Alternative Methoden der RNA-Analyse In diesem Versuch wurde die Northern Blot Hybridisierung zur Analyse isolierter mrna eingesetzt. Mit dieser Technik können Größe und Menge einer spezifischen RNA bestimmt werden. Im folgenden werden das Prinzip sowie die Vor- und Nachteile von drei weiteren gängigen Methoden zur detaillierten Analyse von RNA beschrieben, mit denen auch der Endpunkt einer spezifischen RNA besimmt werden kann. Eine genaue Darstellung dieser Techniken findet sich in Current Protocols of Molecular Biology. S1-Analyse Mit dieser Methode lassen sich folgende Analysen durchführen: Kartierung der 5 - und 3 -Enden eines Transkriptes durch Verwendung endmarkierter Sonden Bestimmung der Menge einer spezifischen RNA Bestimmung der Transkriptionsrichtung Kartierung der Lokalisation und Größe von Introns in eukaryotischen Primärtranskripten Prinzip Das S1-Enzym ist eine Endonuclease, die sowohl einzelsträngige RNA als auch DNA abbaut. Das Prinzip der Methode besteht darin, zunächst eine endmarkierte DNA-Sonde an zelluläre RNA zu hybridisieren und anschließend alle einzelsträngigen Regionen (5 und 3 overhangs sowie Introns, je nach verwendeter Sonde) mit der S1-Nuclease abzubauen. Durch Elektrophorese auf einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel wird die Länge der gegenüber S1-Spaltung resistenten DNA-RNA-Hybride bestimmt. Diese entspricht dem Abstand des RNA-Terminus von dem entsprechend markierten Ende der DNA-Sonde und definiert bei 5 - Markierung den Transkriptionsstartpunkt. Bei Verwendung der Sonde in großem Überschuß, kann auch die RNA-Menge bestimmt werden. Zur Herstellung der endmarkierten Sonde nutzt man die Möglichkeit, Oligonucleotide mit Hilfe einer Kinase effizient am 5 -Ende mit 32 P zu markieren. Das Oligonucleotid wird dann an ein spezifisches einzelsträngiges DNA-Template hybridisiert und unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase1 aus E.Coli verlängert. Definierte 3 -Enden erhält man durch Restriktionsspaltung. Als Template eignet sich ein M13 Klon, doppelsträngige Plasmid-Klone müssen vorher denaturiert werden.
Alternativ kann ein langes Oligonucleotid als Sonde verwendet werden, was folgende Vorteile bietet: Die Herstellung der Sonde ist schnell, da nur eine einfache T4 Polynucleotid-Kinase Reaktion durchgeführt werden muß. Durch Verwendung equimolarer Mengen von zwei oder mehr Oligonucleotiden in der Kinase-Reaktion können gleichzeitig Sonden für die interessiernde RNA und eine Kontroll-RNA hergestellt werden. Dies erlaubt die Bestimmung der Menge einer spezifischen RNA in Bezug auf eine interne Kontrolle. Da markierte Oligonucleotide in großen Mengen hergestellt, und damit die Sonde in beträchtlichem Überschuß einsgesetzt werden kann, ist eine quantitative Hybridisierung der RNA, die Vorraussetzung für eine genaue Bestimmung der RNA-Menge, leicht zu erreichen. Da die synthetischen Oligonucleotide schon einzelsträngig sind, ergeben sich keine Komplikationen aufgrund unterschiedlicher Mengen des komplementären Strangs. Für das Auftreten von Problemen bei der S1-Analyse (kein Signal oder starker Untergrund) sind folgende Ursachen möglich: Die spezifische Aktivität der Sonde ist zu gering, da die Kinase-Reaktion nicht effizient verlaufen ist. Dies kann daran liegen, daß manche Oligonucleotid-Präparationen noch Reste von Chemikalien enthalten, die die Kinase inhibieren. Diese können in manchen Fällen durch Einstellen der Oligonucleotid-Lösung auf 10mM Magnesiumsulfat und anschließende Fällung mit 5Vol. Ethanol beseitigt werden. Die Probe enthält nur geringe Mengen der interessierenden RNA, ein Problem, das sich häufig bei transfizierten Säugerzellen ergibt. Durch Optimierung der Transfektion oder oligo(dt)-selektion kann die mrna angereichert werden. Ursachen für einen hohen Untergrund können ein unvollständiger Verdau durch die S1- Nuclease, bei der Sonden-Herstellung vorhandene, zur einzelsträngigen Sonde homologe DNA, stark degradierte RNA oder bei der Hybridisierung unvollständig gelöste RNA sein. Ribonuclease Protection -Assay Diese Methode ist eine Alternative zur häufig verwendeten S1-Nuclease Kartierungs-Technik.
Prinzip Bei dieser Methode wird eine RNA-Sonde mit eingebauten radioaktiv markierte Nukleotiden verwendet. Die Sonde wird an die Proben-RNA hybridisiert und die einzelsträngigen Teile werden durch Ribonuclease-Verdau (Rnase A und T1) entfernt. Die RNA-RNA Hybride werden anschließend durch Ethanol-Fällung isoliert und durch Elektrophorese auf einem Sequenzierungs-Gel analysiert. Zur Herstellung der sequenz-spezifischen Hybridisierungs-Sonde wird die interessierende Sequenz in einem Plasmid-Vektor mit einem Bakteriophagen-Promotor kloniert. Der Plasmid wird mit einem Restriktionsenzym geschnitten und das so erhaltene DNA-Template mit Bakteriophagen-RNA-Polymerase unter Verwendung eines [α 32 P]-NTP transkribiert. Die markierte RNA-Sonde wird gereinigt, indem die DNA mit Deoxyribonuclease, Proteine durch Phenol/Chloroform-Extraktion und freie NTPs durch Ethanolfällung in Anwesenheit von 2M Ammoniumacetat entfernt werden. Alternativ ist eine Aufreinigung durch Gel-Elektrophorese möglich. Diese Technik bietet gegenüber der klassischen Kartierung durch S1-Analyse folgende Vorteile: Die Sonden-Herstellung ist einfach und schnell. (Normalerweise ist eine Aufreinigung durch Gel-Elektrophorese nicht notwendig.) Im Gegensatz zu endmarkierten oder durch Nick-Translation hergestellten Sonden, hängt die spezifische Aktivität der RNA-Sonde nur von der spezifischen Aktivität des markierten NTP s ab, nicht von der Effizienz der enzymatischen Reaktion. Die Sonden werden in großen Mengen und mit höherer spezifischer Aktivität hergestellt, was die Empfindlichkeit der Detektion stark erhöht. RNA-Sonden bilden mit RNA stabilere Doppelstränge als DNA-Sonden. Die Behandlung von RNA-RNA-Doppelsträngen mit Ribonuclease ist zuverlässiger und reproduzierbarer als die Reaktion von RNA-DNA-Hybriden mit S1-Nuclease, die von der Temperatur sowie der Enzym-Konzentration abhängen kann. Viele dieser Vorteile können auch bei der S1-Analyse erreicht werden, wenn man einzelsträngige DNA-Sonden mit eingebauten radioaktiv markierten dntps verwendet. Die häufigsten Probleme bestehen darin, daß die Sonden nicht ihre volle Länge erreichen oder ein starker Untergrund auftritt. Unvollständige Transkripte entstehen durch RNase- Kontaminierung oder durch Verzögerung oder vorzeitige Termination der RNA-Polymerase.
Letztere sind sequenz-spezifische Effekte, die durch geringe Konzentrationen des markierten NTPs noch verstärkt werden. Sie können durch Wahl einer relativ kleinen Sonde (100-300nt), hohe NTP-Konzentrationen und die richtige Wahl des markierten NTPs verringert werden, oder die Sonde kann gelelektrophoretisch aufgereinigt werden. Die Ursache für einen hohen Untergrund liegt häufig im unvollständigen Verdau des DNA- Templates in der Transkriptions-Reaktion, das dann wieder an die Sonde hybridisiert. Das Problem kann durch Verwendung einer frischen DNase-Präperation oder ebenfalls einer Aufreinigung der Sonde durch Gelelektrophorese gelöst werden. Eine zweite Ursache ist die Kontaminierung der Sonde mit sense-rna, die durch Überschuß an RNA-Polymerase oder Verwendung von DNA-Templates mit 3 -overhangs in der Transkriptions-Reaktion entsteht. Schon Spuren von sense-rna führen zu einem hohen Untergrund bei der Hybridisierung und werden am einfachsten durch elektrophoretische Aufreinigung der Sonde entfernt. Ein weiteres Problem kann die Spaltung innerhalb des RNA-RNA-Doppelstranges während des Ribonuclease-Verdaus sein, die meist durch RNase A verursacht wird und daher durch alleinige Verwendung von Rnase T1 vermieden werden kann, wobei dies allerdings die Auflösung der Kartierung der 5 -Enden vermindert. Primer-Verlängerung Mit dieser Methode ist ebenfalls eine Bestimmung der RNA-Menge und eine Kartierung der 5 -Termini möglich. Sie wird häufig zur Bestätigung der Ergebnisse aus den oben beschriebenen Analysen eingesetzt (s.u.). Prinzip Ein endmarkierter DNA-Primer (ein Oligonucleotid oder ein Restriktionsfragment) wird an die RNA-Probe hybridisiert und durch das Enzym Reverse Transcriptase unter Verwendung nicht-markierter Desoxynucleotide bis zum 5 -Ende des RNA-Templates verlängert. Die erhaltene DNA wird auf einem Sequenzierungs-Gel analysiert, die Länge des DNA- Fragments zeigt die Position des 5 -Terminus, die Ausbeute die Menge der RNA an. Diese Methode unterscheidet sich in einem wesentlichen Punkt von der S1-Analyse und dem Ribonuclease Protection -Assay: Bei diesen Techniken werden die Hybride an jeder Diskontinuität zwischen RNA und Sonde geschnitten, d.h. sowohl die Enden, als auch vorhandene Spleiß-Stellen liefern diskrete Banden im Analyse-Gel. Die Primer-Verlängerung
läuft dagegen über solche Spleiß-Stellen hinweg, es werden nur die RNA-Termini detektiert. Die Methode wird daher häufig eingesetzt, um die mit einer der beiden anderen Techniken detektierten Signale eindeutig einem RNA-Terminus oder einer Spleiß-Stelle zuzuordnen. Das Hauptproblem bei dieser Methode sind Abschnitte der RNA, die eine Verzögerung oder eine Termination der Reversen Transkriptase vor dem 5 -Ende der RNA verursachen. Dies können stark GC-reiche Regionen oder Sekundärstrukturen der RNA sein. Dadurch entstehen weitere Banden auf dem Analyse-Gel, die eine Interpretation der Ergebnisse erschweren und die Ausbeute an vollständig verlängerten Primern wird herabgesetzt. Um diese Artifakte zu reduzieren, sollte der Primer so ausgewählt werden, daß das vollständige Produkt relativ klein (<100nt) ist, und damit die Wahrscheinlichkeit für eine vorzeitige Termination möglichst gering wird. Die dntps sollten in großem Überschuß vorhanden sein, was Verzögerungen der Reversen Transkriptase vermeidet. Eine hohe Inkubations-Temperatur (42 C) vermindert den Effekt von Sekundärstrukturen.