HPLC Praktikum Skript

HPLC Praktikum 1 HPLC Praktikum Skript Assistenten: Tatiana Pimenova (HCI D 330, 3 41 45, pimenova@org.chem.ethz.ch) (HCI H 322, 2 29 46, herdeis@org.chem.ethz.ch) 1. Theorie 1.1 Allgemeines Prinzip von Trennmethoden 1.2 Chromatographische Methoden 1.3 Verteilungsisothermen und chromatographisches Verhalten von Komponenten 1.4 Chromatographische Parameter (Retention, Totzeit, Kapazitätsverhältnis, Anzahl theoretischer Trennstufen) 1.5 HPLC 2.1 Der verwendete Chromatograph 2. HPLC Gerät 2.2 Anwendung von Gerät für ngle Run Messungen. 3. Aufgaben 3.1 Einfluss der Laufmittelzusammensetzung: Qualitative Interpretation des Chromatogrammes einer homologen Phenon-Reihe 3.2 Konzentrationsbestimmung einer unbekannten Acetophenonlösung mittels internem Standard 3.3 Quantitative Analyse von Coffein in verschiedenen Getränken 4.1 Theorie 4.2 Experimente 4. Grössenausschluss-Chromatographie

HPLC Praktikum 2 1.1 Allgemeines Prinzip von Trennmethoden Die Trennung verschiedener Komponenten beruht auf unterschiedlichen physikalischen oder chemischen Eigenschaften, im Allgemeinen in der Verteilung zwischen zwei Phasen, in der Beweglichkeit innerhalb einer Phase, in der Permeabilität etc. Tabelle 1. Verschiedene Arten von Trennmethoden. Prinzip Trenneigenschaften Beispiel Unterschiedliche Beweglichkeit innerhalb einer Phase Elektrophorese Zonenelektrophorese Kapillarzonelektrophorese (CZE) Unterschiedliche Verteilung zwischen zwei Phasen (mobile und stationäre Phase) Unterschiedliche relative Permeabilität einer Membran für Probekomponenten Chromatographie HPLC GC Ionenchromatographie SEC (Diffusion durch stationäre Phase) Membrantrennverfahren Dialyse Elektrodialyse

HPLC Praktikum 3 1.2 Chromatographische Methoden Chromatographie - physikalische Trennmethode, bei der die zu trennenden Komponenten zwischen einer feststehenden (stationären) und einer beweglichen (mobilen) Phase verteilt werden. Tabelle 2. Chromatographische Verfahren Stationäre Mobile Phase (MP) Pdf Phase Flüssig Gas Fest Flüssigkeits-Adsorptions- Chromatographie (LSC) Gas-Adsorptions- Chromatographie (GSC) Stationäre Phase (SPh) Flüssig Flüssigkeits-Flüssigkeits- Chromatographie (LLC) Gas-Flüssigkeits- Chromatographie (GLC) Tabelle 3. Trennprinzipen Chromatographie Prinzip Stationäre Phase Adsorptionschromatographie Polaritätsunteschied licagel und Al 2 3 der Verteilungschromatographie Unterschiedliche Verteilung der Probenkomponenten zwischen stationärer und Flüssigkeit in einem porösen, inerten Festkörper (z.b. beschichtetes licagel) mobiler Phase. Ionenaustauschchromatographie Konkurrenz zwischen den Ionen der mobilen Phase und den ionisierten oder stark polaren Probenkomponenten um die Besetzung der aktiven Stelle. Polymere oder licagel mit gebundenen ionogenen* Gruppen. * Typische ionogene Gruppen von Kationentauschern sind -S 3 2- und -C -, von Aniontauschern -NR 3 +

HPLC Praktikum 4 1.3 Verteilungsisothermen und chromatographishes Verhalten von Komponenten Ein Chromatogramm ist das Resultat der Verteilung der Probenkomponenten zwischen mobiler und stationärer Phase. Es gibt drei Fälle von isotermer Verteilung in der Säule (Schema 1): Im Idealfall ist die Verteilung zwischen mobiler und stationärer Phase konzentrationsunabhängig, im Chromatogramm erscheint ein symmetrischer Peak. Im Normalfall, unter realen Bedingungen wird eine vom Idealfall abweichende Adsorptionsisoterme beobachtet. Bei hohen Konzentrationen äussert sich das durch ein Tailing. Wegen Übersättigung der stationäre Phase werden grosse Probenkonzentrationen ungenügend zurückgehalten. Schlechteste Chromatogramme werden beobachtet, wenn grosse Mengen von Probenkomponente in der SPh kondensieren (Leading). C stat Schlechtes Chromatogramm Idealfall Normalfall C mob Figur 1. Verteilungsisothermen und resultierende gnalformen.

HPLC Praktikum 5 1.4 Chromatographishe Parameter (Retention, Totzeit, Kapazitätverhältnis, Anzahl theoretischer Trennstufen) Die Retentionszeit (t R ) ist die wichtigste chromatographische Eigenschaft einer Komponente. Die Retentionszeit ist die Zeit, die von der Komponente X benötigt wird, um das Trennsystem zu durchlaufen. Eine Komponente Y, die nicht mit der mobilen und stationären Phasen wechselwirkt, durchläuft das Trennsystem in der Totzeit (t 0 ). e ist charakteristisch für die Messapparatur bei gegebener Flussgeschwindigkeit (F) und Temperatur. Das Totvolumen (V 0 ) ist das Volumen der mobilen Phase, welches das Trennsystem in der Totzeit durchläuft: F t 0 = V 0 (1). Retention (R) ist eine absolute Charakteristik, welche die Qualität einer Trennung zeigt: R= n M / (n M + n S ) (2), n M und n S Anzahl Teilchen von Komponente X in der mobilen bzw. stationären Phase. Y Kapazitätverhältnis (k ) ist eine relative Charakteristik der Trennung es ist das Verhältnis der Menge von Komponente X in der stationären bzw. mobilen Phasen: k = (C S V S )/(C M V M ) = K (V S /V M ) (3), Der Verteilungskoeffizient K ist eine weitere Charakteristik der Trennung: K = C S /C M (4). Das Konzept der theoretischen Trennstufe ist ein wichtiges Modell zur Beschreibung der chromatographischen Trennung. Eine theoretische Trennstufe ist eine Zone des Trennsystems, innerhalb der sich ein Gleichgewicht zwischen der mittleren Konzentration einer Komponenten in der stationären und der mittleren Konzentration in der mobilen Phase eingestellt hat. Die Anzahl der theoretischen Trennstufen N ist ein Charakteristikum des Trennsystems.

HPLC Praktikum 6 Mobile Phase Stationäre Phase Theoretische Trennstufe Die Trennung von Komponenten ist umso besser, je grösser die Anzahl theoretischer Trennstufen ist. Figur 2. Der Einfluss der Trennstufenzahl auf die Trennung.

HPLC Praktikum 7 1.5 HPLC (High Performance Liquid Chromatography) HPLC ist eine Methode der Flüssigkeits-Chromatographie, bei der die Trennung unter hohem Druck (bis 300 bar bei einem Fluss von typischerweise 1 ml/min) abläuft. Die am häufigsten verwendete stationäre Phase ist licagel (Normalphasen-HPLC) oder licagel modifiziert mit langen Alkylketten (Umkehrphasen-HPLC). Die Partikelgrösse beträgt 3-25 µm. Dies führt zu einer grossen Anzahl theoretischer Trennstufen (N 100 000). Guard column filters P Injector Probe injection control T T Column Gradient control Δ Pumps Pulse damping F F Thermostat Mixing camera Detector collector Figur 3. Schema eines HPLC-Geräts. licagel ist eine polare stationäre Phase. Somit sollte für eine gute Trennung eine apolare mobile Phase verwendet werden (z.b. Heptan, Dichlormethan). In Fall der Umkehrphasen-HPLC ist das licagel chemisch modifiziert: Durch die Modifikation erhält man eine apolare berfläche. H H H H H C 1 8 H 37 C 1 8 H 37 C 1 8 H 37 C 1 8 H 37 C 18 H 37 H H H H H C 18 H 37 C 18 H 37 C 18 H 37 C 18 H 37 C 1 8 H 37 licagel Umkehrphase C18-modifiziertes licagel Deshalb sollte bevorzugt eine polare mobile Phase verwendet werden (Methanol, Acetonitril, Wasser). Die Polarität der mobilen Phase kann über das Mischungsverhältnis zweier oder mehrerer Lösungsmittel kontinuierlich verändert werden. Der Einfluss der Laufmittel-Polarität wird in Aufgabe 2 aufgezeigt.

HPLC Praktikum 8 2.1 Der verwendete Chromatograph Das im Praktikum verwendete System des Herstellers Shimadzu besteht aus mehreren separaten Komponenten: System Controller SCL-10A. Dieser Teil des Systems steuert die anderen Komponenten. Es ist möglich, das System manuell oder über die Software zu steuern. Diode Array Detector SPD - 10A VP besteht aus vielen, gleichzeitig arbeitenden Dioden, die elektromagnetische Strahlung feststellen können. Jede Diode misst die Intensität innerhalb eines sehr engen Spektralbereiches von 2 nm Breite. Man kann also gleichzeitig das ganze Spektrum im Bereich von 190 800 nm messen. Es gibt drei Möglichkeiten, Messresultate zu visualisieren: 1) Chromatogramm bei einer bestimmten Wellenlänge; 2) Maximum Absorbance Chromatogramm maximale Extinktion gemessen für jede Substanz im angegebenen Bereich; 3) 3D-Chromatogramm Zusammenfassung aller Chromatogramm im angegebenen Bereich. Liquid Chromatograph LC - 10A VP. In diesem Geräteteil befindet sich das eigentliche Herzstück des Trennsystems, die Säule mit der stationären Phase. Dazu gehört auch das Injektionsventil mit einem maximalen Probevolumen von 20 µl (wie bei unserem Versuch). Degasser DGU-14A reduziert gelöste Luft im die mobilen Phase, verhindert die Luftblasen, die Quellung und die Baselinie Unregelmässigkeit. Vacuum Pump VCV - 10AL VP. saugt und mischt die Laufmittelkomponenten, kontrolliert die Flussgeschwindigkeit. Das Laufmittel kann aus maximal 4 Komponenten zusammengesetzt werden. Erst nach dem Mischen wird das Laufmittel unter Druck gesetzt. Pumpenparameter kann man manuell oder via Software einstellen. Der Druck sollte 200 bar nicht überschreiten. Wenn der Druck zu hoch oder zu niedrig ist, wird die Pumpe automatisch abgeschaltet. Wichtig: In den Kapillaren vor der Pumpe dürfen sich keine Luftblasen befinden, ansonsten muss die Purge - Prozedur durchgeführt werden.

HPLC Praktikum 9 2.2 Anwendung von Gerät für ngle Run Messungen 1 Prüfen, ob die Vorratsflaschen für die Laufmittelkomponenten ausreichend gefüllt sind (A - Wasser, B - Acetonitril). Am Anfang das Gerät und dann den Computer einschalten (umgekehrt beim Ausschalten). 2 VP-Class-VP5.0 alias anklicken, Instrument 1 (2) wählen. 3 Einschalten von Lampe, Pumpe (warten bis Druck stabil ist) und Instrument. 4 In Menü Method Instrument setup (oder Menü Knopf) wählen. Bei Pumps sieht man die folgenden Parameter: T, ml/min Flussgeschwindigkeit; Laufmittel Zusammensetzung: B%, C%, etc.; Druck-Bereich. Bei Time Program kann man die Zeit des Experiments einsetzen. Nach dieser Zeit können in Fällen von kombinierter Analyse die experimentellen Bedingungen gewechselt werden. In unseren Versuchen ist das die Zeit, nach der das Experiment abgebrochen wird. 5 In Menü Method PDA Setup wählen (Diode Array Detektor). Bei General definiert man die Randbedingungen des Detektors: Start wave length (nm), End wave length (nm) Messzeit des Detektors nach dieser Zeit misst der Detektor nicht mehr. Eingestellte Parameter speichern : Save method. 6 ngle Run -Knopf drücken und die Parameter einstellen: Beim Wechseln der Methode müssen die Parameter neu eingestellt werden. 7 Nach dem Ende Messung sollten noch Integration und Analyse durchgeführt werden. Dazu müssen die Parameter Width und Threshold eingestellt werden. Width Breite des schmalsten gnals. Schmalere Peaks werden unterdrückt. Threshold Höhe des kleinsten gnals. Kleinere Peaks werden unterdrückt. Wenn beide Parameter eingestellt sind, im Menü Method Analyse -Prozedur wählen. Dann sieht man die Werte der Retentioszeit t R. 9. Bei Custom Report unter dem Method -Menü bekommt man einen Bericht mit Chromatogramm und Peaktabelle (Retentionszeit und Peakflächen). Der Bericht sollte für die statistische Auswertung der Daten ausgedruckt werden.

HPLC Praktikum 10 3.1. Einfluss der Laufmittelzusammensetzung: Qualitative Interpretation des Chromatogrammes einer homologen Phenon-Reihe Vorgehen Eine verdünnte Lösung von Acetophenon, Propiophenon, n-butyrophenon und n-valerophenon steht für den Versuch bereit (je 1-3 Tropfen/100ml Laufmittel, 50% CH 3 CN, 50% H 2 ). Die Zusammensetzung des Laufmittels beträgt : a) 50% CH 3 CN und 50% Wasser (METHDE: PHE50.MET) b) 60% CH 3 CN und 40% Wasser (METHDE: PHE60.MET) c) 70% CH 3 CN und 30% Wasser (METHDE: PHE70.MET) Bei der Detektionswellenlänge von 250 nm und einer Flussgeschwindigkeit von Acetophenon 1 ml/min sollen je 1 Chromatogramm aufgenommen werden. Beim Wechseln des Laufmittels sollte jeweils 5-10 Minuten gespült werden. Fragen 1) Wie verändern sich die Retentionszeiten von a) nach c)? Diskutiere den Einfluss der Konzentration von Acetonitril bei der RP-Chromatographie. 2) Für alle Chromatogramme sollen die folgenden chromatographischen Parameter aus den Daten ermittelt werden : Parameter Definition Die Retentionszeit (t Ri ) Nach Custom Report Die Netto-Retentionszeit (t R i ) t R = t ' R t 0 Die Kapazitätverhaltnisse (k i ) k' i = t Ri t 0 t 0 Die relativen Retentionen (a ij ) Die Trennstufenzahlen (N i ) Die Auflösungen (R ij ) Annahme t 0 = 1min bei 1ml/min, k' j a ij = k' i 2 t R N = 16 w b 2(t R2 t R1 ) R ij = w + w i j w ist die Peakbreite in min, relative Retentionen und Auflösungen nur zwischen benachbarten Peaks.

HPLC Praktikum 11 3.2 Konzentrationsbestimmung einer unbekannten Acetophenonlösung mittels internem Standard Vorgehen Die Konzentration einer unbekannten Acetophenonlösung soll mit Propiophenon als internem Standard ermittelt werden. Folgende Kalibrierlösungen (jede im 10 ml Kolben) im Laufmittel (50% CH 3 CN, 50% H 2 ) mit gleicher Konzentration von internem Standard von 20 mg/l Propiophenon und verschiedene Konzentrationen von Acetophenon sollen hergestellt werden: 60 mg/l, 40 mg/l, 20 mg/l Acetophenon. Die unbekannte Lösung soll eine Konzentration von 45 mg/l haben, und natürlich die gleiche Menge vom internen Standard. Die Konzentrationen müssen genau bekannt sein (siehe Angaben auf den Flaschen)! Von jeder Lösung werden bei Wellenlänge 250 nm und einer Flussgeschwindigkeit von 1.0ml/min je drei Messungen durchgeführt METHDE:ACINS.MET. Fragen Die Flächenintegrale der Acetophenon- bzw. Propiophenonpeaks stehen mit den jeweiligen Konzentrationen über den Faktor f in Beziehung: Fläche AcPhen Fläche Pr opphen = f C AcPhen C Pr opphen (6). Der Faktor f wird durch die Auswertung der Chromatogramme der ersten drei Kalibrierlösungen ermittelt. Die Konzentration der unbekannten Acetophenonlösung kann dann mit den Flächenintegralen der vierten Lösung eruiert werden. Experimentelle Daten Konzentration des Acetophenon-Stammlösung = Konzentration des Propiophenon-Stammlösung = Volumen der Propiophenon-Stammlösung in 10ml (konstant), µl = Volumen der AcPhen-Stammlösung in 10ml, µl Konzentration AcPhen in den Kalibrierlösungen, mg/l

HPLC Praktikum 12 3.3. Quantitative Analyse von Coffein in verschiedenen Getränken Vorgehen Folgende Kalibrierlösungen sollen hergestellt werden: 0.095 g/l, 0.075 g/l, 0.045 g/l Coffein (im Laufmittel gelöst). Die Zusammensetzung des Laufmittels beträgt 15% Acetonitril und 85% Wasser. Die experimentellen Einstellungen des Gerätes stehen in der Methodenbeschreibung. Der Wellenlängenbereich des Detektors wird auf 200-360 nm festgelegt. Der Fluss beträgt 1.0 ml/min. N N N N Coffein Es gibt verschiedene Methoden, die Resultate zu visualisieren. Es wird empfohlen, bei einer Wellenlänge von 270 nm ein normales Chromatogramm darzustellen, das Spektrum beim Peakmaximum, einen 3D-Plot und eine Contourplot darzustellen. METHDE: CFFE.MET Quantitative Messungen werden dann mit zwei coffeinhaltigen Getränken gemessen. Es werden jeweils 1 ml (oder mehr) der zu untersuchenden Flüssigkeiten (Cola, Kaffee, Tee, ohne Zucker oder Milch!) mit Wasser auf 20 ml verdünnt, durch einen 0.2 µm Cellulosefilter filtriert und jeweils zweimal gemessen. Fragen 1 Die Konzentration des Coffeins wird durch Vergleich der Flächenintegrale ermittelt. Die Auswertung soll mit dem zur Verfügung gestellten Programm erfolgen. Es wird durch Vergleich mit Literaturdaten geprüft, ob die Daten vernünftig sind. 2 Das UV-Spektrum des aus dem Kaffeechromatogramm erhaltenen Coffeinpeaks soll zur Identitätskontrolle mit dem Coffeinpeak aus der Spektrenbibliothek vergleichen werden. Experimentelle Daten Konzentration des Coffein-Stammlösung = Volumen der Stammlösung in 10ml, µl Konzentration der Kalibrierlösungen, g/l

HPLC-Praktikum Versuch Grössenausschluss- Chromatographie HPLC Praktikum 13 4.1 Theoretischer Hintergrund der Größenausschluss-Chromatographie (ze Exclusion Chromatography, SEC) Die SEC ist eine spezielle Art der HPLC, bei der die Analyten aufgrund ihrer Grösse und nicht, wie bei allen anderen flüssigchromatographischen Methoden wegen ihren spezifischen Wechselwirkungen mit der stationären Phase getrennt werden. Die Analyten diffundieren in die Poren der Säulenmaterials (typischerweise Teilchen der Grösse 3-10µm mit einer Porengrösse von 50-10 6 Å) wobei kleine Verbindungen tiefer in die Poren eindringen können als grössere und somit eine längere Verweildauer auf der Säule besitzen. Jede Säule ist gepackt mit Teilchen deren Grösse sich in einem engen Bereich bewegt, so dass sich nur Moleküle innerhalb eines gewissen Grössenintervalls mit einer bestimmten SEC-Säule auftrennen lassen. Bei der SEC werden grosse Moleküle zuerst eluiert, kleine Verbindungen dagegen besitzen höhere Retentionszeiten. Eine Säule kann nur Verbindungen innerhalb eines gewissen Grössenintervalls trennen (abhängig von der Porengrösse der staationären Phase). Die untere Grenze von keinen Verbindungen wird als Permeationsgrenze (permeation limit), die entsprechende obere als Ausschlussgrenze (exclusion limit) bezeichnet Kleine Verbindungen wandern langsam durch die SEC-Säule Grosse Verbindungen wandern schnell durch die SEC-Säule

HPLC Praktikum 14 Experimenteller Aufbau Der experimentelle Aufbau für SEC-Experimente ist identisch mit dem der HPLC bis auf die Tatsache, dass für die Trennung eine spezielle Säule verwendet wird. In unseren Experimenten wird eine Waters Ultrahydrogel 120 column (300 mm 7.8 mm) mit hydroxyliertem Polymetacrylat als Stationäre Phase verwendet. Kalibrierung Die Grössenausschluss-Chromatographie-Säule muss mit Verbindungen bekannter molekularer Grösse kalibriert werden. Aus Gründen der Übereinstimmung, sollten Verbindungen mit einer ähnlichen Struktur für die Erstellung einer Kalibrierkurve verwendet werden. Eine SEC-Säule kann kalibriert werden, indem man das Elutionsvolumen (oder die Retentionszeit) der gnale einer Serie von Kalibirerstandards gegen die jeweiligen Molekulargewichte der Standards aufträgt (z. B. Polystyrol 600-30 000 000 Da, Polyethylenglycol 106-20 000 Da).

HPLC Praktikum 15 4.2 Experimente 4.2.1 Kalibrierung der Säule mit Polymethacrylsäuren Die Struktur von Polymethacrylsäure ist unten dargestellt, zusammen mit dem entsprechenden Monomer. n C H 3 H 2 C a. CH polymerization CH 3 C H 2 CH 2 CH n b. Durchführung der Kalibrierung 1. Man stellt drei Standards von Polymethacrylsäure (PMA) mit MG 1270 Da, 4030 Da und 5880 Da her. Man gibt 10 mg (Spatelspitze) des Polymers in ein Eppendorf-Gefäss (V = 1.5 ml) und gibt 0.7 ml H 2 (Milli Q) zu. Die Lösungen werden vor der SEC-Analyse durch einen PVDF Filter (0.45 µm Porengrösse, Whatman) filtriert. 2. Die Proben werden in das SEC eingespritzt. Das Experiment wird insgesamt zweimal durchgeführt. 3. Anschliessend wird eine Kalibirerkurve gezeichnet (X-Achse = Retentionszeit; Y-Achse = Molekulargewicht des PMA) 4.2.2 Messung eines Huminsäurestandards Huminsäure sind komplexe, aromatische Macromoleküle deren aromatische Einheiten durch Aminosäuren, Aminozucker, Peptide und aliphatische Verbindungen miteinander verknüpft sind. Die hypothetische Struktur der Huminsäure in der Abbildung enthält freie und gebundene H-Gruppen, Chinon-Einheiten, Stickstoff und Sauerstoff als verbrückende Atome und Carboxylat-Gruppen welche an die aromatischen Ringe gebunden sind. Huminsäure (humic acid, HA) bildet sich im Boden während des Abbaus von organischem Material 1. Es wird eine Lösung von einem Huminsäure-Standard hergestellt (Acros oder Aldrich). 2. Die Lösung wird durch einen PVDF Filter filtriert (0.45µm Porengrösse, Whatman). 3. Die Probe wird in das SEC-Instrument eingespritzt. Die Messung wird einmal wiederholt. 4. Die Grössenverteilung der Probe wird durch Vergleich mit der Kalibrierkurve ermittelt.

HPLC Praktikum 16 Richtlinien für den Bericht: HPLC Ihr solltet den Bericht so verfassen, so dass ihr in einem Jahr immer noch wisst, was ihr gemacht habt und den Versuch wiederholen koenntet. 1.Theorie (nicht seitenweise aber die Grundlagen), ca eine Seite HPLC: was ist das, warum macht man es, was braucht man dazu, wie funktioniert es? Chromatographische Parameter erläutern, z.b. Totvolumen, Verteilungskoeffizient 2. Ziel des Versuchs + Durchführung Gerät, Typ, Säule, Laufmittel, Detektor Angabe aller Messparameter! (Geräteeinstellungen, Laufmittelzusammensetzung, Flussgeschwindigkeit...) Immer Konzentrationen der verwendeten Lösungen angeben!!!! Dazu die Tabellen im Skript verwenden. 3. Ergebnisse und Diskussion Angabe von Retentionszeiten und allen Flächen in Tabellen u.a. Vergleich interner und externer Standard (coffein und Acetophenonversuch, warum gibt es welche Unterschiede? Welche Art Spektren wurde aufgenommen? Angaben der Werte z.b. 5±3 g/l (log. Standard deviation) mit ob. + unt. Vertrauensbereich angeben. Kalibration+Fehlergeraden aus Matehmatica in den Bericht einfügen (Achsen beschriften). Diskussion der Ergebnisse (evtl. Vergleich mit Literaturwerten)! 2. + 3. koennt ihr auch zusammenfassen: erst Durchführung und dann gleich Ergebnisse des jeweiligen Versuchs. Anhang Je ein aufgenommenes Spektrum von jedem Versuch Für Aufgabe 3.1. ist das Ausmessen der Basisbreite nötig entweder direkt nach der Messung ablesen, oder ausdrucken. Bei Coffein: Contourplot, UV-Diagramm. Viel Spass -bei Aufgabe 3.4. für Aufgabe 3.3. hergestellte Lösungen verwenden und entsprechend verdünnen.