Fluoreszenzmikroskopie MICHAEL DÖNGI 27.01.2016
Fluoreszenz Jablonski Diagramm Emittiertes Licht ist in der Regel energieärmer (langwelliger) als absorbiertes Licht (Stokessche Regel)!
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit -
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit -
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit -
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit -
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit -
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit -
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit -
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit -
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit -
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit -
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit - sin α = λ x
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit - sin α = λ x n Brechungsindex (n) von Luft =1; Wasser = 1.33; Öl und Glas 1.5
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit - sin α = λ x n λ x = n sin α Brechungsindex (n) von Luft =1; Wasser = 1.33; Öl und Glas 1.5
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit - NA = n sin α
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit - x = λ n sin α NA = n sin α x = λ NA
Auflösungsgrenze - Rayleigh-Kriterium (Konvention) - Beugung λ > D
Auflösungsgrenze - Rayleigh-Kriterium - Beugung λ > D r = f 1.22 λ D
Auflösungsgrenze - Rayleigh-Kriterium - x = f 0.61 λ D x = 0.61 λ NA Öl Luft λ = 500 nm NA = 1.4 NA = 0.75 x-y-auflösung: 217 nm 407 nm
Auflösungsgrenze - Axiale Auflösung - x = 2 λ n NA 2 Öl Luft λ = 500 nm NA = 1.4 NA = 0.75 x-y-auflösung: 217 nm 407 nm z-auflösung: 765 nm 1778 nm
Konfokale Fluoreszenzmikroskopie Detektor (Photomultiplier) "Pinhole" Dichroischer Spiegel Laser Fokusebene im Objekt Objekt
Photomultiplier (Photoelektronenvervielfacher)
Räumliche Auflösung (Pixelgröße, Nyquist-Theorem) Zeitliche Auflösung Bildentstehung
Bildentstehung Es ensteht kein Bild im optischen Sinne Laserkoordinate und Intensität werden im Rechner zu einem Bild kombiniert Die dargestellten Farben sind frei wählbar, der PMT detektiert nur die Anzahl der Photonen und damit die Lichtintensität und nicht die Wellenlänge des Lichtes.
Modulation der Laserintensität - Polarisatoren- Laserlicht ist meist linear polarisiert λ/2-plättchen (Verzögerungsplatte) Pockels cell AOTF oder AOTM
Anregung mit 1 Photon bei 400 nm 2 Photonen bei 800 nm 3 Photonen bei 1200 nm 2-Photonenmikroskopie
2-Photonenmikroskopie Die Wahrscheinlichkeit, dass 2 Photonen quasi gleichzeitig auf ein Farbstoffmolekül auftreffen, ist nur in einem sehr kleinen Volumen in der Focusebene gegeben.
2-Photonen vs. 1-Photon Laser Scanning Mikroskopie 1-Photon LSM: Pro: Verschieden farbige Fluoreszenzmoleküle getrennt von einander anregbar Bei schwacher Fluoreszenz ist durch Öffnung des PH (unter Einschränkung der Auflösung) eine Signalerhöhung möglich Contra: Keine konfokale Anregung Geringere Eindringtiefe Höhere Phototoxizität 2-Photonen LSM: Pro: Konfokale Anregung Geringere Streuung des Anregungslichts durch Gewebe höhere Eindringtiefe Geringere Phototoxizität Contra: Separation verschieden farbiger Fluoreszenzmoleküle oftmals nur durch Emissionsfilter möglich
Superresolution Microscopy 2014 wurde der Nobelpreis für Chemie an Stefan Hell, Eric Betzig und William E. Moerner verliehen for the development of super-resolved fluorescence microscopy Auflösungsgrenzen liegt jeweils bei ca. 20 nm. STED - Stimulated Emission Depletion - PALM - Photoactivated Localization Microscopy - STORM - Stochastic Optical Reconstruction Microscopy - Stefan Hell Eric Betzig, William E. Moerner Xiaowei Zhuang
STED - Stimulated Emission Depletion - Confocal laser scanning microscopy Overlayed with doughnut -shaped depletion beam Fluorescence from the zero area + =
The STEDup - Stimulated Emission Depletion - Excitation laser Beam scanner STED Laser Sample holder/ XYZ-stage Phase Mask (generation of doughnut ) Excitation: 635 nm; Detetection: 670/40 nm; pulsed STED: 760 nm @ 76 MHz Resolution: <50nm Sample holder/ XYZ-stage
STED - Stimulated Emission Depletion - Konfokal STED
STED - Stimulated Emission Depletion - konfokal STED Living cell, Actin-Chromobody Ilgen, unpublished
PALM bzw. STORM - Photoactivated Localization Microscopy bzw. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy - Verwendet werden Photoaktivierbare fluoreszierende Proteine (GFP Varianten, können durch Licht bestimmter Wellenlänge und Intensität gezielt aktiviert und deaktiviert werden)
PALM bzw. STORM - Photoactivated Localization Microscopy bzw. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy - Zunächst sind alle PA- FPs inaktiv
PALM bzw. STORM - Photoactivated Localization Microscopy bzw. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy - Durch einen kurzen Lichtblitz mit Licht geeigneter Wellenlänge werden einige wenige PA-FPs aktiviert. Die Aktivierung erfolgt nach dem Zufallsprinzip.
PALM bzw. STORM - Photoactivated Localization Microscopy bzw. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy - PA-FPs liegen im aktivierbaren Zustand vor.
PALM bzw. STORM - Photoactivated Localization Microscopy bzw. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy - Anregung der PA-FPs. Emissionslicht wird dedetktiert.
PALM bzw. STORM - Photoactivated Localization Microscopy bzw. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy - Fortschreitende Belichtung führt zum bleichen der PA-FPs.
PALM bzw. STORM - Photoactivated Localization Microscopy bzw. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy - Zuvor detektierte PA- FPs sind nicht mehr aktivierbar.
PALM bzw. STORM - Photoactivated Localization Microscopy bzw. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy - Es erfolgt eine erneute Aktivierung einer zufälligen Subpopulation von PA- FPs.
PALM bzw. STORM - Photoactivated Localization Microscopy bzw. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy -
PALM bzw. STORM - Photoactivated Localization Microscopy bzw. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy -
PALM bzw. STORM - Photoactivated Localization Microscopy bzw. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy - n-zyklen später gefolgt von einer aufwendigen Nachprozessierung (Dekonvolution etc.) der Bilddateien:
PALM bzw. STORM - Photoactivated Localization Microscopy bzw. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy -
PALM bzw. STORM - Photoactivated Localization Microscopy bzw. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy - Xu, K., Zhong, G., and Zhuang, X. 2013. Science 339:452 456
Anwendungsbeispiele von LSM
Visualisierung dynamischer Prozesse - Calcium Imaging - Isosbestischer Punkt (360 nm) Anregungsspektrum von Fluo-4 hohe Calciumkonzentration niedrige Calciumkonzentration 300 400 500 600 Wellenlänge (nm)
Beladen der Zellen mit Farbstoff Farbstoffinjektion Diffusion aus der Patch-Pipette Elektroporation Verwendung membrangängiger Acetoxymethylester (AM)
Beladung mit Acetoxymethylester Fura-2 Acetoxymethylester (membranpermeabel) Fura-2 (nicht membranpermeabel) O O O H3CCOH2OCH 2 C H3CCOH2OCH 2 C O N OCH CH O 2 2 O O O CH CO 2 H OCCH 2 3 N CH CO 2 H OCCH 2 3 O Esterase - OCH C 2 O O - OCH 2 C N OCH CH O 2 2 O - CH2CO N - CH2CO O O O CH 3 N O N O CH 3 COH OCCH 2 3 O O CO - O
ATP-induzierte Calciumfreisetzung in Astrozyten des Bulbus olfactorius
Spontane Calciumwellen im ONL
Visualisierung dynamischer Prozesse - Natrium Imaging - 3µM gramicidin D, 100 µm ouabain Doengi et al., PNAS 2009
Fluorochrome - Die Qual der Wahl - Das Absorptions- und Emissionsspektrum besteht nicht nur aus dem jeweiligen Maximum! Fluorescence SpectraViewer www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labelingchemistry/fluorescence-spectraviewer.html