Das Auflösungsvermögen der Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist besonders hoch, weil im Gel Moleküle aufgrund ihrer Ladung und ihrer Grösse aufgetrennt werden. Während auf Agarose die Serumproteine nur in die grösseren Gruppen Albumin, α 1 - und α 2 -, β 1 - und β 2 -, und γ-globuline aufgetrennt werden, vermag die Polyacrylamid-Gelelektrophorese Dutzende verschiedener Serumproteine zu unterscheiden. Ausschliesslich nach der Grösse aufgetrennt werden Proteine in der SDS- Gelelektrophorese (vgl. S. 14). 27 Vereinfachte quantitative Behandlung der Wanderungsgeschwindigkeit qeladener Teilchen im elektrischen Feld. Auf ein Teilchen mit der Ladung Q wirkt im elektrischen Feld E (V/cm) die Kraft Q@E, so dass die Wanderungsgeschwindigkeit des Teilchens v = Q@E/f (1) beträgt. Für den Idealfall einer Kugel ist der Reibungskoeffizient f = 6 πηr (r = Stokes'scher Radius, η = Viskosität des Mediums). Gleichung (1) zeigt, dass die Wanderungsgeschwindigkeit proportional zum Spannungsabfall (= Feldstärke = Spannung pro Längeneinheit des Elektrophoresestreifens, Volt/cm) und proportional zur Ladung des wandernden Teilchens ist. Die Ladung ist bei Aminosäuren und Proteinen vom ph-wert abhängig. Der Reibungskoeffizient f ist abhängig von Form und Grösse der Teilchen und von der Viskosität des Mediums. Bei der Elektrophorese entsteht Wärme. Die pro Zeiteinheit gebildete Wärme H beträgt R@I 2 (R = elektrischer Widerstand, I = Stromstärke). Bei der Hochspannungselektrophorese (Feldstärken bis einige 100 V/cm und Stromstärken von gegen 1 Ampère) wird die entstehende Wärme mit einem Kühlsystem abgeführt. CHROMATOGRAPHIE Chromatographische Trennmethoden beruhen im wesentlichen darauf, dass sich die zu trennenden Substanzen je nach ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften zwischen einer stationären und einer mobilen Phase ungleich verteilen. Die verschiedenen Verfahren können grob klassifiziert werden in Verteilungschromatographie (Papier-, Dünnschicht-, Gaschromatographie), Adsorptionschromatographie (Ionenaustauscher-, Affinitätschromatographie) und Gelchromatographie (Gelfiltration). Die Verteilungschromatographie beruht auf der verschiedenen Löslichkeit der zu trennenden Substanzen in den Phasen. Bei der Adsorptionschromatographie wirken verschieden starke nichtkovalente Bindungskräfte zwischen den zu trennenden Substanzen und den Molekülen der einzelnen Phasen. In der Gelchromatographie beruht die Trennung auf der räumlich begrenzten Zugänglichkeit der verschiedenen Phasen für unterschiedlich grosse Moleküle. Während der chromatographischen Trennung werden die stationäre und die mobile Phase gegeneinander verschoben. Verschiedene Kombinationen von festen, flüssigen und gasförmigen Phasen sind je nach Chromatographietyp möglich. Eine Übersicht gibt die folgende Tabelle.
28 Name Phase 1 Phase 2 (stationär) (mobil) Papierchromatographie H 2 O in Cellulose- organisches matrix des Papiers Lösungsmittel Gaschromatographie Silikone auf inertes Gas inertem Träger Dünnschicht- Aluminiumoxid, organisches chromatographie Kieselgel etc. Lösungsmittel Ionenaustauscher- Ladungen auf Elektrolyt chromatographie inertem Träger (Puffer) Affinitäts- spezifischer Ligand Puffer, chromatographie auf inertem Träger Lösungsmittel Gelchromatographie Puffer im Raum Puffer ausserhalb innerhalb der der Gelpartikel Gelpartikel Die einzelnen Chromatographietypen können nicht immer eindeutig der Verteilungs-, Adsorptionsoder Gelchromatographie zugeordnet werden. Beispielsweise beobachtet man bei der Papierchromatographie gelegentlich auch Adsorption an das Papier. Oder im Falle der Gelchromatographie werden aromatische Verbindungen wegen Adsorption an die Gelpartikel besonders langsam aus den Gelpartikeln eluiert (Elutionsverhältnisse bei der Gelfiltration in Exp. 10.1). Der R f -Wert ist ein Mass für die Wanderungsgeschwindigkeit einer Substanz in Papier- und Dünnschichtchromatographie. Der R f -Wert ist der Quotient aus der Wanderungsdistanz der Substanz und der Lösungsmittelfront. R f = Startpunkt bis Fleckenmitte Startpunkt bis Lösungsmittelfront Der R f -Wert ist für eine Substanz in einem bestimmten Lösungsmittelsystem und bei konstanter Temperatur charakteristisch. Zur Identifikation ist aber der direkte Vergleich von unbekannter Substanz und Referenzsubstanz im gleichen Chromatogramm zuverlässiger. In der Gelchromatographie ist der Verteilungskoeffizient K d eine dem R f -Wert entsprechende Grösse (S. 30. Ionenaustauscher-Chromatographie Bei dieser Art von Chromatographie werden gelöste Ionen gegen Ionen gleichen Vorzeichens, die an ein unlösliches Gegenion auf einem festen Träger gebunden sind, ausgetauscht. Auf diesem Prinzip beruht die Enthärtung von Wasser, bei der Ca 2+ des "harten" Wassers gegen Na + von unlöslichem
Zeolith (= Natrium-Aluminiumsilikat) ausgetauscht wird. Der entstehende Ca-Zeolit kann durch Waschen mit einer konzentrierten NaCl-Lösung wieder zum Na-Zeolith regeneriert werden. Die meisten Ionenaustauscher sind synthetische Polymere (Kunstharze), welche saure oder basische Gruppen enthalten. Austauscher-Harze kann man nach dem pk-wert ihrer ionischen Gruppen einteilen. Ein stark saurer Kationenaustauscher kann z.b. -S0 3 - Gruppen enthalten, ein schwach saurer z.b. -COO - Gruppen. Den Austausch kann man sich folgendermassen vorstellen: 29 Harz-S0 3- Na + + R-NH 3 + º Harz-SO 3 - + H 3 N-R + Na + Harz-NH 3+ Cl - + R-COO - º Harz-NH 3 + - OOC-R + Cl - Trennung von zwei Aminosäuren (A1 und A2) auf Kationenaustauscherharz Bei ph 1 liegen A 1 und A 2 als Kationen vor. Beide werden am Kationenaustauscher adsorbiert und wandern nur sehr langsam. Bei ph 6 liegt A 1 als Kation vor. A 2 wird als ungeladenes Zwitterion nicht adsorbiert und wandert deshalb schneller als A 1.
Statt einen Puffer konstanter Zusammensetzung zur Elution zu verwenden, können z.b. bei einem Kationenaustauscher der ph-wert oder die Ionenstärke oder beide schrittweise (schrittweise Elution) oder kontinuierlich (Gradienten-Elution) erhöht werden. Dadurch kann die Elution der aufgetrennten Komponenten beschleunigt werden. Die Aminosäuren eines Proteinhydrolysats werden im automatischen Aminosäuren-Analysator durch Ionenaustauschchromatographie quantitativ aufgetrennt (Fig. 6). 30 Fig. 6 Analyse von Aminosäuren mit Hilfe einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) an einem Kationenaustauscher-Harz. Die Fläche unter jedem Signal des Chromatogramms ist der Menge jeder in der Mischung vorhandenen Aminosäure proportional. Gelchromatographie Vernetztes Dextran ("Sephadex") bildet in gequollenem Zustand ein poröses Gel. Das Flüssigkeitsvolumen innerhalb der Gelpartikel ist bei einem gegebenen Grad der Vernetzung nur für gelöste Moleküle unterhalb einer bestimmten Grösse zugänglich. Die Verteilung von gelösten Molekülen innerhalb und ausserhalb der Gelpartikel ist somit abhängig vom zugänglichen Volumen innerhalb der Gelpartikel. Das Totalvolumen (V t ) einer Sephadex-Säule ist die Summe des Volumens ausserhalb der Gelpartikel (V o ), des Volumens innerhalb der Gelpartikel (V i ) und des Volumens der Gelsubstanz selbst (V g ): V t = V o + V i + V g Das Elutionsvolumen (V e ) einer Substanz ist abhängig von V o und vom "Verteilungskoeffizienten" K d, der den Bruchteil des V i angibt, der für die Substanz zugänglich ist. V e = V o + K d @ V i Für grosse Moleküle, die nicht in das Gel eindringen können, ist K d = 0, somit V e = V o. Für kleine Moleküle, die vollständig in das Gel eindringen können, ist K d = 1, somit V e = V o + V i. Für Moleküle mit einem K d zwischen O und 1 gilt: V o < V e < (V o + V i ) Je nach der Grösse der Moleküle, die voneinander getrennt werden sollen, wird verschieden stark vernetztes Sephadex verwendet. Die gebräuchlichsten Typen sind: Sephadex Ausschluss-Molekularmasse G-25 > 5'000 G-50 > 25'000 G-75 > 50'000 G-200 > 200'000
Sephadex G-25 eignet sich wie die Dialyse besonders zur Entsalzung von Makromolekülen (Exp. 5.2, 5.4). Sephadex G-50, G-75 und G-200 werden zur Trennung verschieden grosser Proteine verwendet. Sie dienen auch zur Schätzung der molekularen Grösse und damit der Molekülmasse eines Proteins. Als Referenzen braucht man die Elutionsvolumina von Proteinen mit bekannter Molekularmasse. Für globuläre Proteine ist das Verhältnis V e /V o über einen weiten Bereich umgekehrt proportional zum Logarithmus der Molekularmasse. Die nachstehende Figur zeigt solche Kurven für Sephadex G-50 und G-200. Die gesuchte Molekülmasse eines Proteins erhält man anhand der Kurven aus dem gemessenen Elutionsvolumen. 31 Affinitätschromatographie (siehe Exp. 5.5, Naturwissenschafter) Gesetz von Beer-Lambert: PHOTOMETRIE Wird Licht durch eine Farbstofflösung gestrahlt und dabei absorbiert, so ist die Intensität des austretenden Lichts (I) kleiner als diejenige des eintretenden Lichts (I o ). Der Quotient I/I o wird als Durchlässigkeit D oder Transmittance T bezeichnet und ist abhängig von der Konzentration c des Farb-stoffs und der Schichtdicke d: D = I/I o = lo -k@c@d. D wird oft in % angegeben. %D = 100 I/I o. Ein für photometrische Messungen gebräuchlicheres Mass ist die Extinktion E oder optische Dichte