Polizei sucht Täter FALL: Polizei hat ein Photo des Täters veröffentlicht Polizei sucht einen Mann der Dienstag früh in einer Maske ein Laboratorium ausgeraubt hat. Er hat einen Medizinstudenten getötet, der mehrmals ins Gesicht und in den Rücken geschossen wurde. Über die Waffe hat die Polizei keine Mitteilung gemacht. Die Polizei hat den Täter als einen Mann in seiner frühen 20er Jahren beschrieben, der etwa 190 cm hoch ist und eine Make, graue Jeans und ein schwarzes Shirt getragen hat. Diese Tiere müssen von den Strassen verschwinden, sie sollten gehängt werden," sagte der Sicherheitswachmann der die Leiche gefunden hat. Detektive haben aus 5 Verdächtigen Blutproben genommen. MISSION: Ihre Aufgabe ist den Tatort unterzusuchen und die dort genommenen DNA- Proben mit den Proben der Verdächtigen zu vergleichen.
Menschen lügen aber Beweise lügen nicht Arten der Beweise: - indirekt (z.b. Photo) - direkt (z.b. Haare) - kalter Beweis (Textilien) - heisser Beweis (DNA)
Quellen der biologischen Beweise Blut Sperma Speichel Harn Haare Zähne Knochen Gewebe Blut Nur sehr wenig Blut (3 l) wird gebraucht um das DNA-Profil zu bestimmen
ORGANIC DNA-Extraktion aus Blut Filter Paper Blood stain SDS, DTT, EDTA and proteinase K CHELEX-Methode Blut Wasser Apply blood to paper and allow stain to dry INCUBATE (56 o C) VORTEX QUANTITATE DNA PERFORM PCR Centrifuge Phenol, chloroform, isoamyl alcohol Centrifuge TRANSFER aqueous (upper) phase to new tube TE buffer CONCENTRATE sample (Centricon/Microcon-100 or ethanol precipitation) Centrifuge INKUBATION Überstand wegwerfen 5% Chelex INKUBATION (65 o C) INKUBATION (100 o C) Bestimmung der DNA Konz. PCR Zentrifugieren Zentrifugieren PUNCH WASH Multiple Times with extraction buffer REMOVE supernatant PCR Reagents (NO DNA QUANTITATION TYPICALLY PERFORMED WITH UNIFORM SAMPLES) PERFORM PCR Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
Praktikumsaufgabe: 0. Probenahme am Tatort 1. DNA-Isolierung 2. DNA-Amplifikation (PCR) 3. Gelelektrophorese 4. Analyse der Proben
1. Aufgabe: DNA-Isolierung aus Lymphozyten Probe: Blut auf einem Stück Textil Schneiden Sie die Hälfte des Blutflecks aus und legen Sie es in ein Eppendorf-Röhrchen Geben Sie 1000 l sterilem Wasser zur Probe Vortexen Inkubation bei Raumtemperatur für wenigen Minuten Vortexen Zentrifugieren für 2 min mit 1500 rpm Pipettieren Sie daraus 950 l Geben Sie 150 l 1% Chelex Lösung + 50 l ProtK Enzyme zu den Proben Inkubieren Sie das Röhrchen in Ihren Händen für wenigen Minuten Vortexen 65 C o 2 min, (ProtK Inaktivierung) Egen Sie die Probe auf Eis
2. Was für eine Komponenten brauchen wir zur PCR? Geben sie die folgenden Komponenten zu 5 l DNA- Probe: 26,5 l destilliertes Wasser 5 l PCR Puffer Mix Primer 1 (forward) 2,5 l Primer 2 (reverse) 2,5 l 5 l dntp Mix 2,5 l MgCl 2 letztlich: 1 l Ultra Fast DNA Polymerase (auf Eis zu lagern) LASSEN SIE DIE PCR REAKTION LAUFEN!
PCR Program: CSI 1. 95 C o 2 min 2. 95 C o 10 sec 3. 55 C o 15 sec 4. 72 C o 20 sec 30x: Schritt2-Schritt4 1 min 72 C o 4 C o (Gesamtzeit: ca. 30 min)
Was sind die Schritte der PCR?
Die verschiedene Methoden die in Gerichtsmedizin bekannt sind Was bedeutet RFLP? Was bedeutet Multiplex PCR? Hoch Statistischer Kraft der genetischen Diskrimination Langsam Langsam RFLP Multi-Locus Probes RFLP Single Locus Probes mtdna PCR: HV1, HV2 Speed of Analysis (Technology) Multiplex PCR of STRs PolyMarker D1S80 single STR DQ ABO Blut Gruppe Schnell Figure 1.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
Minisatellite Marker (D1S80) Flanking Regione Repeat Region GAGGACCACCAGGAAG 16 bp repeat unit STR Marker (TH01) Flanking Regione Repeat Region TCAT 4 bp Repeat Untereinheit Figure 5.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
Polymorphismen auf den homologen Chromosomen (A) Length polymorphism: VNTR oder STR Technik: (VNTR-PCR) ---------(AATG)(AATG)(AATG)---------- ---------(AATG)(AATG)---------- 3 Repeats 2 Repeats (B) Sequence polymorphism: SNP Technik: (AS-PCR) --------AGACTAGACATT------- --------AGATTAGGCATT------- Figure 2.5, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
Erste Fälle der DNA-Identifizierung
Probleme mit RFLP: relativ viel DNA wird gebraucht (50 ng = tausende von Zellen). Nicht ideal für Gerichtsmedizin, da oft nur wenige, degradierte Proben zur Verfügung stehen Kurze Geschichte der gerichtsmedizinischen DNA-Methoden 1900s: Landsteiner: Entdeckte die ABO Blutgruppen: Revolution in der gerichtsmedizinischen Methodologie. Kraft der Methode: 10 3 Sir Alec Jeffreys 1980s: RFLP+DNA detektiert durch Southern blotting. Alec Jeffreys entwichelte das erste DNA Profiling für Krankheitsmarker. Kraft der Methode: 10 6 Mitte der 1980er: Der Colin Pitchfork Fall in England: der erste DNA-Beweis benutzt vom Gericht. Zwei junge Frauen vergewaltigt und ermordet in Narborough, England. 5,000 lokale Menschen wurden nach Blu/Speichelproben gefragt. Erster Freispruch und Verurteilung an Hand vom DNA-Beweis von Jeffreys
Kurze Geschichte der gerichtsmedizinischen DNA-Methoden 1984: Entwicklung der PCR von Karry Mullis Funktioniert mit kleineren Mengen (1-2ng), mit Proben schlechter Qualität 1986: PCR von STR: Nicht-kodierende, 4-7 Nukleotid-langee Sequenzen, welche hoch variabel in der Anzahl der Wiederholungen zwischen Menschen ist! Braucht <1ng of DNA um 13-15 STR Loci zu untersuchen. Kraft der Methode: 10 14-10 23 1987 FBI mit NIH hat kollaborative Forschung begonnen um Techniken der DNA-Identifizierung auszuarbeiten: der Combined DNA Index System (CoDIS) ist ein Datenbank von DNA-Profilen aus Verbrechern und Tatortproben. 1990er: DNA Analyse wurde als unfehlbar gesprochen beim Strafverfahren.
Der O.J. Simpson Fall Prozess des Jahrhunderts: Dollars gegen DNA oder California vs OJ Simpson. 1995: OJ Simpson Urteil: unschuldig'
CODIS Combined DNA Index System (FBI und NIH) 13 CODIS STR Loci mit chromosomalen Positionen Geschlechtsspezifisches Marker
FBI s STR LOCI
Neue, erweiterte STR Loci verwendet von FBI, InterPol, usw.
Im Fall von 13 Markern ist die Wahrscheinlichkeit dass zwei Proben identisch sind : ca.1:1000 000 000 In welchen Fällen ist diese Wahrscheinlichkeit grösser?
Was sind die technische Grundlagen der STR produkt- Analyse? Laser Kapillar Elektrophorese Capillary filled with polymer solution - + (cathode) 5-20 kv (anode) Detecti on window Inlet Buffer Outlet Buffer Sample Sample tray moves tray automatically beneath the cathode end of the capillary to deliver each sample in succession Data Acquisition Kapillarrohr Primers sind markiert mit Fluoreszenzstoff Elektrode für Probeinjektion
(RFU) (A) Simultane Amplifikationen der drei Allelen auf dem homologen Chromosomenpaar Locus A Deletion of Locus B Locus C Locus A Locus B Locus C (B) Multiplex PCR Produkte werden mit Kapillar Elektrophorese separiert A B C Wie liegen die Produkte auf dem Chromatogram RFU: relative fluorescence unit t: time 10min small 15 min large (t) 50 bp 70 bp Modified Figure 4.3 J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
D8S1179 (12 alleles) D21S11 (24 alleles) D7S820 (10 alleles) CSF1PO (10 alleles) Blue panel D3S1358 (8 alleles) TH01 (10 alleles) D13S317 (8 alleles) D16S539 (9 alleles) D2S1338 (14 alleles) Green panel D19S433 (15 alleles) VWA (14 alleles) TPOX (8 alleles) D18S51 (23 alleles) Yellow panel AMEL (2 alleles) D5S818 (10 alleles) FGA low (19 alleles) FGA high (9 alleles) Red panel 100 bp 139bp 150 bp 160 bp 200 bp 250 bp* Orange panel 300 bp 340 bp 350 bp LIZ-labeled GS500 DNA sizing standard Figure 5.6, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
(A) Mendelsche Vererbung Mutter A,B Vater C,D B,C Kind (B) Beispiel Vaterschaftsteste mit STRs 8,12 11,14 Was sind die Genotypen der Kinder? 12,14 8,14 11,12 12,14 8,11 Väterliche Allele 14 14 11 14 11 Figure 23.2, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
(A) Direct comparison of STRs with related objects DNA Profil Des Opfers D5S818 D7S820 D13S317 CSF1PO D16S539 Penta D DNA Profil Von dem Direkten Evidenz (zb eine Zahnbürste) (B) Indirect comparison: kinship analysis Betroffener D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1PO Penta D? Frau 11,13 8,12 8,12 8,9 10,12 8,10 Frau Sohn 11,13 8,14 8,9 9,13 10,10 9,10 Sohn Vorausgesgtes Profil 11,? or?,13?,14 9,??,13?,10 9,? Vater Profil des Betroffenes 12,13 11,14 9,9 11,13 10,10 9,12 Figure 24.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
Einfache Vaterschaftsteste D1 = Biologische Tochter von den beiden Eltern D2 = Kind der Mutter und ihr voriges Mann Alle Menschen haben VNTRs S1 = Biologisher Sohn des Ehepaars S2 = adoptierter Sohn VNTRs kommen aus der genetischen Information von den Eltern. Kinder haben VNTRs der Mutter, des Vaters oder eine Kombination der beiden keine VNTRs die nicht von einem der beiden Eltern stammen
3. Gelelektrophorese Geben Sie 5 l PCR Probe zur vorbereiteten blauen Laufpuffer Tragen sie die ganze Probe (10 l) auf das Gel gefärbt mit GelRed auf Lassen sie das Gel für 30 min bei 100V laufen!
PRAKTIKUMSAUFGABE - VNTR ANALYSE UNTERSUCHUNG VON EINEM, AUCH VON FBI BENUTZTEN VNTR LOCUS (FGA) IN 5 MITARBEITERN DES BIOLOGISCHEN INSTITUTS Die PCR-Primers haben wir auf die Konsensussequenzen an den beiden Seiten der wiederholenden Region geplant: P1: gctagtaacggcattaccag P2: catcgcataagaatttcacg LÄNGE DER WIEDERHOLENDEN EINHEIT: 4 bp, SEQUENZ: TTTC ANZAHL DER WIEDERHOLUNGEN: 5-250, ALSO WIR ERWARTEN PRODUKTE ZWISCHEN: 60-1040 bp (die Länge der beiden Primer sind natürlich eingerechnet).
PRAKTIKUMSAUFGABE - VNTR ANALYSE BESTIMMEN SIE, WIEVIELE WIEDERHOLUNGEN DIE AMPLIFIZIERTEN ALLELE ENTHALTEN! 1 2 3 4 5 1900 Lösung: 340 760 360 272 152 336 120 340 100 770 620 420 340 270 180 140 90 Nach dem Abziehen von der Länge der beiden Primern (40bp), teilen wir die DNA-Fragmentlängen mit 4, so bekommen wir die Anzahl der Wiederholungen 75 180 58 74 75 75 80 28 20 15 Anzahl der tandemartigen Wiederholungen in den beiden Allelen
1. AUFGABE Ella SUCHT Sie mit ihrer Tochter, Linda auf. Ella erzählt, das der Vater von Linda ist einer der Mitglieder der Beatgruppe Freude. Basierend auf die DNA-Proben entnommen von den Mitgliedern der Gruppe machen Sie eine VNTR-Analyse. Wer ist der Vater von Linda? Warum? Warum ist B-Mikrosatellit speziell? VNTR Ella Linda Thomas Johann Peter Uwe Franz A 7 & 8 2 & 7 3 & 7 2 & 7 2 & 8 3 & 7 3 & 2 B 4 & 5 6 & 4 4 7 6 4 6 C D 11 & 8 7 & 19 11 & 9 9 & 10 13 & 8 10 9 & 12 9 & 13 21 & 7 21 & 7 7 & 9 21 & 7 15 & 8 21 & 15 E 10 & 6 12 & 6 6 & 9 12 & 9 17 & 10 6 & 12 17 & 12
1. AUFGABE VNTR Ella Linda Thomas Johann Peter Uwe Franz A 7 & 8 2 & 7 3 & 7 2 & 7 2 & 8 3 & 7 3 & 2 B 4 & 5 6 & 4 4 7 6 4 6 C 11 & 8 11 & 9 9 & 10 13 & 8 10 9 & 12 9 & 13 D 7 & 19 21 & 7 21 & 7 7 & 9 21 & 7 15 & 8 21 & 15 E 10 & 6 12 & 6 6 & 9 12 & 9 17 & 10 6 & 12 17 & 12 Ella SUCHT Sie mit ihrer Tochter, Linda auf. Ella erzählt, das der Vater von Linda ist einer der Mitglieder der Beatgruppe Freude. Basierend auf die DNA-Proben entnommen von den Mitgliedern der Gruppe machen Sie eine VNTR-Analyse. Wer ist der Vater von Linda? Warum? FRANZ Warum ist B-Mikrosatellit speziell? ES IST X-CHROMOSOM GEKOPPELT
Die Sequenz oben ist Wildtyp (+), die Sequenz unten ist mutant (-). Suchen sie die Mutation! Zu welchem Typ gehört diese Mutation? 2. AUFGABE (+) CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAT... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT (-) CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAA... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT
Die Sequenz oben ist Wildtyp (+), die Sequenz unten ist mutant (-). Suchen sie die Mutation! Zu welchem Typ gehört diese Mutation? Punktmutation, eine andere Aminosäure wird eingebaut, Missense Was für eine Methode kennen Sie für die Identifizierung von Punktmutationen/SNPs? (+) CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAT... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT (-) CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAA... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT
ASA (Allelspezyfische Amplifikation) PCR PRODUKTE 5 ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAT 3 5 AGT TAG AAG GGA TGG CGC TAG 3 (+) 5 ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAT... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT 3 3 TAC GGC CCT AGC CAA GAA TTA GAT CGC GGT AGG GAA GAT TGA 5 (-) 5 CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAA... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT 3 3 GGA CTG AAA TCG TAC GGC CCT AGC CAA GAA TTT GAT CGC GGT AGG GAA GAT TGA 5 5 CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAA3 5 AGT TAG AAG GGA TGG CGC TAG 3
GELELEKTROPHORESE DER PCR-PRODUKTE +/+ -/- +/-
Gerichtsmedizin in der Zukunft? Eine Assoziationsforschung identifizierte fünf Loci (PRDM16, PAX3, TP63, C5orf50 und COL17A1), welche die Gesichtmorphologie bei Europäern beeinflussen: z.b.: PAX3 beeinflusst die Position des Nasions. Citation: Liu F, van der Lijn F, Schurmann C, Zhu G, Chakravarty MM, et al. (2012) A Genome-Wide Association Study Identifies Five Loci Influencing Facial Morphology in Europeans. PLoS Genet 8(9): e1002932.
Bestimmen Sie bitte die Augen- und Haarefarbe der Täter, wenn sein DNA-Profil aus den folgenden SNPs besteht: Gen/SNP HERC2 Rs12913832 Oca2 Augen Blue/green Brown Blond/red Brown GG/CC HAAR AA/TT GG/CC AA/TT Ergebnisse der Sequenzierung: Rs12913832: Rs1800407: AA GG rs1800407 AA/TT GG/CC AA/TT GG/CC Tyr Rs1393350: GG Rs1393350 AA/TT GG/CC AA/TT GG/CC IRF4 rs12203592 TT/AA CC/GG TT/AA CC/GG SLC24A5 rrs16891982 GG/CC CC/GG GG/CC CC/GG Rs12203592: CT Rrs16891982: CC Rs49592270: AC ExoC2 rs49592270 AA/TT CC/GG AA/TT CC/GG The HIrisPlex system for simultaneous prediction of hair and eye colour from DNA Forensic Science International: Genetics Volume 7, Issue 1, January 2013, Pages 98 115 IrisPlex: A Sensitive DNA Tool for Accurate Prediction of Blue and Brown Eye Colour in the Absence of Ancestry Information Journal:
Vergleichen Sie die Proben der Verdächtigen mit den amplifizierten Proben und bestimmen Sie die Anzahl der Wiederholungen in den amplifizierten Proben! Referenzgel 1 Verdächtigen 2 3 Opfer Marker 1900 620 272 152 336 120 340 360 420 340 270 180 140 100 1 2 3 90 Wer ist der Täter vermutlich?
Wichtige Begriffe Die Schritten der PCR Identifizierungstechniken der Personen: RFLP, VNTR, STR, SNP, ASA, Kapillar Gelelektrophorese, CODIS, DNA Fingerabdruck