ist (z.b. Erythromycin und Novobiocin), ist S. aureus gegen diese beiden und weitere (z.b. Ampicillin und Carbenicillin) äußerst sensitiv und meidet das ausgelegte Plättchen weiträumig. Versuch 18: Bakterizide und bakteriostatische Wirkung Bekanntlich gibt es bakteriolytische, bakterizide und bakteriostatische Antibiotika, je nachdem, ob sie nur das Wachstum von Bakterien hemmen, die Bakterien töten oder lysieren. Dies soll in diesem Versuch anhand der Beispiele Penicillin G, Gentamicin und Chloramphenicol gezeigt werden. Wie auch in Versuch 5 haben wir die Ergebnisse anhand von Wachstumskurven ausgewertet. Mit einem Photometer wurde die OD 580 nach verschiedenen Inkubationszeiten erfasst und logarithmisch aufgetragen. 100 ml einer HD-Flüssigkultur von Proteus wurde erst im Schüttelwasserbad bebrütet. Ausgehend von einer OD = 0,05 wurden im 30 Minuten-Intervall die optische Dichte gemessen, bis eine OD von 0,3 erreicht war. Dann wurden die verschiedenen Anti-

Stefan Rösel Mikrobiologisches Praktikum Assistent: Tobias Kraxenberger Seite 21/21 biotika zugegeben: in drei Kulturen 100 µg Penicillin G pro ml Bakteriensuspension bzw. 200 µg pro ml Gentamicin und in zwei Kulturen 50 µg pro ml Chloramphenicol. Die Gruppen A 1 und E 2 haben ihre Bakterienkultur als Kontrolle ohne Zugabe eines Antibiotikums weitergeführt. Ab dem Zeitpunkt der Antibiotikazugabe wurde die OD 580 alle 20 Minuten gemessen und auf einer Tafel im Praktikumssaal festgehalten. Die Werte habe ich in die unten angegebenen Tabelle übernommen. Gruppe A 1 A 2 B 1 B 2 C 1 C 2 D 1 D 2 E 1 E 2 Antib. K PenG Gen Cam PenG Gen Cam PenG Gen K 13:30 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 14:00 0,16 0,16 0,19 0,18 0,19 0,16 0,15 0,16 0,17 0,16 14:30 --- 0,66 --- 0,30 0,32 0,36 0,34 0,32 0,29 0,29 14:50 0,50 0,38 0,66 0,72 0,50 0,50 0,58 0,52 0,55 0,54 20 0,88 0,77 0,88 0,80 0,84 0,84 0,74 0,80 0,79 0,92 40 1,61 1,00 0,94 0,82 1,20 0,90 0,74 1,20 0,71 1,26 60 1,68 1,25 0,92 0,98 X 0,80 0,76 0,69 1,75 1,72 80 2,02 1,27 0,88 1,01 X 0,90 0,82 0,70 0,78 1,70 100 --- 1,20 --- --- X --- 0,79 1,00 0,77 2,29 Das Wachstum der Kontrollkulturen (K) von Gruppe A 1 und E 2 ist in beiden Fällen ungefähr gleich und exponentiell. Auch die anderen Versuchsansätze vermehren sich bis zur Antibiotikazugabe um 14:50 Uhr gleichmäßig und konstant. Erst graphisch wird sichtbar, dass die Wirkung von Penicillin G (PenG) erst nach ca. 20 bis 30 Minuten ab der Antibiotikazugabe einsetzt, und die OD-Werte dann absinken. Dies lässt den Schluss zu, dass Penicillin G eine bakteriolytische Wirkung besitzt. Ein anscheinender Anstieg des Wachstums nach 100 Minuten in Gruppe D 2 kann zweierlei begründet werden. Erstens wird Penicillin stöchiometrisch durch die Bakterien verbraucht und die Konzentration sinkt. Weiteres Wachstum ist möglich. Andererseits kann, da Wachstum nur in dieser Gruppe festgestellt wurde, dies ein Mess- oder Rechenfehler sein. Um diese Möglichkeit auszuschließen bzw. um die vorherige Vermutung zu bekräftigen wären fortlaufende Messungen notwendig gewesen. Dies war aber aus Zeitgründen nicht möglich. Wären die OD-Werte dann weiter angestiegen, dann wäre das Penicillin tatsächlich verbraucht gewesen, und es hätte, um weiteres Wachstum zu hemmen, im Überschuss zugegeben werden müssen. Die Zugabe von Gentamicin (Gen) und Chloramphenicol (Cam) äußert sich in einer Stagnation des Wachstums, die Optische Dichte nimmt weder zu noch ab. Somit haben beide Antibiotika eine bakterizide bzw. bakteriostatische Wirkung, führen aber nicht zur Lyse der Zellen. Zu einigen weiteren Zahlen ist anzumerken, dass sie äußerst unglaubwürdig sind und ihnen wenig Beachtung zukommt. Der Wert OD 580 = 1,75 von Gruppe E 1 bei t = 60 scheint eine Fehlmessung zu sein, oder ist durch einen Rechenfehler bei der Umrechnung der Verdünnung entstanden. Eine anfangs gemessene OD > 0,5 und einer somit verbundenen Verdünnung bedarf natürlich eine Umrechnung des dann ermittelten Wertes. Bei Gruppe C 1, der auch ich angehörte, wurde der Versuch vorzeitig abgebrochen. Durch eine Verunreinigung des Mediums und den damit verbundenen verfälschten Messwerten konnte der Versuch nicht weitergeführt werden.