Energy transfer in the red fluorescent protein DsRed in confined optical fields Energieüberträge in dem rot fluoreszierenden Protein DsRed in definiert begrenzten optischen Feldern LIFE SCIENCES Band 3 RHOMBOS
Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.d-nb.de abrufbar RHOMBOS-VERLAG Bernhard Reiser Kurfürstenstr. 17 D-10785 Berlin www.rhombos.de verlag@rhombos.de VK-Nr. 65 859 2008 RHOMBOS-VERLAG, Berlin Alle Rechte vorbehalten. Nachdruck, auch auszugsweise, verboten. Kein Teil dieses Werkes darf außerhalb der engen Grenzen des Urheberrechtsgesetzes ohne schriftliche Einwilligung des Verlages in irgendeiner Form (Fotokopie, Mikrofilm oder ein anderes Verfahren) reproduziert oder unter Verwendung elektronischer Systeme gespeichert, verarbeitet, vervielfältigt oder verbreitet werden. Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutzgesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürfen. Eine Haftung für die Richtigkeit der veröffentlichten Informationen kann trotz sorgfältiger Prüfung vom Verlag nicht übernommen werden. Druck: dbusiness.de GmbH, Berlin Printed in Germany ISBN 978-3-938807-44-6
Energy transfer in the red fluorescent protein DsRed in confined optical fields Energieüberträge in dem rot fluoreszierenden Protein DsRed in definiert begrenzten optischen Feldern DISSERTATION der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Eberhard-Karls-Universität Tübingen zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften 2008 vorgelegt von Frank Schleifenbaum
Tag der mündlichen Prüfung: 18.07.2008 Dekan: Prof. Dr. L. Wesemann 1. Berichterstatter: Prof. Dr. A. J. Meixner 2. Berichterstatter: Prof. Dr. G. Gauglitz 3. Berichterstatter: Prof. Dr. M. Sauer
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Table of Contents Table of Contents VII List of Abbreviations IX 1. Introduction 1 1.1. Scope of this thesis 1 1.2. Outline of this thesis 4 2. Theoretical background and instrumentation 7 2.1. Principles of molecular emission 7 2.2. Experimental methods and instrumentation 20 2.3. Preparation of dye-matrices for bulk and single molecule studies 29 2.4. Autofluorescent proteins 30 3. Multiparameter spectroscopy on single DsRed proteins 37 3.1. Introduction 38 3.2. Experimental methods 39 3.3. Spectral and time domain microscopy 40 3.4. Calculations 46 3.5. Conclusion 52 4. Fluorescence spectroscopy and surface enhanced resonance Raman scattering (SERRS) on the same individual protein and its photoproducts 53 4.1. Introduction 54 4.2. Experimental 56 4.3. Spectroscopic results 59 4.4. Conclusion 68 5. Spectral control of Förster resonant energy transfer (FRET) by the optical mode of a sub-wavelength microresonator 69 5.1. Introduction 70 5.2. Microresonator design 71 5.3. Transmission properties of the microresonator 73 5.4. Spatial resolution of chromophoric subpopulations within DsRed tetramers 74 VII
Table of Contents 5.5. Microresonator controlled energy transfer of randomly dispersed donor-acceptor pairs 77 5.6. Single molecule spectroscopy of DsRed in a microresonator 80 5.7. Conclusion 83 6. Controlled disentanglement of coupled dipole emitters by confinement of the electromagnetic field 85 6.1. Introduction 86 6.2. Microresonator design and characterisation 87 6.3. Frequency-domain donor dequenching using continuous-wave irradiation 88 6.4. Time-domain donor dequenching by pump-probe measurements 96 6.5. Conclusion 102 7. Determination of the fluorescence quantum efficiency by mode confinement of the electromagnetic field 103 7.1. Introduction 104 7.2. Experimental 105 7.3. Modeling the fluorescence lifetime of molecules embedded in a microresonator 105 7.4. Towards application: liquid-phase microresonators 107 7.5. Conclusion 114 8. References 115 9. Appendix 127 9.1. Acknowledgement 127 9.2. Summary 130 9.3. Zusammenfassung 132 9.4. Curriculum Vitae 134 9.5. Scientific Contributions 135 9.6. Academic Teachers 138 VIII