Protokoll zur Übung PCR

Protokoll zur Übung PCR im Rahmen des Praktikums Labor an der TU Wien Durchgeführt bei Ao.Univ.Prof. Mag. Dr.rer.nat. Robert Mach Verfasser des Protokolls: Gwendolin Korinek 0625083 & Daniel Bomze 0726183 Versuche durchgeführt am 25.01.2010

Inhaltsverzeichnis 1 Theoretischer Hintergrund 3 1.1 Aufgabenstellung................................ 3 1.2 PCR....................................... 3 1.3 Steriles und sauberes Arbeiten........................ 4 2 Praktische Durchführung 6 2.1 Vorbereitung der PCR............................. 6 2.2 PCR-Programm................................ 6 2.3 Behandlung mit Restriktionsenzym...................... 7 2.4 Gelelektrophorese................................ 7 3 Auswertung u. Ergebnis 8 3.1 Scan des Agarosegels.............................. 8 4 Anhang 10 4.1 Tabellen..................................... 10 2 Bomze Daniel 0726183

1 Theoretischer Hintergrund 1.1 Aufgabenstellung Aufgabe war es das Prinzip der Polymerase Chain Reaction (PCR) an Hand der Amplifikation eines DNA-Fragmentes zu verstehen und die PCR durchzuführen. Weiters sollte die Analyse der amplifizierten DNA mit Hilfe des Restriktionsenzyms Hpa II durchgeführt werden. 1.2 PCR PCR steht für Polymerase Chain Reaction. Darunter versteht man den Vorgang mittels Nukleotiden, einer Templat-DNA sowie einer Polymerase bestimmte DNA-Sequenzen zu amplifizieren. Dabei wird im ersten Schritt die Templat-DNA mittels Hitze aufgeschmolzen (darunter versteht man die Trennung der 2 verbunden DNA-Stränge in zwei einzelne Stränge). Als nächstes kann sich der Primer, das ist ein Oligo-Nukleotid mit einer bestimmten Basen-Sequenz, an die einzelnen DNA-Stränge anlagern (Annealing). Die Anlagerung erfolgt typischerweise nur an einer bestimmten Stelle. Am 3 -Ende des Primers beginnt die Polymerase, die neue DNA-Sequenz zu synthetisieren. Dafür sind Nukleotide notwendig, die durch die Polymerase zu dem DNA-Strang verbunden werden. Als Koenzym benötigt die Polymerase Magnesium-Ionen. Daher finden PCR-Reaktionen stets in wässriger Lösung von Magnesiumsalzen (meist MgCl 2 ) statt. Da gewöhnliche Polymerasen bei Temperaturen von über 75 C längst denaturieren würden, ist es für die PCR notwendig, spezielle Hochtemperatur-Polymerasen einzusetzen. Diese wurden aus Mikroorganismen gewonnen, die man gewöhnlich in Geysiren oder in unmittelbarer Nähe von Vulkanen findet. Ein Beispiel dafür ist die sogenannte Taq-Polymerase. Sie wurde aus dem Bakterium Thermus aquaticus gewonnen, welches in Geysiren bei rund 70 C lebt. Die einzelnen Schritte wie Primeranlagerung, Strangsynthese und Denaturierung sind temperaturabhängig. Daher wird ein Temperaturprogramm gefahren, sodass die jeweilige Temperatur für den jeweiligen Schritt ideal ist. Weiters ist es günstig, wenn der Deckel des Eppendorfgefäßes, in dem die PCR durchgeführt wird, beheizt wird. Die Beheizung soll dabei eine höhere Temperatur erzielen als die höchste im PCR-Programm verwendete Temperatur, um ein Kondensieren der Lösung am Deckel zu verhindern. Die so gewonnene DNA kann anschließend noch charakterisiert werden. Dazu benutzt 3 Bomze Daniel 0726183

man Restriktionsenzyme, die die DNA an bestimmten Stellen schneiden und somit DNA- Fragmente mit charakteristischer Größe entstehen lassen. Somit kann überprüft werden, ob wirklich die Teile der DNA-Sequenz amplifiziert worden sind, die erwünscht waren. Da die Größe der DNA-Fragmente natürlich mit freiem Auge nicht sichtbar ist, bedarf es einer Technik, die Fragmente ihrer Größe nach zu ordnen und anschließend sichtbar zu machen. Dazu bedient man sich der Gelelektrophorese und Anfärbung der DNA mittels Ethidiumbromid. Die Gelelektrophorese nutzt die Tatsache, dass beim Anlegen einer Spannung an ein Agarosegel Teilchen in Abhängigkeit ihrer Größe unterschiedlich schnell im Gel wandern. Der Vernetzungsgrad lässt sich über die Konzentration des Gels steuern. Je stärker das Gel vernetzt ist, desto langsamer können große Moleküle in ihm wandern. Der Vernetzungsgrad muss daher auf die erwartete Molekülgröße angepasst werden. Durch die Zugabe von Ethidiumbromid in das Elektrophoresegel ist eine Sichtbarmachung der aufgetrennten DNA-Fragmente möglich. Dabei wird das Ethidiumbromid zwischen die Basen der DNA eingebaut und dabei die Fluoreszenzausbeute von Ethidiumbromid um den Faktor 50-100 erhöht. Wird nun das Gel mittels UV-Licht bestrahlt, so erscheint das Gel dunkel und die mit Ethidiumbromid behandelten DNA-Fragmente erscheinen rosa. Die Intensität der Fluoreszenzstrahlung hängt primär von der Menge an DNA in der jeweiligen Bande ab (bei gleicher Wellenlänge des UV-Lichts). 1.3 Steriles und sauberes Arbeiten Beim Arbeiten mit DNA ist größtes Augenmerk auf sterile und saubere Arbeitsweise zu legen. Da auf der menschlichen Haut sehr viele Nukleasen vorhanden sind (als Schutzmechanismus für den Körper), ist ein direkter Hautkontakt mit den Geräten und Lösungen auf jeden Fall zu verhindern, da die Nukleasen sonst in die Reaktion eingebracht werden könnten. Dies würde dazu führen, dass die frisch gebildete DNA sofort wieder abgebaut wird. Weiters muss bedacht werden, dass durch das Einbringen von Hautschuppen o. Ä. auch DNA in die Lösung gelangen kann, die dann eventuell anstelle der gewünschten DNA amplifiziert wird. Eine Fremd-DNA Quelle können auch Mikroorganismen sein, die quasi ubiquitär sind. Es muss daher darauf geachtet werden z.b. mit Pipettenspitzen möglichst nirgends anzukommen, außer an den Lösungen und Gefäßen die unbedingt notwendig sind. Außerdem müssen die Pipettenspitzen und Eppendorfgefäße sterilisiert sein. Ein anderer Grund für besonders sauberes Arbeiten ist die Mutagenität von Ethidiumbromid. Ethidiumbromid interkaliert in die DNA und sorgt so für deren Anfärbung am Agarosegel nach der Elektrophorese. Da die Interkalierung jedoch die DNA verändert, führt das zu Mutation und kann somit zu bösartigen Tumoren führen. Es ist daher stets darauf zu achten, dass Geräte die mit Ethidiumbromid in Berührung kommen speziell gekennzeichnet und gereinigt werden. Das Arbeiten ist nur mit Nitrilhandschuhen zu 4 Bomze Daniel 0726183

empfehlen, da die Durchbruchszeit von Ethidiumbromid bei Latex-Handschuhen zwischen 30 und 60 Sekunden liegt. Weiters dürfen Lösungen, die mit Ethidiumbromid verunreinigt sind nicht direkt ins Abwasser eingebracht werden. Diese müssen erst mit Aktivkohle behandelt werden, da diese das Ethidiumbromid adsorbiert und es somit aus der Lösung abgeschieden wird. Die kontaminierte Aktivkohle kann anschließend durch Thermobehandlung (Pyrolyse) unschädlich gemacht werden. 5 Bomze Daniel 0726183

2 Praktische Durchführung 2.1 Vorbereitung der PCR In einem 500 µl Eppendorfgefäß wurden der so genannte Master Mix für die PCR in fünffacher Menge zusammen pipettiert. Dabei wurde darauf geachtet, dass die Polymerase als letztes zugegeben wurde, da das Enzym sehr temperaturempfindlich ist und daher alle folgenden Schritte auf Eis durchgeführt werden mussten. Obwohl die Taq-Polymerase sehr temperaturbeständig ist, nimmt ihre Aktivität bei zunehmender Temperatur stark ab, daher wird die Lösung so lange wie möglich bei niedrigen Temperaturen gehandhabt und gelagert. Als Primer wurden LR1 sowie SRCR eingesetzt. Der Name der Probe lautete ITS 117. Die restliche Zusammensetzung des Probenansatzes ist in Tabelle 4.1 zusammengefasst. Nachdem der Master Mix fertig gestellt wurde, wurden jeweils 45 µl Master Mix mit 5 µl Proben-DNA in einem kleinen Eppendorfgefäß gemischt. Außer den Gefäßen mit den DNA-Templaten wurde auch noch eine sog. Blank-Probe hergstellt. Diese enthielt alle Bestandteile des Master Mixes, allerdings ohne DNA-Template. Würden sich also nach der PCR bei der Gelelektrophorese hier DNA Fragmente zeigen, so ließe das auf eine Kontamination der Reagenzien schließen. 2.2 PCR-Programm Der Deckel des PCR-Gerätes wurde während der PCR auf 104 C geheizt, um ein Kondensieren des PCR-Gemisches am Deckel der Eppendorfgefäße zu verhindern. Das Temperaturprogramm startete mit einem initialen Denaturierungsschritt bei 94 C für 60 Sekunden. Bei diesem Schritt sollte die Templat-DNA in ihre zwei Einzelstränge zerlegt werden, sodass es den Primern anschließend möglich ist, sich auf den entsprechenden Stellen anzulagern. Erst nach diesem Denaturierungsschritt startete der eigentliche zyklische Reaktionsschritt: Denaturierungsschritt 94 C 45 s Primer Anlagerung 54 C 60 s Primerverlängerung (Synthese) 74 C 90 s Diese Schritte wurden 30 mal wiederholt und anschließend wurde in einem letzten Schritt die Temperatur von 74 C für 7 Minuten gehalten. Nach dieser Zeit wurde die Reaktion auf 16 C abgekühlt. 6 Bomze Daniel 0726183

2.3 Behandlung mit Restriktionsenzym Um charakteristische DNA-Fragmente aus der amplifizierten DNA herzustellen, wurde ein Aliquot von 10 µl des PCR-Ansatzes mit 10 µl des Restriktionsmixes versetzt. Dieser Restriktionsmix bestand aus 1 µl des Restriktionsenzyms Hpa II, dem 10 fach verdünnten Restriktionspuffer A sowie destilliertem, sterilen Wasser. Die genaue Zusammensetzung ist Tabelle 4.2 zu entnehmen. Das Enzym schneidet selektiv an der Basen-Sequenz CCGG, wobei zwischen den beiden Cytosinbasen geschnitten wird. Das Reaktionsgemisch wurde für eine Stunde bei 37 C inkubiert. 2.4 Gelelektrophorese Die Gelelektrophorese wurde auf einem Agarosegel durchgeführt. Zur Herstellung des Agarosegels wurden 2,25 g Agarose in 150 ml TAE-Puffer aufgeschlämmt (entspricht einem 1,5 %igem Gel) und diese Mischung anschließend in der Mikrowelle so lange erhitzt, bis eine klare Lösung entstanden war. Nachdem diese Lösung auf 50 C temperiert worden war, konnten noch 5 µl Ethidiumbromid Lösung hinzugefügt werden. Anschließend wurde das Gel in den Gelgießstand gegossen und mit einem Kamm versehen, der die Taschen für die Probenaufgabe erzeugen sollte. Das Gel wurde bei Raumtemperatur aushärten gelassen und bis zum nächsten Tag im Kühlschrank gelagert, um ein Austrocknen zu verhindern. Der Kamm wurde aus dem Gel entfernt und das Gel wurde in die Elektrophoresekammer gelegt. Anschließend wurde der TEA-Puffer als Laufpuffer in die Kammer gefüllt. Eine Mischung aus Xylencyanol, Bromphenolblau und Glycerin wurden als Loading Dye den Proben zugesetzt. Das Glycerin diente dabei dazu, die Dichte der Lösung zu erhöhen, sodass beim Pipettieren der Lösungen in die Elektrophoresetaschen keine Mischung der Lösung statt findet, sondern sie direkt in die Taschen absinkt. Es wurden jeweils 40 µl PCR-Produkt mit 8 µl Loading Dye und 20 µl der Lösung mit den geschnittenen DNA-Fragmenten mit 4 µl Loading Dye versetzt. Von diesen Mischungen wurden jeweils 10 µl der PCR-Produkt-Lösung und 20 µl der Lösung mit den geschnittenen DNA-Fragmenten in die Taschen pipettiert. Außerdem wurden noch 2 Kammern mit einem DNA-Längen-Standard (GeneRuler 50bp DNA Ladder) gefüllt, um anschließend die Größe der DNA-Fragmente bestimmen zu können. Die Elektrophorese wurde bei 80 V und unlimitierten Strom für rund 1 Stunde 10 Minuten laufen gelassen. Anschließend wurde das Gel aus der Elektrophoresekammer genommen und nach dem Abtropfen des Laufpuffers mittels UV-Licht bestrahlt. Durch die Bestrahlung wurde das interkalierte Ethidiumbromid zur Fluoreszenz angeregt und die dadurch sichtbaren DNA-Banden konnten mit einer Kamera fotografiert werden. 7 Bomze Daniel 0726183

3 Auswertung u. Ergebnis 3.1 Scan des Agarosegels Abbildung 3.1: Scan der mit Ethidiumbromid gefärbten DNA im Agarosegel nach der Elektrophorese Abbildung 3.1 zeigt das fotografierte Agarosegel unter UV-Licht nach der Elektrophorese. Das Bild wurde in Schwarz/Weiß aufgenommen, um einen möglichst guten Kontrast zwischen DNA-Banden und Agarosegel herzustellen. Marker B1 P1 R1 P2 R2 P3 R3 B2 P4 R4 P5 R5 P6 R6 Marker Tabelle 3.1: Aufgabeschema der Elektrophorese Tabelle 3.1 gibt das Aufgabeschema der Proben an. Marker steht für die DNA-Längen- Standards, B1 und B2 sind die beiden Blank-Proben. R steht jeweils für die mit Restrik- 8 Bomze Daniel 0726183

tionsenzym behandelten Proben und P schließlich steht für die PCR-Produkte. Sofort erkennt man, dass die beiden Blank-Proben keinerlei sichtbare DNA-Banden enthalten. Es lässt sich daher auf die Sauberkeit der Chemikalien schließen sowie auf die saubere und korrekte Arbeitsweise der durchführenden Personen. Weiters erkennt man die DNA-Längen-Standards, welche sich jeweils auf den äußersten Positionen des Gels befinden. Man erkennt, dass die DNA-Fragmente aufgetrennt wurden, jedoch der Abstand zwischen den jeweiligen Banden sehr gering ist. Hätte man das Gel länger laufen gelassen, wäre die Auftrennung vermutlich besser geworden. Die Proben 1-3 lassen kaum DNA erkennen. Dies lässt auf eine ungenügende PCR zurück schließen. Gründe dafür könnten zu wenige Primer oder zu wenig Nukleotide in der Lösung sein. Eventuell wurde beim Herstellen des Master-Mix für die ersten 3 Gruppen ein Fehler gemacht und zu wenig oder gar keine Primer bzw. Nukleotide zugegeben. Der Kontrast wurde soweit wie möglich mit Hilfe der Software Gimp verbessert. Es war jedoch nicht möglich, weitere Banden bei den Proben 1-3 sichtbar zu machen. Die Größenbestimmung der DNA-Fragmente wurde daher an Probe 4 durchgeführt. Bei P4 sind 2 Banden erkennbar. Die erste Bande besteht aus amplifizierter DNA-Sequenz und hat eine Größe von rund 700 bp. Weiters ist eine Bande direkt an der Front erkennbar. Diese besteht aus Primer-Dimeren mit einer ungefähren Größe von 50 bp. Bei der Probe 4, die mit dem Restriktionsenzym versetzt wurde (R4), sind drei Banden erkennbar. Die erste Bande entspricht einer Größe von rund 300 bp, die zweite Bande entspricht einer Größe von rund 120 bp. Bei der letzten Bande dürfte es sich wieder um Primer-Dimere mit einer ungefähren Größe von 50 bp handeln. Hier fällt auf, dass die Summe der geschnittenen Fragmente nur in etwa 420 bp anstatt der erwarteten zirka 700 bp ergibt. Diese Abweichung ist so groß, dass sie nicht durch Abschätzfehler allein erklärbar wäre. Es wäre denkbar, dass die Probe aus je zwei Fragmenten mit 300 bp sowie einem Fragment à 120 bp besteht. Damit würde die Summe der Fragmente 720 bp ergeben, was innerhalb des Fehlerbereiches des Schätzfehlers liegt. Da jedoch beide Probenbanden in etwa gleich intensiv sind, erscheint dies nicht allzu plausibel. Es ist aber erkennbar, dass der Bereich, in dem die Primer-Dimere zu sehen sind, recht stark verbreitert ist. Möglicherweise haben die Restriktionsenzyme Teile des DNA-Fragmentes so gut geschnitten, dass nur noch sehr kleine Fragmente < 120 bp über geblieben sind, welche den fehlenden Anteil an Basenpaaren in Vergleich mit dem Wert des nicht behandelten DNA Fragmentes erklären könnten. 9 Bomze Daniel 0726183

4 Anhang 4.1 Tabellen Volumen [µl] Stoff 5 Proben-DNA 5 Taq-Polymerase-Puffer (MgCl2-Frei, 10 fach) 5 MgCl2 (25 mm) 2 LR1 (20 ng/µl) Primer 2 SRCR (20 ng/µl) Primer 1 dntps (2mM von jedem Nukleotid) 29,8 steriles Wasser 0,2 Taq DNA Polymerase Tabelle 4.1: Zusammensetzung des PCR-Mixes Volumen [µl] Stoff 10 PCR-Produkt 2 Restriktions Puffer A (10 fach) 7,5 steriles Wasser 1 Restiktionsenzym Hpa II Tabelle 4.2: Zusammensetzung des Restriktions-Master-Mixes 10 Bomze Daniel 0726183

Tabellenverzeichnis 3.1 Aufgabeschema der Elektrophorese...................... 8 4.1 Zusammensetzung des PCR-Mixes...................... 10 4.2 Zusammensetzung des Restriktions-Master-Mixes.............. 10 11 Bomze Daniel 0726183