Praktikum IV, SS 07 Biologieversuch 2-23.05.2007 Proteinanalyse mittels SDS-PAGE (SDS Polyacrylamid Gel-Elektrophorese) Zahner Michele (zahnerm@student.ethz.ch) Büchi Luca (lbuechi@student.ethz.ch) Reibisch Philipp (rephilip@student.ethz.ch) Bigler Sandro (biglers@student.ethz.ch) Assistentin: Tessa Lühmann 04.06.2007
Zusammenfassung Proteine lassen sich mithilfe von SDS-PAGE aufgrund ihres Molekulargewichtes trennen. Werden Proteine Reduktionsmittel und Hitze ausgesetzt, verändert sich ihre Struktur. Im Falle von Proteinkomplexen zerfallen diese in ihre Bestandteile, was mit SDS-PAGE nachgewiesen werden kann. 1. Einführung Die Gel-Elektrophorese ist eine in der Biochemie verbreitete Methode, um Moleküle aufgrund ihres Molekulargewichts voneinander zu trennen. Ziel des Versuches war es, am Beispiel von ausgewählten Proteinen das Verfahren besser kennen zu lernen und anhand des Ergebnisses Aussagen über die verwendeten Proteine zu machen und mit der Literatur zu vergleichen. 1.1 Gel-Elektrophorese Kernpunkt dieses Verfahrens ist das als Trennmedium dienende Gel. Das Gel ist ein Copolymerisat aus Acrylamid und N,N-Methylenbisacrylamid, welches je nach Verhältnis und Konzentration der Ausgangsstoffe stark in der Konsistenz beeinflusst werden kann (Abb. 1). Die Polymerisation wird mit Abb. 1: Struktur des Polyacrylamid-Gels [2] Ammonimpersulfat (APS) initiiert und durch Tetramethylethylendiamin (TEMED) katalysiert [1]. Anschliessend werden die zu trennenden Moleküle in einem Elektrolyten gelöst und mit elektrischer Spannung (typischerweise einige 100 V) durch das Gel zum Laufen gebracht. Dabei bewegen sich die Moleküle bei gleicher Ladung desto langsamer, je grösser sie sind. Im spezifischen Falle der SDS-PAGE wird dem Elektrolyten das Tensid SDS (Natriumdodecylsulfat) beigegeben. SDS lagert sich besonders gut an der Oberfläche von Proteinen an und bildet somit eine homogene Flächenladung, welche die ursprüngliche Molekülladung maskiert. Als Referenz dient jeweils ein Standard. Dieser Standard ist ein Gemisch verschiedener Proteine bekannten Gewichtes, womit man die erhaltenen Laufdistanzen vergleichen und somit auf das Molekulargewicht schliessen kann. 2
1.2 Vorbehandlung Proteine sind komplexe Gebilde, welche aus langen gefalteten Peptidketten bestehen. Die biologisch aktive Form eines Proteins hat eine bestimmte räumliche Anordnung (Sekundär-, Tertiär-, und Quartärstruktur), welche massgeblich durch Wasserstoff- und Disulfidbrücken bestimmt wird. Durch Erhitzen und mit Reduktionsmittel können diese Brücken gespalten werden. Das Protein wird denaturiert und Proteinkomplexe zerfallen in ihre Unterproteine. 1.3. Verwendete Proteine Bovine serum albumin (BSA) Albumin ist in den meisten Säugetieren das häufigste Blutprotein. Es reguliert den osmotischen Druck des Blutes und dient als Transportmedium für viele essentielle lipophilen Stoffe, die sonst nicht im Blut löslich wären. Die Struktur des Rinderalbumins (BSA) ist globular und besteht aus einer einzigen Untereinheit von 66 kda [3]. Fibronectin Fibronectin ist ein Glykoprotein, welches viele Aufgaben erfüllt. Unter anderem spielt es in der Wundheilung eine Rolle. Strukturell ist Fibronectin aus zwei Untereinheiten von je etwa 250 kda [3] aufgebaut, welche durch Disulfidbrücken zusammengehalten werden. Antikörper (IgG) Das Immunsystem verwendet Antikörper, um im Organismus Fremdkörper aus dem Verkehr zu ziehen. Das IgG-Antikörperprotein ist Y-förmig aufgebaut, wobei die Arme des Ypsilons dazu dienen, an die Antigene des Fremdkörpers anzudocken. Strukturell kann man beim Antikörperprotein 4 Untereinheiten ausmachen: 2 identische schwere Ketten und 2 identische leichte Ketten, welche durch Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Dabei wiegen die schweren Ketten je etwa 48 kda und die leichten je 25 kda [3]. Collagen (Typ I) Die mechanische Belastbarkeit der Sehnen, Knorpel und des Bindegewebes ist hauptsächlich auf das Strukturprotein Collagen zurückzuführen. Die ausserordentliche Zugfestigkeit des Proteins ist auf dessen Aufbau zurückzuführen. Collagen setzt sich aus drei seilartig verdrillten Polypeptidketten zusammen, welche untereinander durch Wasserstoffbrücken verknüpft sind. Jede dieser Polypeptidketten wiegt dabei etwa 100 kda [3]. 3
2. Materialien und Methoden 2.1. Lösungen BSA 10!g/ml je 2x Fibronectin 10!g/ml je 2x Antikörper IgG 10!g/ml je 2x Collagen (Typ I) 10!g/ml je 2x Der einen Serie wurde reduzierender Puffer, der anderen nicht-reduzierender Puffer zugeben. Alle Proben wurden anschliessend 5 min lang auf 90 C erwärmt. Laufmittel 0.25 M Tris (Puffer) 1.92 M Glycin 1% SDS Anschliessend das Ganze mit H2O 1:10 verdünnen Farbstofflösung 0.1% Coomassie briliant blue R 250 25% Ethanol 10% Essigsäure Auf 1 Liter auffüllen (H2O) 2.2. Herstellung des Gels Für SDS-PAGE müssen zwei Gele hergestellt werden: Zum einen das eigentliche Trenngel (separating Gel) und zum andern das so genannte Stapelgel (stacking Gel), welches für das korrekte Laufverhalten der Proben sorgen soll. Separating Gel 3.75 ml 30% Acrylamid 3.75 ml 4 x Separating Puffer 7.5 ml doppelt dest. H2O 50!l 10% APS 10!l TEMED Stacking Gel 650!l 30% Acrylamid 1.25 ml 4 x Stacking Puffer 3.05 ml doppelt dest. H2O 25!l 10% APS 5!l TEMED 4
2.3. Ablauf Laufgel zubereiten, 1 stunde polymerisieren lassen Proteinlösungen herstellen Stacking Gel zubereiten, 40 min polymerisieren lassen Proteinlösungen und Referenzlösung einfüllen (je 200!l) Spannung anlegen (Allmählich bis 400 V steigern), Laufzeit 60 min Gel 30 min lang in Farbstofflösung baden Farbstoff Auswaschen (10% Essigsäure, 20% Ethanol in Wasser) Gel einscannen und auswerten. Von den erhaltenen Daten wurde eine Kalibrationskurve erstellt, das heisst es wurde der Logarithmus des Molekulargewichts der Proteine gegen die Mobilität (in Pixel, aus dem Scan) aufgetragen. Die Erwartung ist eine Gerade mit negativer Steigung (kleine Moleküle laufen schneller). 3. Resultate 3.1. Gel Abb. 2 zeigt das Trenngel nach der Versuchsdurchführung. Zur Übersicht wurden die Referenzpunkte mit roten Linien verdeutlicht. Der Kontrast der Collagen-Spalten wurde nachträglich erhöht um die Sichtbarkeit der Lauffronten zu erhöhen. Abb. 2: Trenngel nach der SDS-PAGE mit eingezeichneten Lauffronten 5
3.2. Kalibrationskurve Abb. 3 zeigt die Kalibrationskurve. Sie wurde anhand der aus der Literatur [3] entnommenen Molekulargewichte der Proteine und den gemessenen Mobilitäten erstellt. Fibronectin (Dimer) Fibronectin (Monomer) Collagen 200 kda IgG komplett Collagen 100 kda BSA IgG schwere Kette Abb. 3 Kalibrationskurve. Die Daten wurden aus Abb. 2 und der Literatur entnommen [3]. 6
4. Diskussion Die Kalibrationskurve und der Vergleich mit der Referenz lassen auf eine gute Verlässlichkeit der Methode schliessen. Die Mobilität der Proteinbestandteile und die der Referenz stimmen in den untersuchten Fällen gut überein. Im Falle von BSA konnte das Molekulargewicht von 66 kda bestätigt werden. Erwartungsgemäss hatte die Behandlung mit dem Reduktionsmittel keine feststellbaren Folgen auf die Laufdistanz, da BSA aus lediglich einer Untereinheit besteht. Die seltsame Form der Lauffront der oxidierten Probe wurde auf Anomalien im Stacking-Gel zurückgeführt. Das Verhalten der beiden Fibronectin-Proben ist ebenfalls verständlich. In der Oxidierten Probe ist noch Dimer (500 kda) nachweisbar, während das reduzierte Fibronectin vollständig in die zwei gleich schweren (250 kda) Einzelbestandteile zerfallen ist. Die oxidierte Antikörper-Probe weist eine etwas überraschende Front auf, dennoch können die Banden gut erklärt werden: Die Bande bei ca. 120 kda stellt den intakten Antikörper dar, während die Banden um 50 kda die schwere Kette beinhalten. Die leichten Ketten sind demnach schon aus dem Gel gelaufen. Auch hier hat das Reduktionsmittel die Zersetzung des Proteins zur Folge, während die Wärmebehandlung allein nicht die gesamten Moleküle zu spalten vermag. Bei den beiden Collagen-Proben wurde leider zu wenig Lösung aufgetragen, so dass die Banden von blossem Auge kaum zu sehen waren. Erst die Anpassung des Bildkontrastes konnte die Banden sichtbar machen. Bei dieser Probe gehen Resultate und Erwartungen am weitesten auseinander. So ist es uns nicht möglich, die Bande bei 60 kda zu erklären. Der Literatur zufolge besteht Collagen aus drei gleich schweren miteinander verdrillten Fasern. Es wurden jedoch 3 Banden bei etwa 220, 120 und 60 kda nachgewiesen. Die Banden bei 220 und 120 können als Dimer bzw. Monomer der Collagen-Unterkette aufgefasst werden, die Bande bei 60 passt aber nicht in dieses Bild. Ausserdem fehlt eine Bande bei 300 kda, welche bei der oxidierten Probe erwartet wurde. Möglicherweise entstanden Ablesefehler wegen der geringen Intensitäten der Banden oder die getroffenen Annahmen sind falsch. Die Vorbehandlung der Proben könnte unvorhergesehene Folgen gehabt haben. Des Weiteren ist auch eine schlechte Qualität des verwendeten Ausgangsproduktes nicht auszuschliessen. 7
5. Referenzen [1] http://de.wikipedia.org/wiki/polyacrylamid [2] http://www.steve.gb.com/images/molecules/polymers/polyacrylamide.png [3] Roempp Online, http://www.roempp.com 8