nanoximet Oxidantien-Bildungspotential als Maß für die Gruppierung von Nanomaterialien und Voraussage von gesundheitlichen Auswirkungen auf den Menschen (Oxidant generating capacity as a metric to allow grouping of nanomaterials and prediction of human health effects) Bryan Hellack, Leticia Aragao-Santiago, Sonja Boland, Armelle Baeza-Squiban, Andrea Neumeyer- Sickinger, Catrin Albrecht, Roel Schins & Thomas Kuhlbusch Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V., Duisburg, Deutschland Leibniz-Institut für Umweltmedizinische Forschung, Düsseldorf, Deutschland Universität Paris Diderot Paris, Frankreich http://www.nanoximet.eu/
OXIDANTIEN-BILDUNGSPOTENTAL GESUNDHEITSSCHÄDIGENDE EFFEKTE Zielsetzung Azellulär Zellulär H 2 O 2 OH Fe, Zn, Cu ONOO O 2 O 2 UV 1 O 2 ROS Oxidativer Stress OH O 2 e - NO H 2 O 2 O 2 Nanopartikelgruppierung nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 2
AP 1 Management und Dissemination Konzept Partikelherstellung, -charakterisierung in versch. Flüssigkeiten AP 2 AP3 OXIDANTIEN-BILDUNSGFÄHIGKEIT Intrinsisches ROS Bildungspotential + Oxidantienbildung / Oxidativer Stress in Zellen AP 4 OXIDATIVER STRESS EVALUIERUNG Stufe 1 Antioxidantien Stufe 2 Entzündung Stufe 3 Zytotoxizität Sichere NM Modelierung (Risikovorhersage) AP 6 Gefährliche NM nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 3
AP 1 Management und Dissemination Konzept Partikelherstellung, -charakterisierung in versch. Flüssigkeiten AP 2 AP3 OXIDANTIEN-BILDUNSGFÄHIGKEIT Intrinsisches ROS Bildungspotential Oxidantienbildung / Oxidativer Stress in Zellen - Insbes. Vergleich zwischen intrinschem und zellulärem ROS - Harmonisierung der unterschiedlichen Methoden - Vereinfachung der Nanomaterialtestung + OXIDATIVER STRESS EVALUIERUNG AP 4 ROS / Effekte als Datengrundlage zwecks Gruppierung von NM hinsichtlich Stufe 3 Risikopotential Stufe 1 Stufe 2 Antioxidantien Entzündung Zytotoxizität Sichere NM Modelierung (Risikovorhersage) AP 6 Gefährliche NM nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 4
Materialien und Charakterisierung Material Name / Lieferant Ø in nm (REM o. BET*) TiO 2 NM100 / JRC 42-90 TiO 2 NM101 / JRC 6 TiO 2 NM103 / JRC 20 TiO 2 NM104 / JRC 20 Zn NM110 / JRC 42 CeO 2 NM212 /JRC 10 Al 2 O 3 Sigma Aldrich 13 Ag Skyspring Nanomaterial 20-30 Skyspring Nanomaterial 100 Ag Au Nanamor 10-20 BaSO 4 Solvay 10-150 Cu Sigma Aldrich 40-60 Fe(III) 2 O 3 Sigma Aldrich < 50 Ni Sigma Aldrich < 100 C Printex 90 10 C Lampblack 101 150 * Durchmesser aus BET errechnet Abb. 1 Schema zur Dispersionsherstellung Ultraschallbehandlung 200 W, 10 Min., Puls 2/8 Konzentration 1 mg/ml in dh 2 O, RPMI (+ HEPES + GlutaMax) und DMEM (+ HEPES) Medium nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 5
Materialien und Charakterisierung Charakterisierungsparameter Größe und Oberfläche: Dynamische Lichtstreuung, Rasterelektronenmikroskop, H-Kernspin (NMR), BET (Herstellerangaben und Eigenmessungen), Spraycharakterisierung (Nebulizer) Form (REM), ph Wert (ph Sonde), Zetapotential (Zetasizer), Redoxpotential (Redox-Kathode), Löslichkeit an ausgewählten Metallen (nach 72 h ICP-OES bzw. ICP-MS) ROS Bildungspotential: Elektronenspinresonanz (DMPO und CPH Ansatz), Fluoreszensspektroskopie (DCFH Methode), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC / Antioxidantien Ansatz) in: deionisiertem Wasser (dh 2 O) Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + HEPES RPMI 1640 Medium + HEPES und GlutaMax nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 6
Charakterisierung - Bsp. ROS intrinsisch Intrinsisches Oxidantien / ROS Bildungspotential H 2 O O 2 H 2 O 2 e- O 2 - Fe, Zn, Cu OH Elektronenspinresonanz Spektroskopie (ESR) (DMPO) (CPH) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Antioxidantien in synthetischer Lungenflüssigkeit (Ascorbin-, Harnsäure, Glutathion) Fluoreszenzspektroskopie Dithiothreitol (DTT) und/oder Dichlorofluorescin (DCFH) nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 7
Charakterisierung - ESR ESR Ergebnisse - Hydroxylradikal (OH ) Bildung (nach Standardarbeitsanweisung, SAA) H 2 O 2 DMPO OH DMPO-OH (5,5-dimethyl-1-pyrrolidin-N-oxid) OH Bildung Tabelle 1: Beispiel dh 2 O und RPMI Medium Verhältnis zum Blindwert dh 2 O RPMI n ratio to blank ratio to blank NM100 3 1.0 1.1 NM101 3 0.9 1.0 NM103 3 0.9 0.9 NM104 3 0.9 1.1 NM110 3 1.7 0.9 NM212 3 1.1 1.2 Ag100 3 4.0 1.5 Ag20-30 3 1.8 1.3 Al2O3 3 0.9 1.0 Au 3 0.9 1.2 BaSO4 3 0.8 1.0 Cu 3 3.7 1.0 Fe2O3 3 1.0 1.3 Ni 3 4.8 1.6 P90 3 0.8 in Bearbeitung LB101 3 1.0 in Bearbeitung Kontrolle 21 2.7 3.5 nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 8
Charakterisierung - DTT Dithiothreitol Verbrauch reduziert DTT oxidiert DTT + + H + + O 2 2O 2 - NM Suspension mit und ohne DTT 30 Min. bei 37 C Zentrifugation R-SH + DTNB TNB Absorption von TNB bei 405 nm Überstand (DTT) + DTNB Absorption 405 nm nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 9
Nicht oxidiertes DTT (µm) Nicht oxidiertes DTT (µm) Charakterisierung - DTT 300 200 100 0 8 16 32 64 128 256 Konzentration (µg/ml) 300 200 Lamp black Fe 2 O 3 Au ZnO Ag 100 nm Ag 20-30 nm Cu Printex90 TiO 2 NM 100 TiO 2 NM 101 TiO 2 NM 103 TiO 2 NM 104 100 CeO 2 BaSO 4 0 8 16 32 64 128 256 Konzentration (µg/ml) Al 2 O 3 nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 10
Charakterisierung - HPLC Synthetische Lungenflüssigkeit 200 µm Ascorbinsäure 200 µm Harnsäure 200 µm Glutathion ph 7.4, in 0.9% NaCl Antioxidantien Abreicherung c c 4 h Inkubation bei 37 o C 0.22 µm Zellulosefilter Nanopartikel Suspension 50 µl Quantifizierung mittels HPLC nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 11
GSH in µm GSSG ( M) Harnsäure in µm GSH ( M) Ascorbinsäure in µm Charakterisierung - HPLC Ascorbinsäure 250 200 150 100 50 0 250 200 150 Glutathion MixGSH-PDA p90 cu 100 250 200 150 100 50 0 Harnsäure 50 0 Printex 90 Cu MixGSSG-PDA p90 cu GSSG Glutathion (GSH) 250 250 200 150 100 50 0 Glutathion 200 150 100 50 0 Printex 90 Cu Glutathion dissulfid (GSSG) 4 µg/ml 8 µg/ml 16 µg/ml 32 µg/ml 64 µg/ml 128 µg/ml 256 µg/ml nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 12
Charakterisierung - Übersicht (vorläufig) Beispiel spez. Oberfläche (m 2 g 1 ) NM in dh 2 O spez. spez. Oberfl. spez. Oberfl. spez. Oberfl. spez. Oberfl. Oberfl. nach berechn. aus berrechn. aus Hydrodyn. spez. Oberfl. nach NMR nach BET BET mittl. Größe Primärpartikelgröße Ø via DLS berrechn. aus (IUTA) (IUTA) (Hersteller) (Hersteller) (Hersteller) (IUTA) DLS (IUTA) Ag20-30 18 Nm n. v. --- 22.9 787 0.73 Ag100 4 Nm n. v. --- 5.7 751 0.76 Au 13 Nm n. v. 20.7 --- 1712 0.18 Al2O3 96 95 85-115 --- 116.8 337 4.51 P90 303 297 300 --- --- 288 10.42 LB101 21 25 20 --- --- 1297 2.31 BaSO4 34 38 41.4 --- 35.6 150 8.87 NM100 10 7 10 5.2 --- 326 4.73 NM101 406 305 316.7 40.6 257.1 654 2.36 NM103 66 53 50.8 7.6 70.8 461 3.07 NM104 58 56 56 21.1 70.8 265 5.35 NM110 15 12 12.4 5.4 19.3 -- -- NM212 25 Nm 28 29.4 24.9 369 2.23 Ni nicht messbar Nm n. v. 6.7 --- nicht messbar nicht messbar Cu nicht messbar Nm n. v. --- 13.5 413 1.63 Fe2O3 nicht messbar Nm n. v. --- 22.9 673 1.70 n. v. = nicht vorhanden, Nm = Nachmessung notwendig nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 13
Toxikologische Untersuchungen - Übersicht Methode Zelluläre Oxidantien-bildung via DCFH Assay Zellen Zelluläre Oxidantien-bildung via ESR (DMPO, teilweise CPH) DNA Schädigung via Comet Assay, H2AX (Immunohistochemie) Glutathion (GSH) Konzentration Zytotoxizität via WST-1 NR8383 Alveolarmakrophagen der Ratte A549 humane Alveolarepithelzellen NCI-H292 humane Lungenepithelzellen THP-1 humane Makrophage Genexpression induziert durch oxidativen Stress nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 14
Zytotoxizität Zellen 48 h, 70 % Konfluenz WST-1(wasserlösliches Tetrazoliumsalz) Zellviabilität 2x Belastung 24 h 100 µl Zellmedium Inkubation mit WST-1 2x 100 µl 0.5% Triton X-100 NR8383 Alveolarmakrophagen der Ratte A549 humane Alveolarepithelzellen NCI-H292 humane Lungenepithelzellen THP-1 ausdifferenziert (PMA) zu Makrophagen Absorption (nach Vietti et al. 2013, leicht geändert) nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 15
Mitochondriale Aktivität (relativ zur Kontrolle in %) Mitochondriale Aktivität (relativ zur Kontrolle in %) Zytotoxizität - Ergebnis 175 150 125 100 75 50 25 0 NCI-H292 0.31 µg/cm 2 0.62 µg/cm 2 1.25 µg/cm 2 2.5 µg/cm 2 5 µg/cm 2 10 µg/cm 2 20 µg/cm 2 40 µg/cm 2 175 150 125 100 75 50 25 0 THP-1 0.62 µg/cm 2 1.25 µg/cm 2 2.5 µg/cm 2 5 µg/cm 2 10 µg/cm 2 20 µg/cm 2 40 µg/cm 2 nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 16
Zytotoxizität - Ergebnis Dosis-Response Probit Analysis LC 50 (µg/cm 2 ) Nanopartikel A549 Zellen NR8383 Zellen TiO 2 / NM100 160.7 466.9 TiO 2 / NM101 >1000 >1000 TiO 2 / NM103 646.7 246.9 TiO 2 / NM104 224.4 >1000 Zn / NM110 3.6 9.3 CeO 2 / NM212 366.9 366.8 Al 2 O 3 >1000 >1000 BaSO 4 >1000 >1000 Ag 20-30 nm 440.3 >1000 Ag 100 nm 466.3 >1000 Au >1000 >1000 Cu 0.6 0.8 Fe(III) 2 O 3 199.7 73.6 Ni 71.7 47.8 Lamp Black 101 >1000 779.3 Printex 90 >1000 927.7 NR8383: 40.000 Zellen pro Well = 0,32 cm 2 A549: 10.000 Zellen pro Well = 0,32 cm 2 Getestete Konzentrationen: 1, 2, 5 10, 20, 40 und 80 µg/cm 2 Toxizität Hoch Moderat Keine / Gering nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 17
Toxizität - weitere Ergebnisse (vorl.) DCF Assay z.b. starke Fluoreszenz (ROS Bildung) für Printex 90, LB101 und beide Silberpartikel sowie moderate für die Metalle und teilweise auch TiO 2 ESR mit DMPO (NR8383) TiO 2 keine Effekte aber z.b. Ni und Cu Stufen der oxidativer Stressresponse: Nrf2 Signalweg (Tier 1): Induktion der mrna-expression von Gamma Glutamylcystein Synthetase ( -GCS) und Hemeoxygenase-1 (HO-1) z. B. durch CuO und ZnO (NM110) NF- B Signalweg (Tier 2): Induktion der mrna-expression von z. B. inducible Nitric Oxide Synthase (inos) durch ZnO, CuO und CeO 2 bei höheren Konzentrationen und Ausschüttung der Zytokine IL-8 und TNFα z.b. für Carbon Black (Printex90), ZnO (NM110) und CuO nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 18
Laufende Arbeiten Abschließende Grundcharakterisierung toxikologische Untersuchungen: - Oxidatives Potential (ESR) - Weitere Untersuchungen verschiedener oxidativer Stressmarker (z.b. Glutathion, Dihydroethidium, Monobromobiman) - Lipidperoxidation (Bodipy 665/667) - mrna/proteinexpressionanalysen - DNA Schädigung (Comet Assay und H2AX ) - Apoptose - JC-1 (Mitochondriale Membran), Vybrant FAM (Caspase) - Kalziumlevel - Fura-2 - Untersuchung der Bedeutung des Nrf2 Signalwegs (sirna, primären Knochenmarksmakrophagen aus Wildtyp- und Nrf2-knockout-Mäusen) Datenanalyse Gruppierung z.b. über Rang-, Korrelations-, Cluster- und Regressionsanalyse nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 19
Danke! http://www.nanoximet.eu/ Institut für Energie- und Umwelttechnik e. V., Duisburg, Deutschland Leibniz-Institut für Umweltmedizinische Forschung, Düsseldorf, Deutschland Universität Paris Diderot Paris, Frankreich nanoximet NanoCare, 20. Mai 2015, Frankfurt 20