Stochastische Genexpression Genetische Schalter und Multistabilität Vorlesung System-Biophysik 12. Dez. 2008 Literatur Kaern et al. Nature Reviews Genetics Vol.6 p.451 (2005) Ozbudak, Oudenaarden et al (2004) Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli, Nature 427, p737
Das Operon-Modell Francois Jacob und Jaques Monod, 1961 operon Operon: Genetische Funktionseinheit, die aus regulierten Genen mit verwandter Funktion besteht und enthält: - Promotor: Bindungsstelle für RNA-Polymerase - Operator: kontrolliert Zugang der RNA-Polymerase zu Strukturgen - Strukturgene: Polypeptide codierende Gene zusätzlich: Regulatorgen: codiert Repressor Campbell, N.A., Biology
Ein Transkriptions-Aktivator und ein Transkriptions-Repressor kontrollieren das lac- Operon
Genregulation und boolesche Netze from Weiss, 2000
Boolesche Darstellung des Lac-Operons
Genetische Netze Genregulatorisches Protein translation transcription
Transkriptionsfaktoren zeigen in der Regel Kooperativität (z.b. durch Dimer-Bildung) ( CI) M + ( CI) M " ( CI) D " ( CI) D + O " CIO! K D =! ( CI ) M [ CI ]!! [ ] 2 ( ) D! Kooperative Bindung [ ] ( [ ] = CI) M " = CIO O total K # K D + [ ] 2 [( CI) ] 2 M
Wiederholung
Genregulation und boolesche Netze from Weiss, 2000
(Nature, Dec 99)
Der genetische Toggle Switch (Flip-Flop)
Der Repressilator (genetische Oszillator)
Circadian Rhythm - die biologische Uhr [Latein. circa about + dies a day] Genetisch kontrollierte Oszillationen von ungefähr 24h angepasst an den Tag-nacht Zyklus. Eine einzelne Genmutation ist für das vererbbare Früh-Schlaf-Syndrom verantwortlich (familial advanced sleep phase syndrome, FASPS). Der 24h Rythmus ist robust und die Phase an den Tag/Nacht Helligkeits-Zyklus gekoppelt
Die circadiane Uhr bei Drosophila Zwei Proteine Per (Period) und Tim (timeless) regulieren sich gemeinsam und bilden einen dimeren Komplex. Monomeres Per im Kern unterdrückt die Expression. Die Kinase DBT (double time) phosphoryliert und degradiert Per. Die Komplexbildung Per/Tim unterstützt den Eintritt in den Kern und bleibt dort 8-10h stabil. Dadurch verzögert sich der negativ feedback loop.
Verzögerter negative feedback via dclk (dclock) (degradation) und dbt (doubletime) (Transport) Synchronization (Entrainment) durch Sonnenlicht abhängige TIM Zerfallsrate
Eine Reihe von Phosphorylierungsschritten sind Teil der Verzögerungskette
Was ist Leben? Schrödinger betrachtete 1943 in einer Vorlesung über Physik und Biologie die Konsequenzen der molekularen Natur des genetischen Codes. 1. Wie kann biologische Ordnung (Leben) mit den Gesetzen der Physik erklärt werden? 2. Wie bewältigt Leben die statistische Natur molekularer Wechselwirkungen?... wenn wir so empfindliche Organismen wären, daß ein einzelnes Atom oder meinetwegen ein paar Atome einen wahrnehmbaren Eindruck auf unsere Sinnesorgane machen könnten - du lieber Himmel, wie sähe das Leben dann aus!
Zur Bedeutung stochastischer Fluktuationen in der Biologie Rauschen kann z.b: durch positive feedback loops verstärkt mit dem Vorteil, dass: In fluktuierenden Umgebungen haben heterogene Zellpopulationen bessere Wachstumschancen. (siehe z.b. Kontrolle des Lac Operon, Lysis-Netzwerk der λ-phage Immunsystem) Diversifikation in isogenen Phenotypen und Zelltypen (z.b. Stammzelldifferenzierung) Effizienzsteigerung von Signaltransduktion (z.b. chemotaxis Regulation oder Stochastische Resonanz (Hören)) Rauschen kann durch negative feedback loops unterdrückt werden Stabilisierung des metabolischen Haushalts / Homeostasis
Biochemisches Rauschen: Fluktuation der Proteinkonzentration Rauschen im biochemischen Prozess der Expression: Geringe Anzahl der Kopien vieler Komponenten, z.b. regulatorische Moleküle (siehe TMG, IPTG), RNA Polymerase Stochastische Effekte in der Gen- Expression spielen große Rolle für Variation der Protein-Konzentration von Bakterien mit identischem Erbgut etablieren anfängliche Asymmetrien, welche durch Feedback- Mechanismen verstärkt werden und damit die Entwicklung der Zelle bestimmen
Deterministisches Model der Genexpression from JJ Collins, Nature Reviews 2005
Definitionen zum Rauschen Varianz Verteilung! Rauschen! " 2 = A2 # A 2 n p( j) = ( j ) " t z #1 k 1 j k 2 n" j ( ) n k 1 + k 2 % ( ) = # N = A( t) 2 $ A( t) 2 ' ' A( t) 2 & ( * * ) 1 2 z: Anzahl der Meßpunkte! Rauschamplitude nimmt als Funktion der Proteinkonzentration ab! Rao, Wolf,Arkin, Nature 2002
Effekt der kleinen Zahlen (finite size effect) 0.1µM entspricht 30 Moleküle/Bakterium x : Mittelwert " x : Standardabweichung!! " = # x x " #1 N (Rauschen)! Herabsetzen der Transkriptionsrate und des Zellvolumen um den gleichen Faktor hält! den Proteinlevel konstant erhöht aber die Fluktuationen.
Translational bursting beschreibt den Effekt, dass ein Heraufsetzen der Translationsrate auch die Fluktuationen verstärkt. Herabsetzen von Transkriptionsrate und Zellvolumen Proteinlevel konstant Fluktuationen erhöht
Langsame Promotoren erhöhen das Rauschen niedrige Promoterrate höhere Transkriptionsrate Transcriptional bursting
Modelle für Rauschen Set von Differential-Gleichungen (deterministisch): Set von Differential-Gleichungen (stochastisch) Langevin Gleichungen: C: Konzentrationen, t: Zeit, v: stoichiometrische Matrix, r: Raten, x(t): Weißes Raueschen Modellierung oft durch Wahrscheinlichkeits-Dichte Funktion Beispiel Isomerisierung mit Simulation für Isomerisierung: k 1 = k 2 = 1s -1 k 1 k 2 state A state B
Experiment zur stochastischen Gen-Expression Unterscheide zwischen intrinsischem (biochem. Prozess der Gen-Expression) und extrinsischem (Fluktuationen anderer Zellkomponenten, z.b. Konzentration von RNA Polymerase) Rauschen Idee für Experiment: Gen für CFP (grün fluoreszierendes Protein) und YFP (rot fluoreszierendes Protein) werden durch den gleichen Promotor kontrolliert, d.h. mittlere Konzentration von CFP und YFP in einer Zelle gleich => Wahrscheinlichkeit für Expression sollte sich in einer Zelle nur durch intrinsisches Rauschen unterscheiden A: kein intrinsisches Rauschen => Rauschen korreliert rot+grün=gelb B: intrinsische Rauschen => Rauschen unkorreliert, verschiedene Farben Elowitz, M. et al, Science 2002
Stochastische Genexpression in einer einzelnen Zelle Elowitz, M. et al, Science 2002 Zwei unterscheidbare Gene (CFP and YFP) unter Kontrolle desselben Promoters Geringe Induktion: (wenig Fluoreszenz) hohes Rauschen Starke Induktion: (hohe Fluoreszenz) geringes Rauschen
Stochastic gene expression Extrinsic noise: cell to cell variance of expression Intrinsic noise: inherent stochasticity at identical external conditions! " = # x x (noise) 2 " tot 2 = " int 2 + " ext
Elowitz et al. 2002
Das intrinsische Rauschen fällt mit zunehmender Proteinkonzentration ab! =! + 2 2 2 tot int! ext Elowitz, M. et al, Science 2002