micrornas als molekulare Etiketten zur gezielten Ausschaltung von

micrornas als molekulare Etiketten zur gezielten Ausschaltung von micrornas: Tiny silencers of gene expression Izaurralde, Elisa Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie, Tübingen Korrespondierender Autor E-Mail: elisa.izaurralde@tuebingen.mpg.de Zusammenfassung MicroRNAs sind im Genom kodierte, rund 22 Nukleotide lange RNAs, die die Genexpression post-transkriptional reduzieren, indem sie an die untranslatierten 3 -Regionen von Boten-RNAs (s) binden und diese meist auch eliminieren. Obwohl viel über ihre Biogenese und biologischen Funktionen berichtet wurde, sind die Mechanismen, mit denen mirnas die Genexpression deaktivieren, nicht vollständig erforscht. Unser langfristiges Ziel ist es, molekularbiologisch zu verstehen, wie mirnas gezielt Hunderte von -Sequenzen in Tierzellen auf spezifische Weise unterdrücken können. Summary MicroRNAs are genome-encoded, around 22 nucleotide-long RNAs that silence gene expression posttranscriptionally by binding 3 untranslated regions of messenger RNAs. Although recent years amassed a wealth of information about their biogenesis and biological functions, the mechanisms allowing mirnas to silence gene expression is not fully understood. Our long-term goal is to understand in molecular terms how mirnas repress hundreds of targets in animal cells. Kleine RNA-Abschnitte regulieren die Genexpression mirnas spielen in einer Vielzahl biologischer Prozesse, wie der Entwicklung, der Zelldifferenzierung, der Zellproliferation oder dem Zelltod, eine wichtige Rolle [1]. Das Genom von Insekten und Würmern enthält mindestens 100 mirna-gene, während Wirbeltiere und Pflanzen auf 500 bis 1000 mirnas kommen. Jede mirna kann unter Umständen Hunderte von unterschiedlichen Boten-RNAs (messenger RNAs, s) regulieren, was vermuten lässt, dass ein erheblicher Anteil von eukaryotischen Genen einer Regulierung durch mirnas unterliegt [2]. Angesichts der großen Anzahl von Genen, die durch mirnas heruntergeregelt und ausgeschaltet werden, überrascht es nicht, dass mirnas an der Entstehung vieler Krankheiten, wie etwa Krebs, Herz-Kreislauf- Erkrankungen oder Stoffwechselstörungen, beteiligt sind und somit die Erforschung ihrer genauen Funktionsweise neue Möglichkeiten für eine therapeutische Intervention eröffnet [1]. Um herauszufinden, wie 2014 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 1/7

mirnas an der Entstehung von Krankheiten beteiligt sind und um sinnvolle therapeutische Strategien entwickeln zu können, ist daher ein detailliertes, mechanistisches Verständnis ihrer Wirkungsweise erforderlich. Zur Ausübung ihrer Funktionen bilden mirnas Komplexe mit Proteinen aus der Familie der sogenannten Argonauten. Diese Komplexe werden auch als miriscs - mirna-induced silencing complexes - bezeichnet, in denen die mirnas die Aufgabe übernehmen, Argonaut-Proteine zu teilweise komplementären - Zielsequenzen zu führen, die dann nachfolgend blockiert werden [1, 2, 3]. Trotz bemerkenswerter Fortschritte in unserem Verständnis der Biogenese und Funktion von mirnas sind die Mechanismen, die mirnas zur Herunterregulierung der Genexpression einsetzen, noch nicht vollständig verstanden. Allerdings haben die im letzten Jahrzehnt durchgeführten Untersuchungen wichtige Fortschritte gebracht, weil nachgewiesen werden konnte, dass Argonaut-Proteine von Proteinen der GW182-Familie unterstützt werden, die wiederum als molekulare Knotenpunkte für die Rekrutierung von Translationsrepressoren und Abbauenzymen dienen. Die Familie der GW182 Proteine GW182-Proteine wurden erstmals in menschlichen Zellen als Antigen identifiziert und im Serum eines Patienten gefunden, der unter einer motorisch-sensiblen Neuropathie litt. Experimente zeigten, dass diese Proteine mit Argonaut-Proteinen interagieren und in Tieren bei der Zellregulation über mirnas eine wichtige Rolle spielen [3, 4]. GW182-Proteine sind in mehrzelligen Organismen vorhanden. Wirbeltiere und einige Insektenarten besitzen drei GW182-Proteine (TNRC6A/GW182, TNRC6B und TNRC6C), während Fruchtfliegen nur ein GW182-Protein aufweisen. In Hefe und Pflanzen wurden bislang keine GW182-Proteine nachgewiesen [4]. GW182-Proteine aus Wirbeltieren und Insekten sind typischerweise durch eine N-terminale Region gekennzeichnet, die an die Argonaut-Proteine bindet, und zwar an deren sogenannte AGO-Bindungsdomäne (ABD). Die C-terminale Region der GW-182 Proteine wiederum ist dazu in der Lage, Abbauenzyme zu rekrutieren und wird daher als Silencing-Domäne (SD) bezeichnet (Abb. 1). 2014 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 2/7

A bb. 1: Die Fam ilie der GW182-Proteine.Die N-term inale AGO- Bindungsdom äne beinhaltet m ehrere GW-Repeats (senkrechte rote Balken) - eine Abfolge der Am inosäuren Glycin (G) und Tryptophan (W). Die Silencing-Dom äne (SD) enthält m ehrere W-Motive (senkrechte grüne Balken). GW182-Proteine weisen zusätzlich eine Ubiquitin-assoziierte Dom äne (UBA), eine glutam inreiche Region (QQQ) und eine RNA-Bindungsdom äne (RBD) auf. Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie/Izaurralde Sowohl die N-terminale ABD als auch die C-terminale SD von GW182-Proteinen sind für das Herunterregeln von s wesentlich. Bemerkenswerterweise sind beide Domänen strukturell ungeordnet und reich an Trpytophan (W) Resten. Diese sind häufig Glycin (G) Resten benachbart und bilden so GW-, WG- oder GWG- Motive, die gesammelt als GW-Wiederholungen (GW-Repeats) bezeichnet werden, worauf die Bezeichnung der Protein-Familie zurückzuführen ist (Abb. 1). GW182-Proteine nutzen diese W-haltigen Motive zur Bindung an ihre Partner. Insbesondere wurde nachgewiesen, dass GW182-Proteine Tryptophan-Reste in hydrophobe Taschen einbringen können, die sich auf der Oberfläche ihrer Bindungspartner befinden [4 9]. Ein Modell für die Herunterregulierung von Genen durch mirnas Die bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt gewonnenen Erkenntnisse der mirna-forschung unterstützen ein mechanistisches Modell, das mit der Erkennung einer durch eine mirna in Verbindung mit einem Argonaut-Protein beginnt (Abb. 2). Das Argonaut-Protein rekrutiert dabei ein GW182-Protein, was eine Kaskade von Ereignissen auslöst. Diese beinhalten die Unterdrückung der Translation, die Entfernung des Poly(A)-Schwanzes der - was als Deadenylierung bezeichnet wird - und letztendlich den vollständigen Abbau der (Abb. 2, Abb. 3). Wie die Translation unterdrückt wird, ist noch weitgehend unbekannt. Dagegen weiß man bereits ziemlich viel über den Mechanismus der durch mirnas ausgelösten Deadenylierung und des darauf folgenden -Abbaus. Es ist bekannt, dass die Deadenylierung durch die sequenzielle Aktivität von zwei cytoplasmischen Deadenylase-Komplexen erfolgt: dem PAN2-PAN3 Komplex und dem CCR4- NOT-Komplex (Abb. 3; [3, 4]). 2014 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 3/7

A bb. 2: Mechanism us von m irna-verm ittelter Gen- Herunterregulierung in Tieren.Der Argonaut-GW182-Kom plex unterdrückt die Translation einer m RNA über einen unbekannten Mechanism us und veranlasst die Deadenylierung und den Abbau der m RNA durch Rekrutierung derjenigen Enzym e, die generell am 5-3 -m RNA-Abbauweg beteiligt sind. Die Dom änenstruktur von GW182-Proteinen ist in Abb. 1 erläutert. GW182-Proteine nutzen tryptophanhaltige Motive (W) zur Interaktion sowohl m it Deadenylasen als auch Argonaut-Proteinen. Konkret werden die W-Reste in Bindungstaschen eingebracht, die sich auf der Oberfläche der Bindungspartner (PAN3-, NOT- und Argonaut-Proteine) befinden. Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie/Izaurralde Abhängig von der Zellart und / oder der speziellen Zielsequenz kann die deadenylierte im translatorisch unterdrückten Zustand zur späteren Verwendung aufgehoben werden. In vielen Organismen und Zellarten kommt es allerdings zu einer Abnahme der -Menge. Dies passt zur Beobachtung, dass deadenylierte s grundsätzlich instabil sind und durch generell wirkende Abbauenzyme schnell verdaut werden. mirnas beschleunigen somit die Zerstörung der Ziel-, indem sie Enzyme rekrutieren, die am generellen Abbau in der Zelle beteiligt sind. Dieser Abbau wird auch als 5'-3'- Degradation bezeichnet [3, 4]. Dabei werden die s zunächst deadenyliert. Anschließend wird die molekulare Kappe, die das -5 -Ende schützt, in einem als Entkappung bezeichneten Prozess entfernt, und letztlich wird die vom 5'-Ende her durch eine Exonuklease mit der Bezeichnung XRN1 exonukleolytisch abgebaut (Abb. 3). Ein wichtiger Beitrag unseres Labors für die mirna-forschung war der Nachweis, dass mirnas den Abbau von s bewirken, indem sie diese der enzymatischen Maschinerie zuführen, die für den generellen Abbau über den 5'-3'-Weg zuständig ist. Unsere Untersuchungen haben ergeben, dass dieser über die mirnas vermittelte -Abbauweg Argonaut- und GW182-Proteine sowie Deadenylase- und Entkappungskomplexe benötigt. Diese Komplexe werden von den GW182-Proteinen zur rekrutiert [3, 4, 6 10]. 2014 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 4/7

A bb. 3: Allgem einer m RNA-Abbau über 5-3 Degradation. Über diesen Weg werden die m RNAs zunächst durch die aufeinanderfolgende Aktivität der beiden Deadenylase- Kom plexe PAN2-PAN3 und CCR4-NOT deadenyliert. Nach der Deadenylierung werden die m RNAs durch das Entkappungsenzym DCP2 und m ehrere Entkappungsaktivatoren (nicht abgebildet) von ihrer m olekularen Kappe befreit. Die entkappten m RNAs werden dann vom 5 -Ende her durch eine Exonuklease m it der Bezeichnung XRN1 abgebaut. Die m olekulare Kappe ist als schwarzer Punkt dargestellt. Der PAN2-PAN3-Kom plex um fasst zwei Untereinheiten (PAN2 und PAN3). Der CCR4-NOT- Kom plex um fasst zwei Enzym e, die den Poly(A)-Schwanz entfernen (CCR4 und CAF1), sowie neun weitere Untereinheiten, die m it NOT bezeichnet werden und als ein einziger Kom plex dargestellt sind. Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie/Izaurralde Aber damit ist das Bild noch lange nicht vollständig, es fehlt insbesondere die Erkenntnis, wie es zur Unterdrückung der Translation durch mirnas kommt. Eine interessante Möglichkeit wäre die, dass einer der beiden Deadenylase-Komplexe, der CCR4-NOT-Komplex, sowohl die Translation unterdrückt als auch die Deadenylation bewirkt. Für diese Möglichkeit spricht die erstaunliche Beobachtung, dass Untereinheiten des CCR4-NOT-Komplexes in der Lage sind, die Translation von s zu unterdrücken, denen ein Poly(A)- Schwanz fehlt und die deshalb gar nicht deadenyliert und abgebaut werden können [4, 6, 7]. Diese Beobachtungen legen nahe, dass Deadenylase-Komplexe unabhängig von der Rolle, die sie bei der Deadenylierung spielen, zur Unterdrückung der Translation beitragen könnten. Zukünftige Studien werden zeigen, ob Deadenylase-Komplexe die Translation unterdrücken, und wenn ja, durch welche Mechanismen dies bewirkt wird. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass mirnas an vorderster Front der biomedizinischen Forschung stehen. Seit ihrer Entdeckung 1993 sind die Fortschritte auf diesem Gebiet bemerkenswert. Entscheidende Schritte waren die Aufklärung einzelner Stufen der Biogenese von mirnas, die Identifizierung der Effektoren dieses Prozesses und die Aufklärung der Bedeutung von mirnas als therapeutische Werkzeuge und Zielsequenzen. Viele molekulare und mechanistische Details der Herunterregulierung von Genen durch mirnas bleiben zwar noch zu klären, aber die letzten Jahre haben unsere Kenntnisse über diese Mechanismen erheblich erweitert. 2014 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 5/7

Insbesondere wurde eine so nicht erwartete, direkte Verbindung zum CCR4 NOT-Komplex festgestellt, der als post-transkriptionaler Hauptregulator in eukaryotischen Zellen agiert. Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen diesem Komplex und dem auf mirnas basierenden Silencing-Mechanismus werden das Forschungsfeld weiter voran bringen und sind ein spannendes Thema für weitere Studien. Literaturhinweise [1] Li, Y.; Kowdley, K. V. MicroRNAs in common human diseases Genomics Proteomics Bioinformatics 10, 246-253 (2012) [2] Bartel, P. D. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions Cell 136, 215-233 (2009) [3] Huntzinger, E.; Izaurralde, E. Gene silencing by micrornas: contributions of translational repression and decay Nature Reviews Genetics 12, 99-110 (2011) [4] Braun, J. E.; Huntzinger, E.; Izaurralde, E. The role of GW182 proteins in mirna-mediated gene silencing Advances in Experimental Medicine and Biology 768, 147-163 (2013) [5] Schirle, N. T.; MacRae, I. J. The crystal structure of human Argonaute2 Science 336, 1037-1040 (2012) [6] Braun, J. E.; Huntzinger, E.; Fauser, M.; Izaurralde, E. GW182 proteins recruit cytoplasmic deadenylase complexes to mirna targets Molecular Cell 44, 120 133 (2011) [7] Chekulaeva, M.; Mathys, H.; Zipprich, J. T.; Attig, J.; Colic, M.; Parker, R.; Filipowicz, W. mirna repression involves GW182-mediated recruitment of CCR4-NOT through conserved W-containing motifs Nature Structural & Molecular Biology 18, 1218 1226 (2011) [8] Fabian, M. R.; Cieplak, M. K.; Frank, F.; Morita, M.; Green, J.; Srikumar, T.; Nagar, B.; Yamamoto, T.; Raught, B.; Duchaine, T. F.; Sonenberg, N. mirna-mediated deadenylation is orchestrated by GW182 through two conserved motifs that interact with CCR4 NOT Nature Structural & Molecular Biology 18, 1211 1217 (2011) [9] Christie, M.; Boland, A.; Huntzinger, E.; Weichenrieder, O.; Izaurralde, E. Structure of the PAN3 pseudokinase reveals the basis for interactions with the PAN2 deadenylase and the GW182 proteins Molecular Cell 51, 360-373 (2013) 2014 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 6/7

[10] Eulalio, A.; Rehwinkel, J.; Stricker, M.; Huntzinger, E.; Yang, S.F.; Doerks, T.; Dorner, S.; Bork, P.; Boutros, M.; Izaurralde, E. Target-specific requirements for enhancers of decapping in mirna-mediated gene silencing Genes & Development 21, 2558 2570 (2007) 2014 Max-Planck-Gesellschaft www.mpg.de 7/7