Bakteriophagen zur Bekämpfung von Feuerbrand Einblick in die Bakteriophagen Forschung Leandra Knecht, Yannick Born, Cosima Pelludat, Eduard Holliger, Martin J. Loessner, Lars Fieseler
Was sind Bakteriophagen? Bakterielle Viren Natürliche Fressfeinde Allgegenwärtig Wirtsspezifischen Rezeptors Anpassungsfähig Lytischer Zyklus Nicht schädlich für Umwelt Lyse Adsorption Fertigstellung neuer Phagen Lytischer Zyklus Injektion Replikation/ Translation
Was sind Bakteriophagen? Keine Nebenwirkungen Produktionskosten «Selbst»-reproduzierend «Selbst»-limitierend Anpassungsfähig Lyse Adsorption Lytischer Zyklus Injektion Fertigstellung neuer Phagen Replikation/ Translation
Phagen Produkte Lebensmittelassoziierte Salmonellose Salmonella enterica Lebensmittelassoziierte Listeriose Listeria monocytogenes www.intralytix.com www.micreos.com Bakterielle Fleckenkrankheit Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Pseudomonas syringae pv. tomato Feuerbrand Erwinia amylovora? www.omnilytics.com
Phagen gegen Feuerbrand Bodenproben von Apfel/Birnenplantagen (CH) Erwinia amylovora spezifisch Lytischer Zyklus BUE1 M7 Y2 L1 S2 S6 Electron microscopic pictures of the E. amylovora phages (BUE1: Y. Born, 2015; M7 S6: Born et al., 2011).
Wirksamer Phagen Cocktail Wirtsspezifisch Lytischer Zyklus Anpassungsfähig Nicht schädlich für gute Bakterien auf der Pflanze Keine Resistenzentwicklung Lyse Adsorption Lytischer Zyklus Injektion Fertigstellung neuer Phagen Replikation/ Translation
Veränderung des Rezeptors Phagen erkennen und binden an Oberflächenstrukturen (Rezeptoren) Mutation von Rezeptoren = Resistenz Sehr häufiger Mechanismus Rezeptoren unbekannt bei E. amylovora 1 Mutation Anfälliges Bakterium Resistentes Bakterium
Veränderung des Rezeptors Phagen erkennen und binden an Oberflächenstrukturen (Rezeptoren) Mutation von Rezeptoren = Resistenz Sehr häufiger Mechanismus Rezeptoren unbekannt bei E. amylovora Identifikation von Rezeptoren Optimale Zusammensetzung von Cocktails 2 Mutationen Anfälliges Bakterium Resistentes Bakterium
Rezeptor Gruppen Rezeptor Identifizierung der 6 Phagen Kombination verschiedener Phagen S6 M7 Bakterielle Cellulose S2 L1 Amylovoran LPS Y2 Bue1
E. amylovora Konzentration [KBE/ml] Hemmung von E. amylovora Wachstum in vitro 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 Control 10 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Zeit [h] Born et al. 2011
E. amylovora Konzentration [KBE/ml] Hemmung von E. amylovora Wachstum in vitro 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 Control L1 Y2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Zeit [h] Born et al. 2011
E. amylovora Konzentration [KBE/ml] Hemmung von E. amylovora Wachstum in vitro 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 Control L1 Y2 L1/Y2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Zeit [h] Born et al. 2011
Phagen Behandlung auf der Blüte 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 1 2 3
Blüten (%) Blüten Behandlung mit L1 2017 vs. 2018 100% L1 (10 7 PFU/ml) 2017 100 L1 (10 7 PFU/ml) 2018 90% 90 80% 80 70% 70 60% 60 50% 50 40% 40 30% 30 20% 20 10% 10 0% PBS PBS + L1 CFBP1430 CFBP1430 + L1 0 PBS [ᴓ] 1430 [ᴓ] 1430+Φ [ᴓ] 1 2 3 1[%] 2[%] 3[%]
Blüten (%) Blüten Behandlung mit L1 2017 vs. 2018 Alle Behandlungen sind weniger effektiv Temperatur Blüten Vorhandene Bakterien in den Blüten Formulierung der Phagen Trägersubstanzen UV Schutz Antagonisten 100% L1 (10 7 PFU/ml) 2017 100 L1 (10 7 PFU/ml) 2018 90% 90 80% 80 70% 70 60% 60 50% 50 40% 40 30% 30 20% 20 10% 10 0% PBS PBS + L1 CFBP1430 CFBP1430 + L1 0 PBS [ᴓ] 1430 [ᴓ] 1430+Φ [ᴓ] 1 2 3 1[%] 2[%] 3[%]
Phagen gegen Feuerbrand Zusammenfassung Ausblick Phagen sind wirtsspezifisch Phagen sind natürlich und ohne Nebenwirkungen Phagen reduzieren Zellzahlen von E. amylovora signifikant Zusammenstellen und testen optimaler Cocktails Optimierung der Anwendung für erhöhte Wirksamkeit Überprüfen und Verbesserung der Wirksamkeit in vivo
Nachweis von Feuerbrand mittels Phage Y2::luxAB
Nachweis von Feuerbrand mittels Phage Y2::luxAB E.amylovora spezifisch Luciferase Gen (Vibrio harveyi) steuert Lichtproduktion (Biolumineszenz) Infizierte Zellen leuchten Messung des produzierten Lichts als Nachweis Adsorption Lytischer Injektion Lyse Zyklus luxab Fertigstellung neuer Phagen Replikation/ Translation
Nachweis von Feuerbrand mittels Phagen Y2::luxAB
Nachweis von Feuerbrand mittels Phagen Y2::luxAB
Licht-Emission (RLU) Nachweis von Feuerbrand: Geschwindigkeit Nachweis innerhalb 1 Stunde 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 30 60 90 120 150 17 C 22 C 27 C 0 30 60 90 120 150 0 30 60 90 120 150 Zeit (min) Born et al. (2017)
Licht-Emission (RLU) Nachweis von Feuerbrand: Nachweisgrenze Quantitativ (ohne Voranreicherung) Nachweisgrenze: ca. 4 000 Zellen/ml 5000000 500000 50000 * * CFBP Bakterien 1430+ Reporterphage CFBP1430 Bakterien + control normaler Phage 5000 * 500 * * 50 3.8 10 7 3.8 10 6 3.8 10 5 3.6 10 4 3.8 10 3 3.8 10 2 3.8 10 1 3.8 10 0 0.4 10 0 Koloniebildende Einheiten pro ml Born et al. (2017)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 RLU Nachweis von Feuerbrand: Umweltproben 24 Umweltproben mit Feuerbrand Symptome (Keine Voranreicherung 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 - Sample no. Born et al. (2017)
Nachweis von Feuerbrand mittels Phagen Nachweis mittels Reporterphagen ist: schnell spezifisch günstig Technologie auf weitere Zielkeime übertragbar Senkung der Nachweisgrenze durch Voranreicherung
Danksagung Prof. Dr. Lars Fieseler Dr. Yannick Born Marina Mahler Jules Peter Marjan Veljkovic Fieseler Lab Eduard Holliger Dr. Cosima Pelludat Eidgenössisches Departement für Wirtschaft, Bildung und Forschung WBF Agroscope Prof. Dr. Martin Loessner Prof. Dr. Julia Vorholt