Rekombinante Wirkstoffe
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- Jutta Hummel
- vor 6 Jahren
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1 Gentechnik/Biotechnik Rekombinante Wirkstoffe Vorlesung im WS 2010/2011 Prof. Theo Dingermann Institut für Pharmazeutische Biologie Goethe-Universität Frankfurt/Main
2 1984 Klonierung und Sequenzierung des kompletten HIV-Genoms; Entwicklung des genetischen Fingerabdrucks;
3 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) an repetitiven Allelen (Minisatelliten) repetitive Allele: zwei Banden pro diploidem Chromosom Banden auf mehrern Chromosomen Gelelektrophorese Allel 1 Allel 2
4 DNA-Typisierung
5 DNA-Typisierung Tatortspur
6 DNA-Typisierung Verdächtige
7 DNA-Typisierung Übereinstimmung
8 Repetitive DNA-Sequenzen Minisatellit G A G G A C C A C C A G G A A G A G AT Mikrosatellit Short Tandem Repeat (STR)
9 PCR-Analyse mit Mikrosatelliten (STRs = Short Tandem Repeats STR Allel 1 STR Allel 2 STR Allel 3 STR Allel 4 spezifische, STR-flankierende Primer!
10 Repetitive DNA-Sequenzen für DNA-Typisierungen mit PCR Minisatelliten Größe bp (Kernmotive bp) u.u. schlechte Ergebnisse mit degradierter DNA Probleme mit allelic dropout Mikrosatellieten (STRs) Größe bp (Kernmotive 2-6 bp) bessere Ergebnisse mit stark degradierter DNA geringere allelic dropout Problematik kleinere Fragmente sind mit besserer Auflösung trennbar Neue PCR-spezifische Probleme: Kontaminationen PCR-Inhibitoren Allelic dropout
11 DNA-Typisierung Multiplex STR-Analyse (2 Individuen) Polyacrylamid- Gelelektrophorese Nachweis der Amplimere durch Autoradiographie Σ Allel#
12 Nomenklatur der STR-Marker D 16 S 539 DNA Chromosom 16 "single copy" (Einzelsequenz) 539. Genlocus auf Chromosom 16
13 Vergleich RFLP und PCR RFLP PCR benötigte Zeit 6-8 Wochen 1-2 Tage benötigte DNA-Menge ng 0,1-1 ng benötigte DNA-Qualität hochmolekular, intakt fragmentiert automatisierbar? nein ja
14 DNA-Typisierung durch Multiplex STR-Analysen Diskriminierungsgrade praktische Berechnungen Ein Individuum hat die Wahrscheinlichkeit F, an einem Locus zwei bestimmte Allele zu besitzen: F = 2pq Ist ein Individuum homozygot für ein Allelpaar, gilt: F = p 2 Beispiel: Am Genlocus D3S1358 werden zwei Allele mit 15 bzw. 18 Repeats gefunden. Die Frequenzen sind 0,2825 bzw. 0,1450 F = 2 0,2825 0,1450 = 0,0819 oder 8,2%
15 DNA-Typisierung durch Multiplex STR-Analysen Multiplex STR-Analyse Beispiel: PowerPlex verschiedene Loci werden gleichzeitig amplifiziert CSF1PO FGA TPOX TH01 VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 D21S11 Penta D Penta E Amelogenin 1 : 1,
16 1984 Klonierung und Sequenzierung des kompletten HIV-Genoms; Entwicklung des genetischen Fingerabdrucks; Entwicklung der ersten gentechnisch hergestellten Vakzine. Das Hepatitis-B-Virus (HBV) gehört zur Gruppe der Hepadnaviren, die ein zirkuläres, teils doppelsträngiges DNA- Genom und einer Lipidhülle besitzen. Der zweitgrößte Leserahmen codiert für die verschiedenen Formen des Oberflächenproteins HBsAg der acht verschiedene Genotypen (A H).
17 Hepatitis-B-Impfstoff
18 1985: Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;
19 1985: Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose; Funktionelles Klonieren: Voraussetzung ist, dass die biochemische Basis der Erkrankung bekannt ist oder dass Kenntnisse über das Protein vorliegen, das unmittelbar an der Krankheit beteiligt ist.
20 1985: Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose; Positionelles Klonieren: Für diesen Ansatz müssen Kenntnisse über die subchromosomale Position des vermeintlichen Gens vorliegen. Den genauen Pathogenitäts-Mechanismus bzw. die biochemische Funktion des Genproduktes braucht man nicht zu kennen.
21 1985: Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose; Positions-unabhängiges Klonieren eines Kandidaten-Gens: Besteht ein begründeter Verdacht, dass ein Defekt in einem bestimmten Gen die Krankheit verursacht, kann das ohne Kenntnisse der chromosomalen Lokalisation Gen kloniert werden. Ein solches Gen bezeichnet man als ein Kandidaten-Gen.
22 1985: Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose; Positionelles Klonieren eines Kandidaten-Gens: Für diesen Ansatz werden sowohl Kenntnisse über die Pathogenitäts-Mechanismen als auch über die chromosomale Lokalisation des Gens benötigt, das im Verdacht steht, eine Erbkrankheit zu verursachen. Ist das gegeben, dann ist dieser Ansatz sehr effizient.
23 1985: Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose; RFLP-Marker D7S15
24 1985: Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose; Der RFLP-Marker D7S15 markiert in der DNA von Eltern kranker Kinder zwei DNA-Fragmente. Dagegen hybridisiert die gleiche Sonde in der DNA kranker Kinder nur mit einem DNA-Fragment. Die Eltern sind also für diesen Marker heterozygot und daher gesund. Dagegen haben die kranken Kinder von beiden Eltern jeweils das defekte Allel geerbt. Sie sind somit für den Marker homozygot und folglich krank. Durch in-situ-hybridisation konnte die chromosomale Position dieses Markers als 7q31.3 identifiziert werden. Damit war die Voraussetzung für positionelles Klonieren geschaffen.
25 1985: Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;
26 1985: Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose; Es konnte nicht nur das Gen identifiziert werden, sondern es wurde auch eine entscheidende Mutation entdeckt, die bei mehr als 70% aller Patienten mit Cystischer-Fibrose in Nordeuropa vorkommt. Diese Patienten tragen die DF508-Mutation, die dadurch gekennzeichnet ist, dass an Position 508 im CFTR-Protein (cystic fibrosis transmembrane conductants regulator) die Aminosäure Phenylalanin fehlt. Das CF-Gen ist 230 kbp lang, besteht aus 24 Exons und codiert für ein Protein aus Aminosäuren. Das Protein ist bekanntlich ein Chloridkanal und somit ein Protein, das in der Membran verankert ist.
27 1985: Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose; Erfindung der PCR-Technik: Kary B. Mullis 1993
28 1985: Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose; Erfindung der PCR-Technik; Sequenzierung des humanen Insulinrezeptors
29 1985: Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose; Erfindung der PCR-Technik; Sequenzierung des humanen Insulinrezeptor Zulassung von rekombinantem, humanem Wachstumsfaktor durch die FDA.
30 1986: Einführung von AIDS- und Hepatitis-Tests für Blutkonserven;
31 Anfang der 80er-Jahre gab es erste Verdachtsfälle auf Kontaminationen in Blutkonserven stand fest: Viele Blutkonserven und für Bluter lebenswichtige Blutprodukte waren mit HIV verseucht. Zu diesem Zeitpunkt hatten sich jedoch bereits 50 Prozent aller deutschen Bluter, also rund 1500 Menschen mit dem tödlichen Virus infiziert. Obwohl Mitte der 80er-Jahre bereits bekannt war, dass die Produkte lebensgefährlich sind, versäumte die Regierung, eine Regelung zum Schutz der Bluter zu schaffen. Dass die Blutpräparate auch mit Hepatitis A, B und C belastet waren, wurde kaum erwähnt. So kommt es, dass zum Beispiel alle Bluter mit Hepatitis C infiziert sind.
32 Erst als Anfang der 90er-Jahre der Skandal richtig zum Kochen kam, entschuldigte sich der damalige Gesundheitsminister Horst Seehofer offiziell bei den Blutern wegen Verletzung der Aufsichtspflicht. Das BGA wurde aufgelöst und das BfArM geschaffen. Heute garantiert die PCR-Testung auf Hepatitis A-, B- und C-, HI- und Parvoviren, dass Blutkonserven sicher sind.
33 1986: Einführung von AIDS- und Hepatitis-Tests für Blutkonserven; Zulassung der ersten Interferone Intron A und Roferon A für die Krebstherapie;
34 Die Geschichte der Gentechnik
35 Die Geschichte der Gentechnik
36 Biochemische und pharmakologische Eigenschaften der Interferone: Protein Funktion Induktion durch 2'-5'(A)-Synthetase Protein (p68) Kinase (PKR) (durch dsrna aktivierbare Proteinkinase) Klasse-I-MHC-Antigene (HLA-A,B,C) (incl.β2- Mikroglobulin) Klasse-II-MHC-Antigene (HLA-DR) dsrna-abhängige Synthese von 2'-5'(A); Aktivator der RNase L Phosphorylierung des Translations-Initiationsfaktors eif-2a Antigenpräsentation gegenüber zytotoxische T- Lymphozyten Antigenpräsentation gegenüber TH-Lymphozyten Typ-I-IFN Typ-II-IFN ± + + ± +
37 Biochemische und pharmakologische Eigenschaften der Interferone: Indolamin-2,3- dioxygenase Protein Funktion Induktion durch Guanylat-Bindeproteine (GPB; γ67) Mx-Protein Tryptophanmetabolismus (Katabolismus) Typ-I-IFN Typ-II-IFN ± + GTP-, GDP-Bindung ± + GTPase, spezifischer Inhibitor des Influenza-Virus + - IP-10 CXC-Chemokin ± + Metallothionin Metall-Entgiftung + + TNF-Rezeptoren Vermittler von TNF-Effekten ± + IL-2-Rezeptoren Vermittler von IL-2-Effekten - +
38 Biochemische und pharmakologische Eigenschaften der Interferone: Protein Funktion Induktion durch GM-CSF-Rezeptor Interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1; CD54) Immunglobulin-Fc- Rezeptor (FcR) Thymosin β4 Vermittler von GM-CSF- Effekten Endotheliales Zelladhäsionsmolekül GTP-, GDP-Bindung Immunglobulinbindung durch Makrophagen/Neutrophile Induktion der Terminalen Transferase in B- Lymphozyten Typ-I-IFN Typ-II-IFN ± + +?
39 1986: Einführung von AIDS- und Hepatitis-Tests für Blutkonserven; Zulassung der ersten Interferone Intron A und Roferon A für die Krebstherapie; Zulassung des ersten monoklonalen Antikörpers Orthoclone OKT3 als Medikament zur Prophylaxe von Abstoßungsreaktionen bei der Nierentransplantation;
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