Dr. Arnulf Hartl Biochemische Übungen Proteine Tag 1: Tag 2: Tag 3: Konzentrieren Denaturierende und native Fällungen Protein Konzentrationsbestimmung Entsalzen Gelchromatographie Dialyse Elektrophorese SDS-Page
Dialyse Entfernung oder Austausch von niedermolekularen Verbindungen aus einer Lösung Standardverfahren zum Entfernen von (NH 4 ) 2 SO 4 aus Ammoniumsulfatfällungen oder zur Umpufferung von Proteinlösungen für die Säulenchromatographie. Prinzip: Semipermeable Membran, die von Proteinen nicht durchquert werden kann anorganische Salze und niedermolekulare Verbindungen können passieren Cut-Off der Membranen (PVDF, Cellulose) von 1-50 kda Rollenware muß durch kochen in 0.1 M NaHCO3/10 mm EDTA und sorgfältiges Spülen rehydriert werden (Aufbewahrung in 70% EtOH)
Effekt geringer Ionenkonzentration Bei physiologischer Ionenstärke werden die Ladungen der Proteine durch Salzionen kompensiert Je geringer die Ionenkonzentration im Lösungsmittel ist umso eher neigen die Proteine dazu ihre Oberflächenladung gegenseitig durch Aggregatbildung zu kompensieren. Große Aggregate fallen aus. Praxis: Verdünnen oder Dialyse gegen Wasser
Dialyse Schema Dichtheit prüfen, Puffer öfter wechseln, Leitfähigkeit kontrollieren. Konzentration durch Dialyse gegen 20 % PEG 6000 oder festes PEG oder Sephadex 250 möglich.
Ultrafiltration
Ultrafiltration durch Zentrifugation Centricons
Chromatographie Chromatographische Trennmethoden präparativ oder analytisch LC (Liquid chromatography) Mikhail Semyonovich Tswett 1872-1919 HPLC (High performance / high pressure liquid chromatography) FPLC (fast performance / fast protein liquid chromatography)
Trennkapazität
Trennkapazität vs Selektivität Affinitätsreinigung Wechselwirkung einer Substanz mit einer Affinitätsmatrix Trennkapazität nur 1 aber extrem hohe Selektivität! 1 Step Reinigung aus sehr komplexen Gemischen
Löslichkeit Gut löslich: Intrazelluläre und cytosolische Proteine (Enzyme) Schlecht löslich: Proteine des Cytoskellets und Membranpoteine Hydrophobe integrale Membranproteine aggregieren in wässriger Lösung und fallen aus -> Detergentien als Pufferzusatz
Verfügbare Menge Transkriptionsfaktoren Rezeptoren Häufige Proteine, Enzyme Überexprimierte Proteine Albumine im Blutplasma wenige Kopien / Zelle einige Tausend Kopie % Gesamtprotein > 50 % Gesamtprotein 90 % Gesamtprotein Gewebe, Entwicklungs Funktionsspezifisch erhöhte Expression
Feste Phase Mobile Phase Analyt Verzögerter Transport der einzelnen Komponenten; das Eluat benötigt eine charakteristische Zeit oder Volumen um die Säule zu verlassen (Retentionszeit, Retentionsvolumen) Eluat
Gradienten
Niederdruckchromatographie Zusätzlich evtl. Gradientenmischer, Magnetventile, Pumpe
Durchflußmonitore Durchflußphotometer Durchflußrefraktometer Durchflußfluorimeter Radioaktivitätsdurchflußzähler UV 260-280 nm oder UV-VIS Brechungsindex Fluoreszenz ß-Counter
Fraction-Collectors Pumpe besser vor statt nach der Säule wg. Unterdruckfreisetzung von gelösten Sauerstoff Zeitgesteuerte Fraktionensammler Volumsgesteuerte Fraktionensammler Programmierbare mit peak-thresholding und Steuerung von Magnetventilen
Packen der Säulen Homogen ohne Kanäle, Luftblasen, Schichten und fines Batch-Verarbeitung mehrmals äquilibrieren, sedimentieren und dekantieren /dickflüssige entgaste Suspension unter Betriebsdruck packen. Kontrolle: Gelfiltration: Anionenaustauscher: Kationenaustauscher: Bromphenolblau, Dextran Blue Malachitgrün Orange II Lagerung: Mit NaN 3 gegen mikrobielles Wachstum im Kühlraum Laden mit Pasteurpipette oder Dreierventil und Spritze
Chromatographische Trennmethoden
Siebchromatographie Gelfiltration Ausschlußchromatographie
Säulenmaterialien Porosität bestimmt Ausschlußgröße: G10 G 50 für Peptide (Pharmacia NAP columns) zum : Abtrennen von Salzen, Umpuffern statt Dialysieren. Probe kann bis zu 20 % des Säulenvolumens betragen.
Trennschärfe vs Korngröße Coarse, medium, fine, superfine Diffusionsstrecke zwischen den Partikeln wird geringer!
Ionenaustauschchromatographie Reinigung nach Ladungsunterschieden Prinzip: Bei der IC binden Proteine durch elektrostatische WW an eine Säulenmatrix. Anionenaustauschchromatographie: Die Matrix trägt positiv geladene Gruppen die über einen weiten ph Bereich protoniert vorliegen (DEAE). Gegenionen sind Anionen z.b. Cl - Ionen. Unter Austausch diese Gegenions kann ein negativ geladenes Molekül von der Ionenaustauschsäule gebunden werden Kationenaustauschchromatographie: Säulenmatrix trägt negativ geladene Gruppen (Carboxymethylgruppen) die über einen weiten ph Bereich negativ geladen sind. Gegenionen sind Kationen z.b. Na+ Ionen die gegen ein positiv geladenes Molekül ausgetauscht werden können.
ph und Proteine Im sauren ph Bereich sind die Aminogruppen von Lys, Arg, His protoniert das Protein zeigt kationische Verhalten Im basichen ph Bereich überwiegen die negativen Ladungen von Glu, Asp das Protein tritt als Anion auf
ph und pi Der Gesamtladungszustand ist abhängig vom ph Wert der Lösung Überwiegen die neg. geladenen AS -> pi < 6 = saures Protein Überwiegen die pos. geladenen AS -> pi > 8 = basische Protein
Beispiel Kationenaustauscher Je stärker das Protein geladen ist, desto stärker ist die elektrostatische Wechselwirkung und Bindung an den Ionenaustauscher Bsp: Elution mit steigender Konz. Kationen (Kalium-Ionen) von einem Kationenaustauscher
Aufgabenstellung der Versuche A.1. Dialyse einer Proteinlösung nach Ammoniumsulfatfällung gegen H2O. Leitfähigkeitsbestimmung vor und nach der Dialyse. B.1. Packen einer Chromatographiesäule mit Sephadex G-25 (Polydextran-Säulenmaterial mit einer Ausschlußgröße von etwa 10 kd (entspricht der Ausschlußgröße einer Dialysemembran). B.2. Durchführung einer Gelchromatographie mit Modellsubstanzen (Bromphenolblau, MW 691 und Dextranblau, MW 2x10E6) für Makromoleküle und kleinere Moleküle. Bestimmung von Vo und Vt. B.3. Entsalzen von Proteinen aus Hasenserum nach Ammoniumsulfatfällung mit anschließender Leitfähigkeitsmessung und Proteinbestimmung der Fraktionen. C.1. Bestimmung der Ionenkonzentration (Leitfähigkeitsmessung) D.1. Bradford-Proteinassay mit Mikrotiterplattenphotometer