Charakterisierung von Weizen aus unterschiedlichen Anbauformen mit Profiling-Methoden Georg Langenkämper, Christian Zörb, Karsten Niehaus 1, und Thomas Betsche Bundesforschungsanstalt für Ernährung und Lebensmittel Institut für Biochemie von Getreide und Kartoffeln, Detmold 1 Abteilung für Proteom- und Metabolomforschung, Lehrstuhl für Genetik, Universität Bielefeld 58. Tagung für Getreidechemie in Detmold vom 20. 21. Juni 2007
Förderung des Projektes durch das Bundesprogramm Ökologischer Landbau Projektlaufzeit: November 2005 Oktober 2007
Gliederung Einleitung Fragestellung Untersuchungsmaterial: DOK-Weizen Ergebnisse 1. Profiling von Metaboliten 2. Profiling von Proteinen Schlussfolgerungen
4,7 % Anteil an der landwirtschaftlichen Nutzfläche (Bundesdurchschnitt)
Fragestellungen 1. Hat die Anbauform einen Einfluss auf Inhaltsstoffe des Weizens? 2. Gibt es anbauspezifische Inhaltsstoffprofile?
Untersuchungsmaterial: Weizen Getreide aus einem Feldversuch mit kontrolliertem ökologischem und konventionellem Anbau DOK - Feldversuch Variablen ausgeschaltet: Standort, Klima, Sorten
D O K Feldversuch Seit 1978 7-gliedrige Fruchtfolge Löss-Parabraunerde Forschungsinstitut für biologischen Landbau (FiBL) und Forschungsanstalt Agroscope Reckenholz-Tänikon, Schweiz
Anbauformen Organisch Dynamisch Konventionell Mineralisch Keine Düngung org dyn conv min null
Ergebnisse zum DOK Versuch Eigenschaften ÖKO Referenz Boden: N, K, P, - a, e Boden: ph, organische Substanz, Biodiversität, Biomasse + a, f Kornertrag - a, e Hektolitergewicht, Tausendkorngewicht = e Proteinkonzentration - b, e Ballaststoffe, Fructan, Phytinsäure, Oxalsäure, Antioxidantien = b Mineralstoffe, Spurenelemente + / - b, d Aminosäuren = e Metabolit-Profiling + / - c a Mäder et al., 2002, b Langenkämper et al., 2006a, c Zörb et al. 2006, d Langenkämper et al., 2006b, e Mäder et al. 2007, f Fließbach et al 2007
P r o f i l i n g Drei prinzipielle Anwendungsebenen Transkripte Proteine Metabolite
Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Gesamt Ionenstrom (x10 6 ) 10 5 0 10 5 org conv Fumarat Valin Citrat Malat Glukose Ribitol (IS) Saccharose Raffinose 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Zeit (min) Gesamtionen-Chromatogram methanolischer Extrakte
Lysin Threonin relative Einheiten 1,5 1,0 0,5 B B B A A 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 AB BC C A A 0 null dyn org ökologisch conv min konventionell 0 null dyn org ökologisch conv min konventionell
β-alanin Pantothensäure 0,4 A 0,15 A AB AB relative Einheiten 0,3 0,2 0,1 BC C AB AB 0,10 0,05 B B 0 null dyn org ökologisch conv min konventionell 0 null dyn org ökologisch conv min konventionell
Jahre 2005 und 2006 2005 Titlis Aminosäuren Zucker und Zuckeralkohole organische Säuren andere α-alanin α-glycerophosphat β-alanin Fructose 2-Aminoadipate Adenosin Metabolite Prolin Citrat Glutamat Gluconat Ribitol (IS) Fumarat Uracil Asparagin Glucose Malat Harnstoff Glycin Succinat Shikimat Isoleucin Saccharose Pyruvat Pantothensäure Lysin Raffinose Threonin Ribose Tyrosin Maltose α-ketoglutarat Tryptophan 2-Hydroxyglutarat Methionin Arginin Histidin Leucin Homoserin Phenylalanin Serin 2-Isopropylmalat 4-Aminobutyrate 2006 Runal myo-inositol Valin Glycerat
Panthothensäure - Vitamin B5 β-alanin Pantoinsäure Pantothensäure Coenzym A
Metabolite Zusammenfassung 45 Metabolite wurden identifiziert Die Konzentrationen von 15 Metaboliten waren verschieden Die Schwankungsbreiten der Konzentrationen betrugen maximal 50 % In den Sorten Runal (Anbau 2006) und Titlis (Anbau 2005) traten die meisten Konzentrationsunterschiede bei unterschiedlichen Metaboliten auf Konzentrationen von β Alanin war in den organischen Anbauformen in beiden Sorten und Anbaujahren signifikant geringer
Protein-Profiling Extraktion von Gesamtprotein aus Weizenschrot - Fällung mit Aceton/TCA - Extraktion mit Lysepuffer mit nicht-ionischem Detergenz Auftrennung des Proteinextrakts in 2D-Gelelektrophorese: 1. Isoelektrische Fokussierung 2. SDS-PAGE Auswertung der Gele Massenspektrometrische Identifizierung von Proteinen
Protein-Profiling von Weizen Zweidimensionale Gelelektrophorese Mw [kda] Organisch ph 3 Mineralisch ph 10 ph 3 ph 10 78,0 66,3 42,7 30,0
Probe A Gelauswertung Probe B 1) Einzelgele 2) Mittelwertgele + 3) Overlay (Ausschnitt)
Gelauswertung Overlay (Ausschnitt) 3D Ansicht relative Proteinexpression 100 75 50 25 0 1 2 A B
Anzahl der Proben im Protein-Profiling vier Feldwiederholungen je Anbauform pro Feldwiederholung drei Extrakte und 2D-Gele fünf Anbauformen und zwei Anbaujahre 120 2D-Gele erstellen und auswerten (bis 1000 Proteine pro Gel) Fokussierung des Protein-Profiling auf Weizen dyn und min von zwei Anbaujahren Protein-Profiling in Weizen anderer Anbauformen mit gleichen Trends
Protein Profiling von Weizen aus den Anbauformen dyn und min 1049 verschiedene Proteine in 24 2D-Gelen detektiert 37 Proteine in ökologsich-dynamischen Weizen geringer exprimiert 2 Proteine in ökologsich-dynamischen Weizen verstärkt exprimiert Expressionsunterschiede bei diesen 39 Proteinen in zwei Anbaujahren gefunden
Identifizierung von Weizenproteinen mit unterschiedlicher Expression ph 3 ph 10 HMW Glutenin UE Mw [kda] 120 80 60 74 77 39 162 76 327 50 40 30 152 295 55 250 137 271 268 114 247 229 Serpin 214 231 108 194 GAP-DH 107 197 171 94 173 LMW Glutenin Peroxidase 1 40 312 20 275 Sample Gel Image: D2 48d Kopie
Proteine mit unterschiedlicher Expression Speicherproteine Globulin 1 5 HMW Glutenine 6 LMW Glutenine 2 Triticin-Vorläufer Enzyme Aldose-Reduktase ähnliches Protein β-amylase Glycerinaldehyd 3-Phosphat Dehydrogenase granule bound Stärkesynthase-Vorläufer Peroxidase 1 Peroxiredoxin Stärkesynthase Saccharosesynthase Typ 2 2 Xylanasen, A-Ketten Familie Andere Eukariotischer Initiationsfaktor Serpin 13 Proteine nicht identifiziert
relative Proteinexpression 1,2 0,8 0,4 LMW Glutenin B A 0,4 0,2 HMW Glutenin Untereinheit 1By9 B A 0 dyn min 0 dyn min ökologisch konventionell ökologisch konventionell
0,9 0,6 0,3 0 Serpin A B dyn min ökologisch konventionell relative Proteinexpression
Glycerinaldehyd 3-Phosphat Dehydrogenase Peroxidase 1 0,12 0,4 relative Proteinexpression 0,08 0,04 b a 0,3 0,2 0,1 b a 0 dyn min 0 dyn min ökologisch konventionell ökologisch konventionell
Zusammenfassung Protein Profiling 1049 Proteine detektiert, davon 132 per MALDI-TOF identifiziert 37 Proteine in ökologisch-dynamischem Weizen mit geringerer Expression überwiegend Speicherproteine wie Globuline, HMW und LMW Glutenine sowie Enzyme 2 Proteine in ökologisch-dynamisch Weizen mit erhöhter Expression eine Peroxidase und ein nicht identifiziertes Protein Expressionsunterschiede bei 39 Proteinen in zwei Anbaujahren gefunden Ergebnisse für organische und konventionelle Anbauform in Tendenz gleich
Schlussfolgerungen Weizen der verschiedenen Anbauformen im DOK Versuch sind nicht gleich: Signifikante Konzentrationsunterschiede von β-alanin und von 39 Proteinen wurden in zwei Anbaujahren festgestellt. Die signifikanten, aber kleinen, Unterschiede bedeuten keine ernährungsphysiologisch andere Qualität. Ökologisch und konventioneller Weizen ist gleichwertig.
Dank an Dr. Aiko Barsch (Universität Bielefeld) Dr. Paul Mäder (FiBL, Frick) Monika Null-Greulich (BfEL Detmold) Ursula Leckeband (BfEL Detmold)
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!