Praktikumsvorschrift ELISA (ENZYME LINKED IMMUNO-STIMULATED ASSAY) Die Immunologie ist die Wissenschaft vom Immunsystem. Ursprünglich handelte es sich um denjenigen Zweig der Medizin, der sich mit der Abwehr oder der Resistenz gegen Infektionen befasste. In den letzten vierzig Jahren ist der Bedeutungsumfang des Begriffs jedoch ständig gewachsen; er umfasst heute alle Prozesse und Mechanismen, die zwischen Selbst also den körpereigenen angeborenen Mechanismen, Molekülen, Zellen, Geweben und allen dazugehörigen Strukturen und Nicht-Selbst, alles, was von außerhalb des Körpers kommt und damit körperfremd ist unterscheiden. Zum Nicht-Selbst gehören u. a. infektiöse Mikroorganismen (Protozoen, Pilze, Bakterien, Mycoplasmen und Viren), Parasiten, Toxine, Tumoren und Geschwulstzellen, Transplantate und transfundierte Zellen oder Moleküle von genetisch nicht identischen tierischen Lebewesen. Die Immunantwort Die meisten tierischen Lebewesen können auf körperfremde Substanzen mit Abwehr reagieren; man bezeichnet das als Immunantwort. Die Mechanismen der Immunantwort und ihre natürliche Entwicklung sind das zentrale Untersuchungsgebiet der Immunologie und der 1
immunologischen Forschung. Immunantworten können angeboren sein und treten dann ohne vorherigen Kontakt mit dem fremden Stoff, Organismus oder Gewebe auf, oder sie sind erworben und erfordern in diesem Fall zunächst einen Kontakt mit der körperfremden Substanz. Angeborene Immunität Tierische Lebewesen haben natürliche Barrieren und Stoffe, die Infektionen durch Mikroorganismen oder Parasiten verhindern. Die Haut und schleimhaltige Sekrete wirken als Barrieren, proteolytische Enzyme (Verdauungsenzyme, die Proteine spalten können) in den Körperflüssigkeiten können einige der eindringenden Organismen zerstören. Darüber hinaus reagieren Zellen mit spezifischen angeborenen Immunfunktionen rasch auf eindringende Organismen und zerstören sie. Es handelt sich dabei im Wesentlichen um zwei Zelltypen: Monozyten und Granulozyten. Beide Typen können in einem als Endocytose bezeichneten Vorgang Mikroorganismen in sich aufnehmen und zerstören. Darüber hinaus bilden sie viele Substanzen, die gegen Infektionen schützen und die Entwicklung der Immunantwort fördern, darunter Zytokine und Enzyme. Granulozyten zirkulieren im Blut, können jedoch sehr schnell in die Gewebe wechseln, sobald fremde Organismen oder Stoffe bestimmte Reize verursachen. Auch zirkulierende Monozyten bewegen sich aus dem Blut in Gewebe hinein, wo sie ihre Gestalt ändern und Makrophagen genannt werden. Das so genannte Komplementsystem, bei dem eine Vielzahl von im Blut vorhandenen Proteinen eine Rolle spielt, ist beim Schutz gegen einige Mikroorganismen ebenfalls wichtig. Die angeborene Immunität ist relativ unspezifisch, unterscheidet jedoch normalerweise eindeutig zwischen Selbst und Nicht-Selbst. Sie reagiert rasch und stellt eine schnelle erste Abwehr gegen unerwünschtes Eindringen körperfremder Stoffe, Gewebe oder Organismen zur Verfügung. Erworbene bzw. spezifischen Immunität Antigene sind körperfremde Stoffe, die eine Gefahr für den Körper darstellen. Kommt ein höher entwickelter Organismus mit ihnen in Kontakt, kann er die Fähigkeit erwerben, spezifisch auf sie zu reagieren. Wirbellose Tiere können, wenn überhaupt, nur in geringem Ausmaß wirklich spezifisch reagieren; erworbene Immunität ist bei Säugern und Vögel am höchsten entwickelt. Die erworbene Immunität basiert auf der Aktivität zweier Systeme: der humoralen und der zellulären Immunität. Die spezifische, humorale Immunität entsteht mittels löslicher Proteine, der so genannten Immunglobuline oder Antikörper. Säuger produzieren fünf Klassen von Immunglobulinen, die als Immunglobulin G, M, A, D und E bezeichnet werden. Diese relativ großen, kugelförmigen Proteine bestehen aus zwei leichten und zwei schweren Molekülketten. Während ein Teil (Fab 1 ) eines Antikörpers an das Antigen bindet, reagiert der andere Teil (Fc 2 ) mit anderen Elementen des Immunsystems, z.b. mit Molekülen des Komplementsystems oder Makrophagen. 1 ab steht für antigen bindend 2 c steht für cristallizing 2
Alle Immunglobulinklassen sind im Blut vorhanden, wobei Immunglobulin G (IgG) mengenmäßig vorherrscht. Außerdem dient es der Aktivierung des Komplementsytems und ist plazentagängig. IgM-Antikörper werden zu Beginn der Immunreaktion im Blut gebildet; IgA wird im Magen- und Bronchialsekret und in Schweiß und Speichel gebildet. IgE bewirkt anaphylaktische (Histamin freisetzende) und allergische Reaktionen und kann zum Schutz gegen Parasiten wichtig sein. Die Funktion des zirkulierenden IgD ist ungeklärt. Immunglobuline werden von B-Lymphozyten produziert. Antikörper gehen jeweils spezifische Verbindungen mit körperfremden Organismen und Substanzen ein; damit können häufig unerwünschte Eigenschaften der eindringenden Substanzen und Organismen inaktiviert werden. Antigen-Antikörper-Komplexe werden mit Hilfe verschiedener Prozesse aus dem Körper entfernt; Mikroorganismen, auf denen sich Antikörper festgesetzt haben, werden häufig von Makrophagen und anderen Zellen endocytotisch aufgenommen und verdaut. Die spezifischen, zelluläre Immunität wird durch T-Lymphozyten bewirkt. Es werden jeweils antigenspezifische T-Zellen produziert, die mit den Antigenen über einen spezifischen Rezeptor interagieren. Zytotoxische T-Zellen (Killerzellen) können Mikroorganismen oder Zellen spezifisch vernichten (siehe unten). Andere T-Zellen beeinflussen die Immunreaktion,indem sie helfend oder unterdrückend einwirken (T-Helfer-, T-Supressorzellen). Solche T-Zellen bilden Zytokine und andere biologisch wirksame Moleküle aus, welche die Aktivierung und Reifung der B-Lymphozyten verstärken oder hemmen. Zytokine umfassen u. a. Interleukine, γ- Interferon und den Wachstumsfaktor TGF. Immunologische Diversität Das erworbene Immunsystem kann Antikörper und T-Zellen produzieren, die eine sehr große Zahl verschiedener Moleküle bemerkenswert spezifisch zu erkennen vermögen. Schätzungen zufolge können Säugetiere weit über einer Million verschiedener Antikörper bilden. Heute weiß man, dass Immunglobuline durch die Neuanordnung und neue Verbindung mehrerer Gene entstehen und dass bei der Entstehung der erworbenen Immunität eine somatische Rekombination des genetischen Materials auftritt. Zur Entwicklung der humoralen 3
Immunität gehört die Interaktion von Antigenen mit IgM- oder IgD-Molekülen, die als Rezeptoren auf der Oberfläche von B-Zellen fungieren. Dies löst eine Aktivierung der B-Zellen aus wenn dann von T-Zellen und anderen Systemen genügend Unterstützung kommt, entwickelt sich die Immunantwort, und die passenden Antikörper werden verstärkt gebildet, wobei der entsprechende B-Zellklon proliferiert und zur Plasmazelle diffenziert. Diese Vorstellung wurde Jahrzehnte vor ihrem experimentellen Nachweis von Paul Ehrlich, dem deutschen Pionier der Immunologie, entwickelt. Unterscheidung zwischen Selbst und Nicht-Selbst Die Unterscheidung zwischen Selbst und Nicht-Selbst ist in der Immunologie grundlegend. Klone von Zellen, die körpereigene Antigene erkennen können, werden schon früh in der Entwicklung eines tierischen Lebewesens eliminiert, in der Regel kurz nach der Geburt. Diese Zerstörung findet infolge von Prozessen statt, die den programmierten Zelltod (Apoptose) einschließen. Bricht die Immuntoleranz gegenüber dem Selbst zusammen, können sich Autoimmunkrankheiten entwickeln. In dieser Situation kann das System gesunde Zellen und Substanzen zerstören oder verletzen, was zu klinisch auffälligen Krankheiten führt. Eine Allergie ist die Überreaktion des Immunsystems auf fremde Stoffe. Ist die Immunreaktion auf der einen Seite für den Menschen von lebensrettender Bedeutung, so kann sie andererseits dem Versuch, Menschenleben durch Organtransplantationen zu retten, im Weg stehen. Normalerweise erkennt das Immunsystem Zellen eines anderen Organismus als fremd und versucht, diese Zellen abzutöten. Nach der Transplantation z. B. einer Niere, Leber oder von Knochenmark muss man daher die Aktivität des Immunsystems mit Medikamenten wie Cyklosporin unterdrücken. Antigen-Präsentation und die Proteine des Histokompatibilitätskomplexes (MHC 3 ) Die meisten Zellen tierischer Lebewesen (außer den Erythrozyten der Säugetiere) exprimieren auf ihrer Oberfläche Moleküle, die von anderen, genetisch nicht identischen Lebewesen als Nicht-Selbst erkannt werden. Diese MHC-Proteine der Klasse I spielen eine bedeutende Rolle bei der Abstoßung von Transplantaten und bei einigen Reaktionen auf Transfusionen. Zytotoxische T-Zellen sind in der Lage zwischen körpereigenen und körperfremden Molekülen dieser Klasse zu unterscheiden. Außerdem erkennen sie, ob die MHC-Proteine fremde Peptiden präsentieren und eliminieren Zellen, die solche Marker tragen. Diese assoziierten Peptide stammen aus zytoplasmatischem Proteinverdau und dienen dazu, Mikroorganismen oder Viren, die intrazellulär lokalisiert sind, ausfindig zu machen. Antigen-präsentierende Zellen wie die Makrophagen und B-Lymphozyten verarbeiten Antigene, die durch Endocytose internalisiert wurden. Die durch Spaltung erhaltenen Antigen- Peptide werden den entsprechenden T-Helferzellen in Furchen auf Molekülen der MHC- Klasse II vorgezeigt. 3 MHC steht für major histocompatibility complex 4
Methoden der Immunologie: Radioimmunoassay (RIA) Die Antigen-Antikörper-Reaktion wird sowohl im RIA als auch im ELISA zur Quantifizierung bestimmter Substanzen genutzt. Die empfindlichste Methode repräsentiert der RIA, wobei Antigenkonzentrationen von 0,5 pg/ml noch bestimmt werden können. Plasmabestandteile mit extrem niedriger Konzentration wie Proteohormone, Steroidhormone, Interleukine, aber auch Pharmaka oder Drogen können mittels dieser Methode untersucht werden. Rosalyn Yalow bekam 1977 für die Entwicklung der Radioimmunoassaytechnik den Nobelpreis. Als Beispiel für einen Radioimmunoassay sei hier die Bestimmung von Prolactin aus dem Serum eines Patienten genannt. Im Versuch werden in Teströhrchen gleiche bekannte Mengen radioaktiv markiertes Prolactin (Markierung mit 131 Jod) mit gleichen Mengen Anti-Prolactin zu gegeben. Nach einer gewissen Inkubationszeit werden steigende Mengen an Serum (mit unbekannter Prolactinkonzentration) zupipettiert. Was passiert? Mit Zugabe eines 2. Antikörpers gegen Anti-Prolactin wird die Präzipitation eingeleitet und das erhaltene Präzipitat auf seine Radioaktivität vermessen. Wenn man nun die Radioaktivität (gemessen in counts per minutes: cpm) gegen die Konzentration des Serums aufträgt, erhält man eine sogenannte Verdrängungskurve. Wie muss der Kurvenverlauf aussehen? Was sind die Nachteile dieses Assays? Enzyme-linked Immunoabsorbent Asssay (ELISA) Die Technik des ELISA wurde 1971 durch Engvall und Perlman entwickelt. Alle Reaktionen des ELISA finden mit einem immobilisierten Partner statt, was die Trennung von gebundenem und nicht gebundenen Reagenzien erheblich erleichtert. Das Antigen wird an einer Plastikoberfläche unter bestimmten Bedingungen zwar nicht kovalent, aber mit erstaunlicher Festigkeit gebunden. In einem zweiten Schritt wird der entsprechende Antikörper in verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Warum wird eine Verdünnungsreihe des Antikörpers angelegt? Überschüssige Antikörper werden durch Waschen entfernt. Nach einer gewissen Inkubationszeit gibt man den zweiten Antikörper, der (in dem vorliegenden Versuch) an eine alkalische Phosphatase gekoppelt ist, dazu. Der zweite Antikörper erkennt den konstanten Teil des ersten Antikörpers. Auch hier wird ein Überschuss durch Waschen beseitigt. Die alkalische Phosphatase ist ein Enzym, das eine Chromogenumwandlung katalysiert. Das farblose Chromogen wird zu einem Farbstoff umgesetzt und vermessen. Die Menge an freigesetztem Farbstoff korreliert mit der Menge der gesuchten Substanz, in diesem Fall mit der Menge des ersten Antikörpers. Wie muss der Kurvenverlauf aussehen (Extinktion gegen Titer)? Für alle beschriebenen immunologischen Tests gilt, dass die Bindungen von Antigen und Antikörper nicht einem einfachen Massenwirkungsgesetz entsprechen. Vielmehr müssen die Methoden, um Konzentrationsangaben machen zu können, geeicht werden. Zur Titerbestimmung ist das nicht nötig. Denn der Titer ist die Verdünnung des Serums (bzw. der negative Logarithmus der Verdünnung), bei der man den Antikörper oder die untersuchte Substanz nicht mehr feststellen kann. 5
VERSUCHSDURCHFÜHRUNG Im vorliegenden Versuch wird die ELISA-Technik zur Bestimmung einer unbekannten Menge an Antikörper in einem Serum (Titerbestimmung) gegen Rinderserumalbumin (BSA) benutzt. Es werden folgende Pufferlösungen benötigt: Puffer 1: 100 ml 0,1 M Natriumcarbonat ph 9,6 Puffer 2: 450 ml 0,9 % w/v Natriumchlorid 0,015 % v/v Tween 20 10 mm NaH 2 PO 4 ph 7,0 Puffer 3: 100 ml 50 mm Glycin, 0,5 mm MgCl 2 ph 10,0 1mg/ml p-nitrophenylphosphat in 40 ml Puffer 3 frisch ansetzen 1. Beschichtung der Küvetten mit Antigen Der Versuch wird in zwei Messreihen durchgeführt. Für jede Messreihe werden 16 Küvetten verwendet, wobei eine Küvette in jeder Reihe zur Kontrolle dient. 10 mg BSA werden in 100 ml Puffer 1 gelöst und je 1 ml dieser Lösung wird in die 32 Küvetten pipettiert. Nach drei Stunden bei Raumtemperatur werden diese Küvetten über Nacht bei 4 C inkubiert. Danach werden sie durch Absaugen entleert und dreimal mit jeweils 1 ml des Puffers 2 gewaschen. 2. Zugabe des zu prüfenden Antiserums Von dem Antiserum gegen BSA (aus Kaninchen) werden mit dem Puffer 2 folgende Verdünnungen hergestellt: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 und 10-7. Von jeder Verdünnung werden zwei Proben à 1 ml in die gewaschenen Küvetten gegeben. In die zwei restlichen Küvetten werden zur Kontrolle nur der Puffer 2 eingefüllt. Die Ansätze werden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. 3. Zugabe des enzymgekoppelten Anti-Antikörpers Antikörper gegen Anti-BSA wurden mit alkalischer Phosphatase gekoppelt. Dieses Konjugat wird 30000fach mit Puffer 2 verdünnt. Jeweils 1 ml dieser Verdünnung wird in die Küvetten pipettiert. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wird wieder dreimal mit Puffer 2 gewaschen. 4. Messung der immobilisierten Phophatase-Aktivität In jede Küvette wird 1 ml der frisch angesetzten p-nitrophenylphosphatlösung pipettiert. Nach 1 Stunde Inkubation wird die Extinktion der einzelnen Messpunkte bei einer Wellenlänge von 405 nm gegen die beiden Kontrollen gemessen. 6
Auswertung Für jede Verdünnung des Probenserums werden die Mittelwerte der Extinktionen berechnet. Die so erhaltenen Extinktionen werden gegen den Logarithmus des Verdünnungsfaktors aufgetragen. Wie hoch ist der Titer? In welcher Größenordnung (in g oder mol) liegen die gegen BSA gerichteten Antikörper im eingesetzten Serum vor? Es gilt die Erfassungsgrenze der Methode abzuschätzen. Hierzu dienen folgende Angaben: Extinktion: E = c d ε Der Extinktionskoeffizient ε für p-nitrophenol bei 405 nm beträgt 18,5 cm 2 /mmol Spezifische Aktivität : U = Substratumsatz mmol Zeit Enzymmenge min mg Die spezifische Aktivität der alkalischen Phosphatase beträgt 300 U. Die alkalische Phosphatase hat ein Molekulargewicht von 140.000 g/mol. IgG hat ein Molekulargewicht von 150.000 g/mol. 7