SPOT-Light HER2 CISH-Kit

SPOT-Light HER2 CISH-Kit Kat.- Nr. 84-0150 20 Tests mit 24 mm x 30 mm Deckgläsern Verwendungszweck Für den Gebrauch als In-vitro-Diagnostikum Das SPOT-Light HER2 CISH-Kit ist für die quantitative Bestimmung der HER2-Genamplifikation in formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Mammakarzinom-Gewebeschnitten unter Verwendung von Chromogen in situ Hybridisierung (CISH) und eines Hellfeldmikroskops vorgesehen. Dieser Test sollt ein einem Histopathologie-Labor durchgeführt werden. Das SPOT-Light HER2 CISH-Kit ist als Hilfsmittel bei der Beurteilung von Patienten vorgesehen, für die eine Behandlung mit Herceptin (Trastuzumab) in Erwägung gezogen wird. Die Testergebnisse sind für den Gebrauch als Zusatz zu den klinikopathologischen Informationen vorgesehen, die zurzeit zur Behandlung von Brustkrebspatienten verwendet werden. Die Interpretation der Testergebnisse muss im Kontext der klinischen Anamnese durch einen qualifizierten Pathologen erfolgen. Zusammenfassung und Erklärung Das menschliche Gen HER2 oder c-erbb-2 und das äquivalente Rattengen, neu, wurden als Proto-Onkogene (1-3) mit der gleichen Homologie wie das eng verwandte v-erbb Onkogen identifiziert. (1) Das HER2-Gen ist auf Chromosom 17 (17q11.2-21) lokalisiert und kodiert das transmembranäre Rezeptorprotein mit einem Molekulargewicht von 185 kda. Das HER2-Protein hat Tyrosinkinaseaktivität und die gleiche Homologie wie der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (bekannt als EGFr, HER1, oder c-erbb-1), unterscheidet sich jedoch von ihm. (2) Die HER2-Genamplifikation oder HER2-Proteinüberexpression wurde bei 18-30 % der Fälle von menschlichem Brustkrebs identifiziert. (8-9) Die Identifikation des HER2-Genamplifikationsstatus ist wichtig zur Bestimmung der Prognose von Patienten mit invasivem Brustkrebs sowie zur Auswahl von Patienten für eine Behandlung mit Trastuzumab (Herceptin, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Schweiz und Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien). (4-6) Trastuzumab ist ein für das HER2-Protein spezifischer monoklonaler Antikörper. Trastuzumab hat sich nur bei Patienten mit HER2-Genamplifikation und/oder HER2-Proteinüberexpression als effektive Therapie erwiesen. (7,11) Bei frühem Brustkrebs hat sich eine kurze Behandlung mit Trastuzumab zusammen mit Docetaxel oder Vinorelbin bei Frauen mit Brustkrebs, die ein amplifiziertes HER2/neu-Gen haben, als wirksam erwiesen. (12) In anderen Studien wurde ebenfalls gezeigt, dass der HER2-Status ein Prädiktor für die Sensitivität oder Resistenz gegenüber bestimmten Chemotherapien ist. (13) Deshalb sind akkurate, konsistente und direkte Methoden zur Evaluierung des HER2-Gens und des HER2-Proteinstatus zunehmend wichtiger. PI84-0150 Version 0.0 Seite 1 von 27

Verfahrensprinzipien Bei der CISH-Technik werden digoxigenin-markierte DNA-Sonden verwendet, die spezifisch für die HER2- Lokalisierung auf Chromosom 17q11.2-21 sind, um zu den komplementären Nukleinsäuren in der Brustkrebsprobe zu hybridisieren. Die markierte HER2-Sonde wird unter Verwendung der Subtraction Probe-Technologie (SPT ) hergestellt, eine gesetzlich geschützte und patentierte Technologie, mit der spezifische Sonden erstellt werden, indem die repetitiven Sequenzen (z. B. Alu- und LINE-Elemente) in den menschlichen Nukleinsäuren signifikant reduziert werden. Es wurde durch PCR nachgewiesen, dass die Sonde das HER2-Gen enthält und sich durch Metaphase-FISH in normalen Lymphozyten spezifisch an den HER2-Genlokus auf Chromosom 17q11.2-21 bindet. Folglich sind die SPT -Sonden von Invitrogen inhärent spezifisch und erfordern keine repetitive Sequenzblockung, wie dies für herkömmliche zytogenetische DNS-Sonden erforderlich ist. Die CISH-Technik ermöglicht die Evaluierung von genetischen Aberrationen unter einem Hellfeldmikroskop mit chromogener Detektion. CISH-Färbungsergebnisse können mit einem normalen Hellfeldmikroskop und einer 40X Trockenlinse klar visualisiert werden. Die HER2-Genamplifikation kann im Zusammenhang mit der umliegenden Gewebemorphologie visualisiert werden. Nach der Deparaffinierung werden die Proben mit einem Hitzerückgewinnungsschritt vorbehandelt, gefolgt von Enzymverdau. Die Proben werden dann vor der Zugabe der HER2-Sonde dehydriert und luftgetrocknet. Nach der Zugabe der Sonde und des Deckglases auf die Probe wird die Kombination für mehr als 10 Stunden oder über Nacht denaturiert und hybridisiert. Danach wird die Probe gewaschen, um unhybridisierte Sonde zu entfernen, und das Signal wird chromogen durch die sequentielle Zugabe von Antikörper zu Digoxigenin und Meerrettich-Peroxidase- Polymer-(HRP)-Konjugat erkannt. Die Farbe wird durch die Reaktion des gebundenen HRP mit dem DAB- Chromogen und H 2 O 2 -Substrat entwickelt. Schließlich wird die Probe mit Mayer-Hämatoxylin zur Identifikation der Gewebemorphologie gegengefärbt und mit einem Deckglas abgedeckt. Das HER2-Gensignal wird durch einen einzelnen, dunkelbraunen Punkt identifiziert, wenn es in geringen Kopien vorhanden ist, oder durch braune Cluster, wenn das Signal in vielen Kopien vorhanden ist. Bereiche der Tumorzellen können leicht unter dem schwachen Objektiv eines Hellfeldmikroskops identifiziert und die HER2-Genkopien unter dem 40X Objektiv quantifiziert werden. Mit einem Hellfeldmikroskop mit einem 40X Objektiv werden die Tumorzellen lokalisiert und die HER2- Genkopien quantifiziert. Das DAB bildet ein Farb-Präzipitat, so dass die Ergebnisse archiviert und zu einem späteren Zeitpunkt eingesehen werden können. Mitgelieferte Materialien Das SPOT-Light HER2 CISH-Kit enthält alle Reagenzien, die zur Durchführung des CISH-Verfahrens auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben erforderlich sind. Die unten aufgeführten Materialien reichen für insgesamt 20 Anwendungen und bis zu 2 Durchläufe mit zwei Kontrollobjektträgern, mit Deckglas abgedeckten 24 mm x 30 mm Gewebeproben. Bei Gebrauch kleinerer Deckgläser können mehr Anwendungen durchgeführt werden. Das SPOT-Light HER2 CISH-Kit wird auf Kühlpolstern verschickt. Die Kühlpolster sollten bei Empfang der Lieferung immer noch kühl sein, um zu gewährleisten, dass die Packung keinen hohen Temperaturen ausgesetzt wurde. Manche Komponenten bleiben jedoch ungefroren, was die Leistung des Kits nicht beeinträchtigt. Anweisungen zur Aufbewahrung dieser Komponenten unmittelbar nach dem Empfang sind unter Aufbewahrung der Reagenzien zu finden. Reagenz A. Hitzevorbehandlungslösung 1 l, mit Tris-EDTA-Puffer (gebrauchsfertig) Reagenz B. Enzymvorbehandlungsreagenz 5 ml, mit Pepsinlösung mit 0,05 % Natriumazid und Reinigungsmittel (gebrauchsfertig) VORSICHT: Gesundheitsschädlich Reagenz C. HER2-Sonde 0,4 ml digoxigenin-markierte SPOT-Light HER2-Sonde in Hybridisierungspuffer mit Formamid (gebrauchsfertig) VORSICHT: Gesundheitsschädlich Reagenz D. SSC-Puffer 500 ml, mit salzigem Natriumzitrat (SSC) (gebrauchsfertig) Reagenz E1. PBS-Pulver PI84-0150 Version 0.0 Seite 2 von 27

3 Packungen für jeweils 1 l PBS Reagenz E2. Tween 20 (50 %) 2 ml, Tween 20 in 50 %-Lösung Reagenz F. CAS-Block TM 3 ml, mit Puffer, Stabilisator und 0,1 % Natriumazid (gebrauchsfertig) VORSICHT: Gesundheitsschädlich Reagenz G. Maus-Anti-Digoxigenin-Antikörper 3 ml, mit BSA, Puffer und 0,1 % Natriumazid (gebrauchsfertig) VORSICHT: Gesundheitsschädlich Reagenz H. Ziegen-Anti-Maus-HRP-Polymerkonjugat 3 ml, mit Stabilisator, Puffer, 0,005 % Gentamycinsulfat und 0,1 % Proclin 300. (gebrauchsfertig) Reagenz I1. DAB-Substratpuffer (20x) 1 ml, Konzentrat mit Puffer Reagenz I2. DAB-Lösung, (20x) 1 ml, Konzentrat mit 85 % w/v Methanol VORSICHT: Entzündlich und toxisch Reagenz I3. Wasserstoffperoxid (20x) 1 ml, 0,6 % H 2 O 2 Reagenz J. Mayer-Hämatoxylin 100 ml (gebrauchsfertig) Reagenz K. Histomount TM Einschlusslösung 4 ml (gebrauchsfertig) VORSICHT: Hochentzündlich und gesundheitsschädlich Kontroll-Objektträger L. Verfahrenskontrollzellträger 2 Objektträger, jeweils mit 2 formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Zelllinien, Seite an Seite: A) HER2 nicht-amplifiziert (MCF-7) und B) HER2 amplifiziert (SK-OV-3) [Nicht-amplifizierte Zelllinie mit auszählbaren Ergebnissen wird für eine optimale Testkontrolle empfohlen.] ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE REAGENZIEN, MATERIALIEN UND GERÄTE, DIE NICHT IM LIEFERUMFANG ENTHALTEN SIND Zusatzreagenzien/Materialien Invitrogen Kat.-Nr. 1. SuperFrost Plus-Objektträger ODER Histogrip TM Objektträger-Klebstoff 00-8050 2. Positive Gewebekontrolle: FFPE Mammakarzinom- (duktal, tubulär, lobulär oder gemischter Typ) Gewebeschnitt mit HER2-Genamplifikation, die zuvor mit CISH oder FISH bestätigt wurde 3. Negative Gewebekontrolle: FFPE Mammakarzinom- (duktal, tubulär, lobulär oder gemischter Typ) Gewebeschnitt mit HER2-Gen-Nichtamplifikation, die zuvor mit CISH oder FISH bestätigt wurde 4. Deionisiertes oder destilliertes Wasser (dh 2 O) 5. Xylol 6. 70 %, 85 %, 95 % und 100 % Ethanol (EtOH) 7. Deckgläser, Rubber Cement, 18G ½ Nadel und 5-ml-Spritze ODER 8. UnderCover TM -Deckgläser (18 x 18 mm) 00-8403 9. UnderCover TM -Deckgläser (22 x 22 mm) 00-8404 10. 30 % Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) 11. 100 % Methanol PI84-0150 Version 0.0 Seite 3 von 27

Geräte 1. Stoppuhr 2. Pipette (20 µl, 1000 µl) 3. Pipettenspitzen 4. Objektträgergestell 5. Wärmeplatte, Aluminiumfolie und Becherglas (1 l) 6. Objektträger-Wärmer 7. 37 C Inkubator 8. PCR-Thermozykliergerät mit Objektträgerblock ODER Heizblock mit Digitalthermometer und 37 C Inkubator (± 1 C) und feuchte Kammer 9. Wasserbad (für die Aufrechterhaltung eines Temperaturbereichs von 70-80 C) mit kalibriertem Thermometer 10. Coplin Jar- und Färbeküvetten 11. Hellfeldmikroskop mit 20X und 40X Objektiven Vorsichtsmaßnahmen Für den Gebrauch als In-Vitro-Diagnostikum. Nur für den Gebrauch durch geschultes Fachpersonal. Das Kit nach Ablauf des auf dem Etikett angegebenen Haltbarkeitsdatums nicht mehr verwenden. Wird das Produkt unter anderen Bedingungen gelagert als in der Packungsbeilage angegeben, dann müssen diese Lagerungsbedingungen vom Benutzer verifiziert werden. Während der Handhabung der Kitmaterialien nicht essen, trinken, rauchen oder Kosmetika auftragen. Die universellen guten Laborpraktiken sind einzuhalten. Keine verfügbare Testmethode kann die Beseitigung einer potentiellen Biogefahr vollständig gewährleisten. Alle Materialien als biologische Schutzstufe 2 handhaben, wie im Handbuch der Centers for Disease Control/National Institutes for Health für alle potentiell infektiösen humanen Materialien empfohlen. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4. Ausgabe, April 1999. Niemals Reagenzien mit dem Mund pipettieren und eine Berührung der Haut oder Schleimhäute mit Proben und Reagenzien vermeiden. Bei einer Berührung der Reagenzien mit der Haut oder den Schleimhäuten müssen die betroffenen Stellen sofort mit viel Wasser gespült werden. Die Reagenzien B, F und G enthalten 0,1 % Natriumazid, Reagenz H enthält 0,005 % Gentamycinsulfat und 0,1 % Proclin, Reagenz l2 enthält 85 % w/v Methanol und Reagenz l3 enthält 0,6 % Wasserstoffperoxid. In Produktkonzentrationen erfordern diese Reagenzien keine Gefahrenkennzeichnung. Weitere Informationen sind den Sicherheitsdatenblättern der einzelnen Komponenten zu entnehmen. Reagenz B enthält Pepsin. Dieses Enzym kann bei Berührung mit der Haut allergische Reaktionen hervorrufen. Für optimale Ergebnisse das temperaturkalibrierte Wasserbad, den Heizblock und Hybridisierung verwenden. Manche Reagenzien in diesem Kit enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferleitungen reagieren und explosive Metallazide bilden, insbesondere bei einer Akkumulation. Bei der Entsorgung von Reagenzien mit Natriumazid mit reichlich Wasser nachspülen, um eine Anhäufung von chemischen Gefahrstoffen im Leitungssystem zu vermeiden. Manche Reagenzien in diesem Kit enthalten Proclin, Natriumazid oder Wasserstoffperoxid. Diese Reagenzien sind als gesundheitsschädlich klassifiziert, da sie die Haut und Schleimhäute reizen. Diese Substanzen werden verdünnt als Komponenten dieses Kits geliefert, wodurch das Expositionsrisiko auf ein Minimum reduziert, jedoch nicht vollständig vermieden wird. Eine Berührung mit Haut, Augen und Kleidung vermeiden. Weitere Informationen sind den Sicherheitsdatenblättern der einzelnen Komponenten zu entnehmen. 3,3 -Diaminobenzidin-Tetrachlorid (DAB) kann bei Verschlucken, Einatmen oder Absorption durch die Haut gesundheitsschädlich sein und eine Reizung der Augen, Haut, Schleimhäute und oberen Atemwege verursachen. DAB ist ein vermutetes Karzinogen; die Entsorgung unterliegt den vor Ort geltenden Bestimmungen. Ein Verdampfen von Reagenz l2 vermeiden. Methanol verdampft leicht. Es sollten Maßnahmen zur Vermeidung einer Evaporation ergriffen werden, wie die Versiegelung des Behälters und ein sofortiges Verschließen nach dem Gebrauch. Die Evaporatoin von Methanol kann zur Ausfällung von DAB führen, was die Färbeergebnisse beeinträchtigen könnte. Eine Evaporation während der Hybridisierung verhindern, indem sichergestellt wird, dass die Objektträger ordnungsgemäß versiegelt sind und dass in der Hybridisierungskammer angemessene Feuchtigkeit herrscht. PI84-0150 Version 0.0 Seite 4 von 27

Die Enzymvorbehandlung ist je nach Fixierung und Gewebedicke unterschiedlich. Für die meisten Gewebeschnitte (4-5 µm), die mit 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert sind, ist eine Enzymvorbehandlung von 5 Minuten optimal. Bei Geweben mit unbekannter Fixierung sollte eine Enzymtitration (z. B. 2 min, 5 min und 10 min) mit optimaler Verdauzeit, angepasst basierend auf den anfänglichen Ergebnissen, durchgeführt werden. Reagenz C Markierte HER2-Sonde enthält Formamid, was gesundheitsschädlich ist. R21 Gesundheitsschädlich bei Berührung mit der Haut R22 Gesundheitsschädlich beim Verschlucken R61 Kann das Kind im Mutterleib schädigen S24 Berührung mit der Haut vermeiden S36 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen S37 Geeignete Schutzhandschuhe tragen S39 Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen Reagenz I2 DAB-Lösung enthält Methanol, das entzündlich und toxisch ist. Weitere Informationen sind dem Sicherheitsdatenblatt zu entnehmen. R10 Entzündlich R23/24/25 Giftig beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut S45 Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt zuziehen (wenn möglich, dieses Etikett vorzeigen) S36 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen S37 Geeignete Schutzhandschuhe tragen Reagenz K Histomount-Einschlusslösung enthält Toluol, was hochentzündlich und gesundheitsschädlich beim Einatmen ist. Weitere Informationen sind dem Sicherheitsdatenblatt zu entnehmen. R11 Hochentzündlich R20 Gesundheitsschädlich beim Einatmen S2 Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen S16 Von Zündquellen fernhalten Nicht rauchen S25 Berührung mit den Augen vermeiden S29 Nicht in die Kanalisation gelangen lassen S33 Maßnahmen gegen elektrostatische Aufladungen treffen Alle als gebrauchsfertig bezeichneten Reagenzien wurden optimal verdünnt. Ein weiteres Verdünnen können die Testergebnisse negativ beeinflussen. Inkubationszeiten, Reagenzien oder Temperaturen sind optimiert. Der Gebrauch verschiedener Inkubationszeiten, Reagenzien oder Temperaturen könnte die Testergebnisse negativ beeinflussen. Der Gebrauch verschiedener Gewebe-Fixiermittel oder -Dicken ist nicht empfohlen und könnte die Testergebnisse negativ beeinflussen. Anweisungen zur Entsorgung von potentiell toxischen Komponenten sind den vor Ort geltenden Bestimmungen zu entnehmen. Eine mikrobakterielle Kontamination auf ein Minimum reduzieren, um nicht-spezifische Färbung zu vermeiden. Bei der Handhabung von Reagenzien mit äußerster Sorgfalt vorgehen. Beider Handhabung von vermuteten Karzinogenen Wegwerfhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille tragen. Lagerung der Reagenzien Das SPOT-Light HER2 CISH-Kit sollte bei Temperaturen von 2-8 C gelagert werden. Das Reagenz J bei Raumtemperatur (15-30 C) lagern. Hinweis: Reagenz B kann durch hohe Temperaturen negativ beeinflusst werden. Dieses Reagenz unmittelbar nach dem Gebrauch bei Temperaturen von 2-8 C lagern. Dieses Reagenz nicht bei Raumtemperatur lagern. Den PBS Tween 20-Arbeitspuffer für bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur (15-30 C) aufbewahren. Das Kit nach Ablauf des auf dem Etikett angegebenen Haltbarkeitsdatums nicht mehr verwenden. Wird das Produkt unter anderen Bedingungen gelagert als in der Packungsbeilage angegeben, dann müssen diese Lagerungsbedingungen vom Benutzer verifiziert werden. Es gibt keine sichtbaren Anzeichen für die Instabilität dieses Produkts; deshalb ist eine Evaluierung der Kontrollobjektträger wichtig. Bitte wenden Sie sich an den Technischen Kundendienst, wenn ein Problem mit diesem Kit vermutet wird. PI84-0150 Version 0.0 Seite 5 von 27

Gebrauchsanleitung A. Vorbereitung der Probe Paraffineingebettete Gewebeschnitte: Für 6-48 Stunden vor der Paraffineinbettung in neutralgepuffertem Formalin fixiertes Gewebe ist für den Gebrauch geeignet. Andere Fixiermittel als 10 % neutralgepuffertes Formalin wurden nicht für dieses Protokoll optimiert und sind nicht für den Gebrauch geeignet. Gewebeschnitte (4-5 µm dick) müssen auf mit HistoGrip behandelte oder Superfrost Plus-Mikroskop- Objektträger aufgezogen werden. Wenn möglich gleichmäßig dicke Gewebeschnitte verwenden, um eine gleichförmige Färbung der CISH-Detektion und Gegenfärbungsreagenzien zu gewährleisten. 28 Die Objektträger an der Luft oder bei 37 C trocknen und dann für 2-4 Stunden bei 60 C backen. Ordnungsgemäß fixierte und eingebettete Gewebe können vor dem Schneiden und Aufziehen an einem kühlen und trockenen Ort (15-30 C) beliebig lange aufbewahrt werden. 26,27 Gewebeschnitte von 2-3 µm Dicke können falsche niedrige Genkopie-Ergebnisse erbringen. B. Standard-CISH-Verfahren für FFPE-Gewebeschnitte Hinweise zum Verfahren Alle Reagenzien außer Reagenz C (HER2-Sonde) sollte vor dem Gebrauch bei Raumtemperatur (15-30 C) äquilibriert werden. Die HER2-Sonde kann kalt, ohne Äquilibrierung auf Raumtemperatur, verwendet werden. Jede Inkubation sollte bei Raumtemperatur (15-30 C) erfolgen, wenn nicht anders angegeben. Wenn nicht anders angegeben, ist während des gesamten Verfahrens unbedingt darauf zu achten, dass die Gewebeschnitte zwischen den Verfahrensschritten nicht austrocknen. Während des Verfahrens sind mehrere Waschvorgänge erforderlich. Für jede Wäsche muss frische Lösung verwendet werden. Die Kontrollobjektträger müssen bei jedem Durchlauf der Patientenproben mitgeführt und in allen Schritten genau so wie die Testproben behandelt werden. Wenn nicht anders angegeben sind alle Schritte bei Raumtemperatur (15-30 C) auszuführen. Diese Verfahren erfordert mehr als 8 Stunden zur Durchführung: eine praktische Aufteilung ist nachfolgend dargelegt, angefangen an Tag mit Deparaffinierung bis zu Denaturierung und Hybridisierung (über Nacht) und Fortsetzung an Tag 2 mit Stringent Wash bis zu Hellfeld-Mikroskopie. Für das CISH-Verfahren sind die im Kit enthaltenen Reagenzien von Invitrogen erforderlich. Der Gebrauch anderer Reagenzien kann zu einem hohen Hintergrund oder zu Reduzierung oder Verlust des CISH-Signals führen. Der Ersatz der als Komponenten des Kits gelieferten Reagenzien könnte die Testergebnisse ungültig machen. Verfahren an Tag 1 1. Reagenzvorbereitung Xylol (2 Objektträger-Behälter), 100 % EtOH (3 Objektträger-Behälter) o Fest zudecken und bis zu 1 Woche oder bis 100 Objektträger verarbeitet wurden bei Raumtemperatur (15-30 C) aufbewahren. Ethylalkohol-(EtOH)-Serien o Separate Behälter mit 70 %, 85 %, 95 % und 100 % EtOH vorbereiten. o Fest zudecken und bis zu 1 Woche oder bis 100 Objektträger verarbeitet wurden bei Raumtemperatur (15-30 C) aufbewahren. PI84-0150 Version 0.0 Seite 6 von 27

Jedes Waschreagenz ordnungsgemäß etikettieren und die Verwendungsreihenfolge im Verfahren notieren. Diese Reihenfolge beibehalten. 2. Deparaffinierung Hinweis: Für jeden Objektträger-Behälter, der für die Anzahl von Objektträgern im Durchlauf erforderlich ist, ausreichend Reagenz vorbereiten. Jede Wäsche erfordert eine separate Reagenzmenge. Wenn der nächste Schritt nicht sofort ausgeführt werden kann, die Objektträger nach dreimaligem Einweichen in 100 % EtOH an der Luft trocknen lassen, anstatt die Objektträger dreimal in dh2o zu waschen. a) In Xylol eintauchen 2 Mal, jeweils 5 min b) In 100 % EtOH einweichen 3 Mal, jeweils 3 min c) In dh2o waschen 3 Mal, jeweils 2 min Für optimale und reproduzierbare Ergebnisse ist eine vollständige Deparaffinierung erforderlich. 3. Hitzevorbehandlung Hinweis: Die Objektträger müssen für 15 min bei einer Temperatur von 98 C in Hitzevorbehandlungslösung (Reagenz A) gekocht oder erhitzt werden. Die Objektträger dürfen nicht überhitzt werden. Dazu ist sicherzustellen, dass die Temperatur zwischen 98 C bis 100 C verbleibt. Wir empfehlen den Gebrauch der Wärmeplatte für diesen Schritt. (Für Protokolle mit einem Druckkocher mit einem Druck- und Temperaturmesser oder mit einem Mikrowellenherd mit Thermometer wenden Sie sich bitte an den Technischen Kundendienst von Invitrogen unter techsupport@invitrogen.com). Die Hitzevorbehandlungslösung (Reagenz A) kann bis zu zweimal verwendet werden, bevor sie entsorgt werden muss. a) Die Objektträger in das Objektträgergestell platzieren. b) Die Hitzevorbehandlungslösung (Reagenz A) in einem Becherglas auf einer Wärmeplatte erhitzen, bis sie stetig kocht und eine Temperatur von 98 C hat. Um ein Verdampfen des Puffers zu verhindern, sollte das Becherglas mit einem Glasdeckel oder Aluminiumfolie abgedeckt werden. c) Die Objektträger in die kochende Lösung geben, das Becherglas zudecken und wenn die Temperatur wieder 98 C erreicht hat oder Kochbläschen wieder auftauchen, für 15 min kochen. Sicherstellen, dass die Temperatur zwischen 98 C und 100 o C bleibt. d) Die Objektträger sofort in die dh2o-lösung mit Raumtemperatur (15-30 C) überführen. e) Dreimal für jeweils 2 min in dh2o waschen. 4. Enzymverdau Hinweis: Für die meisten Brustgewebeproben ergibt ein Enzymverdau von 5 min bei Raumtemperatur (15-30 C) optimale CISH-Ergebnisse. Die Verdauzeit sollte basierend auf den anfänglichen Ergebnissen mit 5 min Verdauzeit angepasst werden. Je nach Gewebedicke und Fixierungsmethode könnte eine andere Verdauzeit erforderlich sein. Eine Enzymverdaustudie hat ergeben, dass die Enzymverdauzeit von 2-20 min dauern kann und geeignete CISH-Signale für die HER2-Evaluierung in einem Satz von archivierten Brustgewebeproben ergibt. In einer Konkordanzstudie zur Unterstützung des Gebrauchs von CISH im Vgl. zu FISH, in der klinischen Brustkrebsgewebeproben verwendet wurden, die innerhalb von 12 Monaten des Studiendatums verarbeitet wurden, ergab die Enzymverdauzeit von 5 min optimale CISH-Signale für die HER2- Genevaluierung. (28) a) Das Enzymvorbehandlungsreagenz (Reagenz B) auf Raumtemperatur bringen (15-30 C). b) Ausreichend Reagenz B hinzufügen, um den Gewebeschnitt zu bedecken, und bei Raumtemperatur (15-30 C) 5 Min lang inkubieren. c) Dreimal jeweils 2 min lang in dh2o waschen. 5. Dehydrierung in gradierten Ethanol-Serien: a) 70 % EtOH 2 min b) 85 % EtOH 2 min c) 95 % EtOH 2 min d) 100 % EtOH 2 min e) 100 % EtOH 2 min 6. Die Objektträger für 20 min oder bis sie trocken sind an der Luft trocknen lassen. Die Objektträger, falls erforderlich, mit Bleistift beschriften. PI84-0150 Version 0.0 Seite 7 von 27

7. Denaturierung und Hybridisierung Hinweis: Ein PCR-Thermozykliergerät mit Objektträgerblock oder einen Heizblock mit Digitaler Temperaturanzeige und eine feuchte Objektträger-Kammer mit einem Inkubator (37 C) oder ein ähnliches Instrument verwenden. Sicherstellen, dass in den Kammern eine angemessene Feuchtigkeit erhalten bleibt. Eine Hybridisierung für kürzere Zeiträume kann ein schwächeres Signal zur Folge haben. Die Sondendenaturierung bei einer niedrigeren Temperatur als im Protokoll empfohlen, kann zu einem schwachen oder fehlenden CISH- Signal führen. Eine Änderung der Inkubationszeiten kann entweder zu einem schwachen Signal oder Hintergrundfärbung führen. a) Mitten auf ein 22 x 22 mm Deckglas15 µl der HER2-Sonde (Reagenz C) auftragen. Je nach Gewebegröße kann mehr oder weniger Sonde erforderlich sein. Je nach Deckglas-Größe das folgende Sondenvolumen verwenden: 18 mm x 18 mm 10 µl 22 mm x 22 mm 15 µl 24 mm x 30 mm 20 µl b) Das Deckglas mit der Sondenseite nach unten auf den entsprechenden Bereich mit der Gewebeprobe auf dem Objektträger geben. Anstelle von Standarddeckgläsern können die CISH UnderCover -Deckgläser von Invitrogen verwendet werden. Bei Gebrauch der CISH UnderCover -Deckgläser das Schutzpapier von der Rückseite abziehen und die Seite mit dem freiliegenden Deckglas (von der soeben das Schutzpapier abgezogen wurde) auf den entsprechenden Bereich auf dem Objektträger auflegen, um die Gewebeprobe zu bedecken. Die Kanten des Klebebands festdrücken, um das Deckglas zu versiegeln und ein Verdampfen zu vermeiden. NICHT AUF DIE MITTE DES DECKGLASES DRÜCKEN. c) Bei Gebrauch eines Standarddeckglases muss dieses versiegelt werden, um ein Verdampfen während der Inkubation zu vermeiden. Die Versiegelung kann mit einer 5-ml-Spritze und einer 18G ½ -Nadel erfolgen. Die Spritze mit Rubber Cement füllen und eine dünne Schicht so auf die Kanten des Abdeckglases auftragen, das sich ein Teil auf dem Objektträger befindet. d) Den Rubber Cement trocknen lassen (~10 min), um zu verhindern, dass das Deckglas vom Objektträger rutscht. e) Zur Denaturierung und Hybridisierung kann ein PCR-Thermozykliergerät mit Objektträgerblock oder ein Heizblock mit digitaler Temperaturanzeige und eine feuchte Objektträger-Kammer mit einem Inkubator (37 C) verwendet werden. 1) Bei Gebrauch eines PCR-Thermozykliergeräts mit Objektträgerblock: Bei 95 ºC (± 1 ºC) für 5 min denaturieren, gefolgt von einer Inkubation über Nacht (10-18 Std.) bei 37 ºC (± 1 ºC). 2) Bei Gebrauch eines Heizblocks mit digitaler Temperaturanzeige und einer feuchten Objektträger- Kammer mit einem Inkubator (37 C): Bei 95 ºC (± 1 C) für 5 min denaturieren, gefolgt von einer Inkubation über Nacht (10-18 Std. bei 37 ºC (± 1 C) in einer feuchten Kammer. Verfahren an Tag 2 8. Reagenzvorbereitung PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) o 1 Packung PBS-Pulver (Reagenz E1) zu 1 l dh 2 O hinzugeben. Vermischen. PBS/Tween 20 Puffer (0,01 % Tween) o 10 Tropfen 50 % Tween 20 (Reagenz E2) zu 1 l PBS (siehe oben) zugeben. Vermischen. o Bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur (15-30 C) aufbewahren. Substrat-Chromogen-Lösung (DAB) o Diese Lösung erst unmittelbar vor dem Gebrauch zubereiten. o Je 1 Tropfen jedes Reagenz (I1, I2, I3) zu 1 ml dh 2 O hinzugeben. Gut vermischen. 3 % H 2 O 2 in absolutem Methanol o 1 Teil von 30 % H 2 O 2 9 Teilen Methanol hinzugeben. o Fest zudecken und bis zu 1 Woche oder bis 100 Objektträger verarbeitet wurden bei Raumtemperatur (15-30 C) aufbewahren. Xylol (2 Objektträgergestelle) o Fest zudecken und bis zu 1 Woche oder bis 100 Objektträger verarbeitet wurden bei Raumtemperatur (15-30 C) aufbewahren. PI84-0150 Version 0.0 Seite 8 von 27

9. Stringent Wash Hinweis: Die Verwendung von höheren Temperaturen als vom Verfahren empfohlen, kann zu einer Reduzierung oder einem vollständigen Verlust des CISH-Signals führen. Wäschen mit einer zu niedrigen Temperatur können zu einem hohen Hintergrund führen. Zur Gewährleistung, dass die richtige Temperatur für das Wasserbad ereicht und beibehalten wird, ist ein kalibriertes Thermometer zu verwenden. a) Das Wasserbad (70 ºC (±1 C)) einschalten und auf Temperatur bringen. b) Zwei Coplin Jar-Küvetten mit SSC-Puffer (Reagenz D) vorbereiten, eine mit Raumtemperatur, die andere auf 70 C erhitzt. c) Rubber Cement oder das UnderCover -Deckglas abziehen. Den Gewebeschnitt nicht austrocknen lassen. d) Um das Deckglas zu entfernen, ohne das Gewebe zu zerreißen: Die Objektträger in SSC mit Raumtemperatur für ~2-3 min einweichen, bis das Deckglas leicht heruntergleitet. Dann mit dem nächsten Schritt fortfahren. e) Die Objektträger kurz in der Küvette mit dem Raumtemperatur-SSC (15-30 C) spülen und dann 5 min lang in die Coplin Jar-Küvette mit SSC im 70 ºC (±1 C) Wasserbad eintauchen. f) Die Objektträger 3 Mal für jeweils 2 min in dh2o waschen. 10. Immundetektion a) Die Objektträger für 10 min in 3 % H2O2 in 100 % Methanol eintauchen. b) 3 Mal für jeweils 2 min in PBS/Tween 20 (0,01 %) waschen. c) CAS-Block TM (Reagenz F) hinzugeben: 2-3 Tropfen/Objektträger oder genug, um das Gewebe zu bedecken, und für 10 min bei Raumtemperatur (15-30 C) inkubieren. d) Reagenz F mit Labortuch abtupfen. Nicht spülen. e) Maus-Antidigoxigenin-Antikörper (Reagenz G) zugeben: 2-3 Tropfen/Objektträger oder genug, um das Gewebe zu bedecken, und für 30 min bei Raumtemperatur (15-30 C) inkubieren. f) 3 Mal für jeweils 2 min in PBS/Tween 20 (0,01 %) waschen. g) Ziegen-Anti-Maus-HRP-Polymerkonjugat (Reagenz H) hinzufügen: 2-3 Tropfen/Objektträger oder genug, um das Gewebe zu bedecken, und für 30 min bei Raumtemperatur (15-30 C) in einer feuchten Kammer inkubieren. h) 3 Mal für jeweils 2 min in PBS/Tween 20 (0,01 %) waschen. i) Während der Wäsche DAB-Substrat-Chromogenlösung vorbereiten: je einen Tropfen jedes Reagenz (Reagenz I1, I2, I3) zu 1 ml dh 2 O hinzugeben. j) Substrat-Chromogenlösung (DAB) hinzugeben: 2-3 Tropfen/Objektträger oder genug, um das Gewebe zu bedecken, und für 30 min bei Raumtemperatur (15-30 C) in einer feuchten Kammer inkubieren. k) Die Objektträger in das Objektträgergestell platzieren. l) Für 2 min mit laufendem Leitungswasser waschen. 11. Gegenfärbung und Einschluss Hinweis: Für 3-5 sek kurz gegenfärben und das Gewebe ohne Deckglas unter dem Mikroskop untersuchen. Für weitere 3-5 sek gegenfärben, wenn eine stärkere Nuklearfärbung gewünscht wird. Die Dauer der Gegenfärbung ist von dem verwendeten Gewebe abhängig. Ein dunkles Gegenfärben ist nicht empfohlen, da positive Färbesignale dadurch verdeckt werden könnten. a) Das Gewebe mit Hämatoxylin (Reagenz J) gegenfärben: 3-5 sek b) Für 2 min unter laufendem Leitungswasser waschen. c) In gradierter EtOH-Serie für 2 min in jedem Grad dehydrieren. (70 %, 85 %, 95 %, 100 %, 100 %, von tag 1 aufbewahrt und in der gleichen Reihenfolge zu verwenden.) d) 2 Mal für jeweils 2 min in Xylol eintauchen. Dieses Xylolbad muss anders sein als das an Tag 1 verwendete. Es kann in diesem Schritt für 1 Woche oder bis zu 100 Objektträger wiederverwendet werden. e) Deckglas mit Histomount -Einschlusslösung (Reagenz K). f) Die Objektträger bei Raumtemperatur (15-30 C) für eine zukünftige Analyse der Ergebnisse aufbewahren. Verfahrensgrenzen Mit dem SPOT-Light HER2 CISH-Kit können evtl. die berichteten 5 % (10) der Fälle von Brustkrebs nicht erkannt werden, die bei Immmunhistochemie (IHC) positiv, jedoch negativ für HER2-Genamplifikation sind. PI84-0150 Version 0.0 Seite 9 von 27

CISH ist ein aus mehreren Schritten bestehendes Verfahren, für das eine spezialisierte Schulung im Gebrauch der entsprechenden Reagenzien, der Wahl von Gewebe, der Fixierung, Verarbeitung, Vorbereitung von CISH-Objektträgern und Interpretation der Färbeergebnisse erforderlich ist. Die Gewebefärbung ist abhängig von der vorangehenden Handhabung und Verarbeitung der Gewebeprobe. Ein übermäßiges oder unvollständiges Gegenfärben kann die Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen. Jede Abweichung vom empfohlenen Testverfahren kann die vorgegebenen erwarteten Ergebnisse ungültig machen. Angemessene Kontrollen müssen angewendet und dokumentiert werden. Benutzer, die vom empfohlenen Testverfahren abweichen, müssen die Verantwortung für die Interpretation der Probenergebnisse unter diesen Bedingungen übernehmen. Das SPOT-Light HER2 CISH-Kit wurde nur zur Identifikation und Quantifizierung des HER2/neu-Gens in Interphasen-Zellkernen in formalinfixierten, paraffineingebetteten menschlichen Brustkrebsgewebeproben optimiert. Andere Arten von Proben oder Fixiermitteln wurden nicht validiert. Die klinische Interpretation von Testergebnissen sollte im Kontext der klinischen Anamnese des Patienten und anderer diagnostischer Labortestergebnisse erfolgen. PI84-0150 Version 0.0 Seite 10 von 27

Qualitätskontrolle Positive und negative Kontrollen auf einem einzelnen Objektträger Kontroll- Objektträger L. A B Bild 1. Kontroll-Objektträger L enthält die nicht-amplifizierte Zelllinie A (MCF-7) und die amplifizierte Zelllinie B (SK-OV-3). Hinweis: Die Zelllinien sind nicht maßstabsgetreu dargestellt und kleiner als im Diagramm angegeben. Das CISH-Signal sollte braun, deutlich und leicht zu evaluieren sein. Die eingeschlossenen Kontroll-Objektträger (Objektträger L) enthalten zwei 4 µm Schnitte aus FFPE- Zellblöcken, aus zwei verschiedenen Zelllinien vorbereitet wurden. Diese Objektträger sollten als Verfahrenskontrollen verwendet werden. Zelllinie A (MCF-7) ist nicht-amplifiziert und hat 5 Signale oder Punkte pro Zellkern. Zelllinie B (SK-OV-3) ist amplifiziert und erscheint als kleine bis große DAB- Cluster im Zellkern. Der Kontroll-Zelllinien-Objektträger muss bei jedem Durchlauf von Patiententest-Objektträgern mitgeführt werden und sollte genau so behandelt werden wie die Gewebeschnitte. Wenn der Kontroll-Objektträger (Objektträger L) für die Zelllinien A und B negativ, bedeutet dies, dass während des CISH-Verfahrens ein Fehler eingetreten ist. Die positive Kontroll-Zelllinie (B), die bekanntermaßen die HER2-Amplifikation demonstriert, sollte zuerst untersucht werden, um sicherzustellen, dass alle Reagenzien ordnungsgemäß funktionieren. Das Vorhandensein von Genclustern, oder >5 individuelle Signale oder Punkte innerhalb des Zellkerns einer einzelnen Zelle zeigt eine zu erwartende positive Reaktivität an. Wenn die positive Kontrolle nicht die Anwesenheit von Clustern oder >5 Signalen pro Zellkern in der Mehrheit (>50 %) der Karzinom-Zellen angibt, sollten die für die Patientenprobe erhaltenen Ergebnisse als ungültig erachtet werden. Die negative oder normale Kontroll-Zelllinie (A), die bekanntermaßen die HER2-Genamplifikation demonstriert, sollte 5 Punkte im Zellkern jeder Zelle enthalten. Bei einer nicht-spezifischen Färbung im Zellkern der normalen Kontrolle (A), sollten die für die Patientenprobe erhaltenen Ergebnisse als ungültig erachtet werden. Bei nicht-spezifischer Färbung erscheint die Färbung gewöhnlich diffus. Gelegentlich ist in Gewebeschnitten, die übermäßig mit Formalin fixiert wurden, eine sporadische Braunfärbung außerhalb der Zellkerne zu beobachten. In solchen Fällen sollten die Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert werden. Nicht-spezifische Färbung sollte nicht mit positiven CISH-Signalen verwechselt werden. Eine positive Gewebekontrolle, die aus Brustkrebsgewebe mit bekannter HER2-Amplifikation besteht, falls verwendet, sollte die Anwesenheit von Genclustern oder >5 individuelle Signale oder Punkte pro Zellkern bei der Mehrheit (>50 %) der Karzinom-Zellen zeigen, was eine zu erwartende positive Reaktivität anzeigt. Wenn die positive Kontrolle nicht die Anwesenheit von Clustern oder >5 Signalen pro Zellkern in der Mehrheit (>50 %) der Karzinom-Zellen angibt, sollten die für die Patientenproben erhaltenen Ergebnisse als ungültig erachtet werden. Eine negative Gewebekontrolle, die aus Brustkrebsgewebe mit bekannter HER2-Nicht-Amplifikation besteht, falls verwendet, sollte <5 Signale pro Zellkern in der Mehrheit (>50 %) der Karzinom-Zellen enthalten. Im Allgemeinen bestätigt die Anwesenheit von nicht mehr als zwei Signalen oder Punkten im Zellkern des normalen Gewebegegenstücks (normale Epithel- oder Stromazellen im Tumor) der positiven Gewebekontrolle, dass die Sonde und Immundetektionsreagenzien nicht mit den Zell- oder Gewebekomponenten reagieren. Wenn im Zellkern des normalen Gewebegegenstücks der positiven Gewebekontrolle eine nicht-spezifische Färbung stattfindet, sollten die für die Patientenproben erhaltenen Ergebnisse als ungültig erachtet werden. Die Variationen in der Gewebeverarbeitung und den technischen Verfahren im Labor des Benutzers müssen validiert werden, da sie signifikante Unterschiede in den Ergebnissen erzeugen und die Durchführung von internen Kontrollen zusätzlich zum folgenden Verfahren erforderlich machen könnten. Interpretation Beurteilung der Angemessenheit der Objektträger Die HER2 CISH-Punkte (Signale) sollten klein, unter einem 20X-40X Objektiv jedoch deutlich sichtbar sein. Die Punkte erscheinen braun vor dem Hintergrund der Gegenfärbung. Wenn keine Punkte in der Probe sichtbar sind, muss der Test wiederholt werden. Bitte rufen Sie den Technischen Kundendienst von Invitrogen unter 1-800-955-6288 (nur USA) an, um die möglichen Ursachen des Problems zu besprechen. PI84-0150 Version 0.0 Seite 11 von 27

Aussehen des CISH-Signals siehe Anhang A, Richtlinien zur Interpretation des HER2 CISH-Tests HER2 CISH-Punkte sehen folgendermaßen aus: Ein einzelner Punkt (Abbildung G). Ein einzelner Punkt hat bei normalen oder Karzinom-Zellen ein glatte, gerundete Kante. Ein einzelner Punkt repräsentiert eine einzige HER2-Genkopie. Ein Duplett (Abbildung H). Punkte erscheinen als Paare und stellen keinen wahren kleinen Cluster dar. Wenn zwei Signale um weniger als den Durchmesser eines Signals voneinander getrennt sind, sollten sie als ein Punkt gezählt werden. Das Duplett ist das Ergebnis der Chromosomenteilung, wobei jedes Signal auf einem Paar von Schwesterchromatiden lokalisiert ist. 29 Ein kleiner Cluster (Abbildung E). Ein kleiner Cluster ist eine unregelmäßig geformte Gruppe von Signalen mit einem 3-5 Mal größeren Durchmesser als ein einzelner Punkt. Ein einzelner Punkt aus den Krebs- oder normalen Epithelzellen vom gleichen Objektträger kann als Referenz herangezogen werden. Ein großer Cluster (Abbildung A). Ein großer Cluster ist eine unregelmäßig geformte Gruppe von Signalen mit einem mehr als 5 Mal größeren Durchmesser als ein einzelner Punkt. Ein einzelner Punkt aus den Krebs- oder normalen Epithelzellen vom gleichen Objektträger sollte als Referenz herangezogen werden. Vergrößerung 10X 20X 40X 60X oder 100X CISH-Signals Einzelne Punkte sind kaum sichtbar und leicht zu übersehen. Einzelne Punkte sind klein, jedoch deutlich zu erkennen. Einzelne Punkte sind klar erkennbar. Nicht notwendig. Wahl der Zielfelder für die HER2 CISH-Signalauszählung: Mit 4X-20X Objektiven die CISH-gefärbte Probe scannen, um die histopathologisch am meisten repräsentativen Bereiche von invasivem Karzinom zu identifizieren. Nekrotische Bereiche, überlappende Signale aufgrund von überlappenden Zellkernen und Zellkerne mit schwacher Signalintensität sollten vermieden werden. Bei invasiven Karzinomen intraduktale Karzinomkomponenten (DCIS) vermeiden. Eine mögliche intratumorale Heterogenität des HER2-Genstatus vor der CISH-Auszählung evaluieren. Ist die Probe homogen, einen Gewebebereich mit starken CISH-Signalen zur Signalauszählung wählen. Mit der Signalauszählung fortfahren. Hat die Probe intratumorale Heterogenität des HER2-Genstatus in der invasiven Karzinomkomponente, zur Signalauszählung Bereiche wählen, die jeden HER2-Genstatus repräsentieren. Eine Gewebeprobe ist heterogen, wenn der HER2-Genstatus (amplifizierte oder nicht-amplifizierte Zellen) in verschiedenen Bereichen des gleichen Schnittes eines primären Mammakarzinoms variiert. Zelle in jedem Heterogenitätsbereich müssen evaluiert werden, um zu bestimmen, welcher HER2-Status (amplifiziert oder nicht-amplifiziert) in mehr als 50 % des Tumorschnitts vorwiegend vorhanden ist. Mit der Signalauszählung des Bereichs fortfahren, in dem der HER2-Status für diesen Tumor prädominant ist. Signalauszählung Ein 40X Objektiv verwenden. Wie erforderlich kann ein stärkeres Objektiv verwendet werden, eine Ölimmersion ist jedoch nicht erforderlich. Siehe Anhang A, Richtlinien zur Interpretation des HER2 CISH-Tests. Ein einzelnen HER2-Gen erscheint als einzelner kleiner runder Punkt (Abbildung G). Keine überlappenden Zellkerne zählen und keine Bereiche, in denen keine Zellkerne sichtbar sind. Nur das CISH-Signal zählen, das sich innerhalb eines Zellkerns befindet. Gelegentliche sporadische Signale ausschließen, die auf Rückstände von HER2- DNA-Spillage durch das Turnover von Krebszellen außerhalb des Zellkerns zurückzuführen sind. Nicht-Amplifikation o Definiert als 1-5 einzelne Punkte in der Mehrzahl (>50 %) der Krebszellen im gewählten Gewebebereich. o Es ist nicht erforderlich, die Punkte in 30 Zellen zu zählen. Optional: Zur Zellauszählung kann das Arbeitsblatt in Anhang B, HER2 CISH-Scoring-Blatt verwendet werden. Die Ergebnisse werden als das Mittel der gesamten Auszählung von 30 Zellen berichtet, um eine eindeutige Diagnose der Nicht- Amplifikation zu erhalten. Amplifikation o Definiert als: PI84-0150 Version 0.0 Seite 12 von 27

o o >5 Punkte in der Mehrheit (>50 %) der Karzinom-Zellen in gewählten Gewebebereich, oder o Große Cluster in der Mehrheit (>50 %) der Karzinom-Zellen in gewählten Gewebebereich, oder o Eine Mischung aus mehreren Punkten und großen Clustern in der Mehrheit (>50 %) der Karzinom-Zellen in gewählten Gewebebereich, oder o Eine Mischung aus mehreren Punkten und kleinen Clustern in der Mehrheit (>50 %) der Karzinom-Zellen in gewählten Gewebebereich, oder o Cluster in der Mehrheit (>50 %) der Karzinom-Zellen in gewählten Gewebebereich. Für jeden der obigen Fälle ist es nicht erforderlich, die Punkte in 30 Zellen zu zählen. Optional: Zur Zellauszählung kann das Arbeitsblatt in Anhang B, HER2 CISH-Scoring-Blatt verwendet werden. Die Ergebnisse werden als das Mittel der gesamten Auszählung von 30 Zellen berichtet, um eine eindeutige Diagnose der Amplifikation zu erhalten. Bei der Auszählung gilt ein kleiner Cluster als 5 Punkte und ein großer Cluster als 10 Punkte. o Rationale: Die Zuweisung der spezifischen Punktzahlen so kleinen und großen Clustern erfolgt arbiträr für Quantifizierungszwecke. Zellen haben normalerweise zwei HER2- Genkopien. Zellen, in denen eine DNA-Replikation, jedoch noch keine Zellteilung erfolgt ist, haben 4 Genkopien. Ein kleiner Cluster ist somit ein Zeichen für Amplifikation und hat mindestens 5 Genkopien. Ein großer Cluster, der mindestens doppelt so groß ist wie ein kleiner Cluster, hat mindestens 10 Genkopien. Unklare Fälle von Amplifikation oder Nicht-Amplifikation Proben, die nicht eindeutig in die Amplifikations- oder Nicht-Amplifikationskategorien fallen, sind mit Vorsicht zu interpretieren. Diese Proben weisen in der Mehrheit (>50%) der Karzinom-Zellen im gewählten Zielbereich 4-6 Punkte auf. Wenn die mittlere Anzahl an Punkten nach der Auszählung von 30 Karzinom-Zellen wischen 4 und 6 liegt, sollten weitere 30 Zellen für insgesamt 60 Zellen ausgezählt werden. Bestehen immer noch Zweifel, sollte der Test mit einem frischen Probeobjektträger wiederholt werden. Die Ergebnisse können mit Hilfe des Arbeitsblatts in Anhang B, HER2 CISH-Scoring-Blatt berichtet werden. 1. Die Punkte in 30 Tumorzellen im gewählten Gewebebereich auszählen. Siehe Nr. 4 unten, wenn kleine Cluster sichtbar sind. 2. Die Anzahl der Punkte in den 30 Zellen zusammenziehen und den Mittelwert berechnen. 3. Das Ergebnis basierend auf dem Mittelwert von 60 Zellen aufzeichnen. 4. Wen eine Mischung aus einzelnen Punkten und kleinen Clustern (aufgrund des Clustering von mehreren einzelnen Zellen) oder nur kleine Cluster beobachtet werden: Einen kleinen Cluster als 5 Punkte zählen. Ein einzelner Punkt aus den Krebs- oder normalen Epithelzellen des gleichen Objektträgers kann zur Bestimmung eines kleinen Clusters als Referenz herangezogen werden. 5. Die Ergebnisse werden als der Mittelwert aus insgesamt 60 Zellen berichtet, um eine Diagnose von Amplifikation oder Nicht-Amplifikation im Rahmen der Invitrogen-Richtlinie zu erhalten. Berichten von Ergebnissen Die Ergebnisse können mithilfe des Arbeitsblatts in Anhang B, HER2 CISH-Scoring-Blatt berichtet werden. Der HER2-Statusbericht muss der Invitrogen-Richtlinie gemäß berichtet werden, insbesondere bei unklaren Fällen einer Amplifikation oder Nicht-Amplifikation. PI84-0150 Version 0.0 Seite 13 von 27

Zusammenfassung der Interpretation Amplifikation Nicht- Amplifikation Vorhandensein von >5 Punkten oder großen Cluster oder einer Mischung aus mehreren Punkten und großen Clustern oder einer Mischung aus mehreren Punkten und kleinen Clustern oder kleiner Cluster des HER2-Gens pro Zellkern in der Mehrheit (>50 %) der Karzinom-Zellen im zur Auszählung gewählten Gewebebereich. Siehe Abbildung A, B, C, D und E in Anhang A, Richtlinien zur Interpretation des HER2 CISH-Tests. Ein großer Cluster ist eine unregelmäßig geformte Gruppe von Signalen mit einem mehr als 5 Mal größeren Durchmesser als ein einzelner Punkt. Ein einzelner Punkt aus den Krebs- oder normalen Epithelzellen vom gleichen Objektträger muss als Referenz herangezogen werden. Siehe Anhang A, Abbildung A. Ein kleiner Cluster ist eine unregelmäßig geformte Gruppe von Signalen mit einem 3-5 Mal größeren Durchmesser als ein einzelner Punkt. Ein einzelner Punkt aus den Krebsoder normalen Epithelzellen vom gleichen Objektträger muss als Referenz herangezogen werden. Siehe Anhang A, Abbildung E. Vorhandensein von 1-5 Punkten des HER2-Gens pro Zellkern in der Mehrheit (>50 %) der Karzinom-Zellen im zur Auszählung gewählten Gewebebereich. Siehe Anhang A, Abbildung F, Abbildung G und Abbildung H. Ein einzelner Punkt hat eine glatte, gerundete Kante und ist in normalen und Karzinom- Zellen vorhanden. PI84-0150 Version 0.0 Seite 14 von 27

Erwartete Werte (8, 9) Die Prävalenz von amplifiziertem HER2-Gen in der allgemeinen Population von Frauen mit Brustkrebs beträgt 18-30 %. Beim Vergleich der HER2-Genamplifikation mit der HER2-Proteinüberexpression haben Studien ergeben, dass bis zu 5 % der Brustkrebspatienten bei Immunhistochemietestung (IHC) positiv für Protein-Überexpression, jedoch negativ für HER2- Genamplifikation sind. (10) Spezifische Leistungsmerkmale Klinische Leistung Die Sicherheit und Wirksamkeit des SPOT-Light HER2 CISH-Kits wurde in einer Vergleichsstudie mit drei Tests evaluiert: SPOT-Light HER2 CISH-Kit, PathVysion FISH und HercepTest. An der Studie waren zwei Sätze von Fällen beteiligt: 226 aufeinander folgende Fälle und 60 Zusatzfälle. Die aufeinander folgenden Fälle wurden aus aufeinander folgenden Brustkrebsfällen gewählt, die an zwei Prüfzentren (A und B) hinsichtlich der Patientenversorgung untersucht wurden. Die Zusatzfälle waren Fälle, die während der Patientenversorgung an Prüfzentrum A mit 2+ mit Immunhistochemie (IHC) (mit Antikörper AB8) bewertet wurden. A. Aufeinander folgende Fälle In der folgenden Tabelle ist die Verteilung der CISH- und FISH-Ergebnisse im Verhältnis zu den HercepTest -Scores zusammengefasst. Ein Test galt als gültig, wenn der resultierende gefärbte Objektträger zur Evaluierung akzeptabel war. Tabelle 1: Ergebnisse von IHC, FISH und CISH Proteinexpression, HercepTest -Score 0 1 2 3 Gesamt IHC-Fälle (N) 141 19 21 40 221 (%) 1 63,8 % 8,6 % 9,5 % 18,1 % 100 % Genverhältnis mit FISH HER2-Status Anzahl gültiger FISH-Fälle 2 140 19 21 38 218 Amplifiziert n (%) 3 1 (0,5) 0 (0,0) 5 (2,3) 31 (14,2) 37 Nicht-amplifiziert n (%) 3 139 (63,8) 19 (8,7) 16 (7,3) 7 (3,2) 181 Genkopien mit CISH HER2-Status Anzahl gültiger CISH-Fälle 2 132 17 19 38 206 Amplifiziert n (%) 3 1 (0,5) 0 (0,0) 3 (1,5) 32 (15,5) 36 Nicht-amplifiziert n (%) 3 131 (63,6) 17 (8,3) 16 (7,8) 6 (2,9) 170 1 % = N Gesamt N 100% 2 Anzahl gültiger FISH- (oder CISH-) Fälle mit entsprechendem IHC-Score. 3 % = n Gesamtzahl der gültigen FISH- (oder CISH-) Fälle 100 % CISH-Ergebnisse Tabelle 2: Übereinstimmung zwischen CISH und IHC IHC-Ergebnisse Positiv (3+) Negativ (<3+) Gesamt Amplifiziert 32 4 36 Nicht-amplifiziert 6 164 170 Gesamt 38 168 206 Es wurden 20 Fälle entweder mit fehlenden oder ungültigen IHC- oder CISH-Testergebnissen berichtet und aus der Tabelle ausgeschlossen. Positive Übereinstimmung = 32/38 = 84,2 % (95 % KI: 68,8 %, 94,0 %) Negative = 164/168 = 97,6 % (95 % KI: 94,0 %, 99,4 %) Übereinstimmung Gesamtprozent Übereinstimmung = (32+164)/206 = 95,1 % (95 % KI: 91,3 %, 97,7 %) Die Ergebnisse zeigten eine Konkordanz von 95,1 % (95 % KI: 91,3 % - 97,7 %), was auf eine starke Übereinstimmung zwischen dem SPOT-Light HER2 CISH-Kit und dem HerceptTest hindeutet. PI84-0150 Version 0.0 Seite 15 von 27

CISH-Ergebnisse Tabelle 3: Übereinstimmung zwischen CISH und FISH FISH-Ergebnisse Amplifiziert Nicht-amplifiziert Gesamt Amplifiziert 34 0 34 Nicht-amplifiziert 2 169 171 Gesamt 36 169 205 Es wurden 21 Fälle entweder mit fehlenden oder ungültigen FISH- oder CISH-Testergebnissen berichtet und aus der Tabelle ausgeschlossen. Positive Übereinstimmung = 34/36 = 94,4 % (95 % KI: 81,3 %, 99,3 %) Negative Übereinstimmung = 169/169 = 100,0 % (95 % KI: 97,8 %, 100,0 %) Gesamtprozent Übereinstimmung = (34+169)/205 = 99,0 % (95 % KI: 96,5 %, 99,9 %) Die Ergebnisse zeigten eine Konkordanz von 99,0 % (95 % KI: 96,5 % - 99,9 %), was auf eine starke Übereinstimmung zwischen dem SPOT-Light HER2 CISH-Kit und dem PathVysion HER2-Test hindeutet. Die Übereinstimmungsrate zeigte also an, dass der Test mit dem SPOT-Light HER2 CISH-Kit Ergebnisse erbrachte, die mit dem PathVysion HER2-Test übereinstimmten. Eine Zusammenfassung der 2 nicht übereinstimmenden Fälle zwischen dem SPOT-Light HER2-Sondentest und dem PathVysion HER2-Sondentest ist unten gezeigt. Die CISH- und FISH-Daten wurden als Mittelwert und Bereich präsentiert, und die IHC-Spalte zeigt den HercepTest -Score. Tabelle 4: Nicht übereinstimmende Fälle zwischen FISH und CISH HER2 CISH (Pos)/FISH (Neg) HER2 CISH (Neg)/FISH (Pos) Fallnummer CISH FISH IHC Fallnummer CISH FISH IHC (2, 0,98 %) 1 A-095-01 4,07 (1, 00-10,00) 2,81 (1,67-5,00) 2+ B-008 2,77 (2,00-4,00) 2,65 (1,00-6,00) 2+ 1 % = Anzahl der nicht übereinstimmenden Fälle, dividiert durch die Gesamtzahl der Fälle mit gültigen FISH- und CISH-Werten vom entsprechenden Prüfzentrum 100 % B. IHC 2+ Zusatzfälle Weitere 60 IHC 2+ Zusatzfälle wurden von Prüfzentrum A geliefert und in Prüfzentrum A und B getestet. Die Ergebnisse an jedem Prüfzentrum zeigten, dass der SPOT-Light HER2 CISH-Kit-Test Ergebnisse erbrachte, die mit dem PathVysion HER2-Test übereinstimmten. Die Korrelationsergebnisse sind in Tabelle 5 und 6 zusammengefasst. Tabelle: 5 Übereinstimmung zwischen CISH und FISH an Prüfzentrum A bei IHC 2+ Fällen CISH-Ergebnisse FISH-Ergebnisse Amplifiziert Nicht-amplifiziert Gesamt Amplifiziert 6 0 6 Nicht-amplifiziert 2 46 48 Gesamt 8 46 54 6 Fälle mit fehlenden oder ungültigen Daten wurden berichtet Positive Übereinstimmung = 6/8 = 75,0 % (95 % KI: 34,9 %, 96,8 %) Negative Übereinstimmung = 46/46 = 100,0 % (95 % KI: 92,3 %, 100,0 %) Gesamtprozent Übereinstimmung = (6+46)/54 = 96,3 % (95 % KI: 87,3 %, 99,6 %) Tabelle 6: Übereinstimmung zwischen CISH und FISH an Prüfzentrum B auf IHC 2+ Fällen CISH-Ergebnisse FISH-Ergebnisse Amplifiziert Nicht-amplifiziert Gesamt Amplifiziert 7 2 9 Nicht-amplifiziert 2 45 47 Gesamt 9 47 56 4 Fälle mit fehlenden oder ungültigen Daten wurden berichtet Positive Übereinstimmung = 7/9 = 77,8 % (95 % KI: 40,0 %, 97,2 %) Negative Übereinstimmung = 45/47 = 95,7 % (95 % KI: 85,5 %, 99,5 %) Gesamtprozent Übereinstimmung = (7+45)/56 = 92,9 % (95 % KI: 82,7 %, 98,0 %) PI84-0150 Version 0.0 Seite 16 von 27

Fallnummer Tabelle 7: Nicht übereinstimmende IHC 2+ Fälle zwischen CISH und FISH HER2 CISH (Neg)/FISH (Pos) CISH FISH IHC S-156-01 2,77 (1,00-5,00) 2,48 (0,50-5,00) 2+ S-173-01 3,67 (1,00-7,00) 2,34 (0,50-8,00) 2+ Prüfzentrum B (4, 7,14 %) 1 S-171 5,20 (2,00-8,00) 1,08 (0,50-2,00) 3+ S-156 5,00 (1,00-9,00) 2,23 (1,00-5,00) 3+ 1 S-178 20,00 (20,00-20,00) 1,25 (0,50-2,00) 0 S-183 4,13 (3,00-6,00) 2,73 (1,00-6,00) 0 % = Anzahl der nicht übereinstimmenden Fälle, dividiert durch die Gesamtzahl der Fälle mit gültigen FISH- und CISH-Werten vom entsprechenden Prüfzentrum 100 % C. HercepTest 2+ Fälle Alle aufeinander folgenden und Zusatzfälle wurden mit dem HercepTest getestet. Fälle, die HercepTest 2+ Scores ergaben, wurden kombiniert und an beiden Prüfzentren getestet. Die Ergebnisse an jedem Prüfzentrum zeigten, dass das SPOT-Light HER2 CISH-Kit Ergebnisse erbrachte, die mit dem PathVysion HER2-Test übereinstimmten. Die Korrelationsergebnisse sind in Tabelle 8 und 9 zusammengefasst. Tabelle 8: Übereinstimmung zwischen CISH und FISH bei HercepTest 2+ Fällen in Prüfzentrum A CISH-Ergebnisse FISH-Ergebnisse Amplifiziert Nicht-amplifiziert Gesamt Amplifiziert 3 0 3 Nicht-amplifiziert 4 27 31 Gesamt 7 27 34 Es wurden 2 Fälle entweder mit fehlenden oder ungültigen FISH- oder CISH-Testergebnissen berichtet und aus der Tabelle ausgeschlossen. Positive Übereinstimmung = 3/7 = 42,9 % (95 % KI: 9,9 %, 81,6 %) Negative Übereinstimmung = 27/27 = 100,0 % (95 % KI: 87,2 %, 100,0 %) Gesamtprozent Übereinstimmung = (3+27)/34 = 88,2 % (95 % KI: 72,6 %, 96,7 %) Tabelle 9: Übereinstimmung zwischen CISH und FISH auf HercepTest 2+ Fällen am Prüfzentrum B CISH-Ergebnisse FISH-Ergebnisse Amplifiziert Nicht-amplifiziert Gesamt Amplifiziert 4 1 5 Nicht-amplifiziert 1 35 36 Gesamt 5 36 41 Es wurden 2 Fälle entweder mit fehlenden oder ungültigen FISH- oder CISH-Testergebnissen berichtet und aus der Tabelle ausgeschlossen. Positive Übereinstimmung = 4,5 = 80,0 % (95 % KI: 28,4 %, 99,5 %) Negative Übereinstimmung = 35/36 = 97,2 % (95 % KI: 85,5 %, 99,9 %) Gesamtprozent Übereinstimmung = (4+35)/41 = 95,1 % (95 % KI: 83,5 %, 99,4 %) HER2 CISH (Pos)/FISH (Neg) CISH FISH IHC Fallnummer Prüfzentrum A (2, 3,70 %) 1 Fallnummer Tabelle 10: Nicht übereinstimmende HercepTest 2+ Fälle zwischen CISH und FISH HER2 CISH (Pos)/FISH (Neg) HER2 CISH (Neg)/FISH (Pos) CISH FISH IHC Fall- CISH FISH IHC nummer Prüfzentrum A (4, 11,76 %) 1 A-095-01 4,07 (1,00-10,00) 2,81 (1,67-5,00) 2+ B-008-08 1,77 (1,00-4,00) 2,45 (1,00-5,00) 2+ S-156-01 2,77 (1,00-5,00) 2,48 (0,50-5,00) 2+ S-173-01 3,67 (1,00-7,00) 2,34 (0,50-8,00) 2+ Prüfzentrum B (2; 4,88 %) 1 A-023 5,20 (2,00-8,00) 1,49 (0,67-3,50) 2+ B-008 2,77 (2,00-4,00) 2,65 (1,00-6,00) 2+ 1 % = Anzahl der nicht übereinstimmenden Fälle, dividiert durch die Gesamtzahl der Fälle mit gültigen FISH- und CISH-Werten vom entsprechenden Prüfzentrum 100 % PI84-0150 Version 0.0 Seite 17 von 27

D. Polysomie-Fälle In zwei Prüfzentren wurden die Polysomie-Fälle basierend auf den klinischen Praktiken der jeweiligen Institution evaluiert. In Prüfzentrum A war Polysomie von Chromosom 17 definiert als das Vorhandensein von 3 CEP17-Signalen bei mindestens 10 % der Tumorzellen, wohingegen in Prüfzentrum B das Vorhandensein von 3 CEP17-Signalen bei mindestens 30 % der Tumorellen als Kriterium diente. Die Häufigkeit von Tumoren mit Polysomie des Chromosoms 17 lag in Prüfzentrum A bei 18,68 % und bei Prüfzentrum B bei 7,91 %. Die Detektionsrate von Polysomie auf dem gleichen Tumorset war aufgrund des Unterschieds der Definition von Polysomie zwischen den Prüfzentren signifikant unterschiedlich. Die an jedem Prüfzentrum unabhängig erreichte Übereinstimmungsebene ergab, dass das SPOT-Light HER2 CISH-Kit Ergebnisse erbrachte, die mit dem PathVysion HER2-Test übereinstimmten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 und 12 zusammengefasst. Tabelle 11: Übereinstimmung zwischen CISH und FISH bei Polysomie-Fällen in Prüfzentrum A CISH-Ergebnisse FISH-Ergebnisse Amplifiziert Nicht-amplifiziert Gesamt Amplifiziert 12 0 12 Nicht-amplifiziert 2 34 36 Gesamt 14 34 48 Es wurden 3 Fälle entweder mit fehlenden oder ungültigen FISH- oder CISH-Testergebnissen berichtet und aus der Tabelle ausgeschlossen. Positive Übereinstimmung = 12/14 = 85,7 % (95 % KI: 57,2 %, 98,2 %) Negative Übereinstimmung = 34/34 = 100,0 % (95 % KI: 89,7 %, 100,0 %) Gesamtprozent Übereinstimmung = (12+34)/48 = 95,8 % (95 % KI: 85,8 %, 99,5 %) Tabelle 12: Übereinstimmung zwischen CISH und FISH auf Polysomie-Fälle am Prüfzentrum B CISH-Ergebnisse FISH-Ergebnisse Amplifiziert Nicht-amplifiziert Gesamt Amplifiziert 12 1 13 Nicht-amplifiziert 0 9 9 Gesamt 12 10 22 Es wurden 0 Fälle entweder mit fehlenden oder ungültigen FISH- oder CISH-Testergebnissen berichtet und aus der Tabelle ausgeschlossen. Positive Übereinstimmung = 12/12 = 100,0 % (95 % KI: 73,5 %, 100,0 %) Negative Übereinstimmung = 9/10 = 90,0 % (95 % KI: 55,5 %, 99,8 %) Gesamtprozent Übereinstimmung = (12+9)/22 = 95,5 % (95 % KI: 77,2 %, 99,9 %) Fallnummer Tabelle 13: Nicht übereinstimmende Polysomie-Fälle zwischen CISH und FISH HER2 CISH (Pos)/FISH (Neg) HER2 CISH (Neg)/FISH (Pos) CISH FISH IHC Fallnummer CISH FISH IHC Prüfzentrum A (2, 4,17 %) 1 A-095-01 4,07 (1,00-10,00) 2,81 (1,67-5,00) 2+ S-156-01 2,77 (1,00-5,00) 2,48 (0,50-5,00) 2+ Prüfzentrum B (1, 4,55 %) 1 A-023 5,20 (2,00-8,00) 1,49 (0,67-3,50) 2+ 1 % = Anzahl der nicht übereinstimmenden Fälle, dividiert durch die Gesamtzahl der Fälle mit gültigen FISH- und CISH- Werten vom entsprechenden Prüfzentrum 100 % PI84-0150 Version 0.0 Seite 18 von 27

E. Zusammenfassung der Vergleichsergebnisse zwischen dem SPOT-Light HER2 CISH-Kit und dem PathVysion HER2-DNA-Sondenkit Tabelle 14: Zusammenfassung des SPOT-Light HER2 CISH-Kits und des PathVysion HER2- DNA-Sondenkits Art der Fälle Aufeinander folgende Fälle Ergänzende Fälle Zweifelhafte Fälle Polysomie-Fälle Prüfzentrum A Prüfzentrum B Prüfzentrum A Prüfzentrum B Prüfzentrum A Prüfzentrum B Anzahl von Proben Positive % Übereinstimmung Negative % Übereinstimmung Gesamte % Übereinstimmung 205 54 56 34 41 48 22 94,4 % 75,0 % 77,8 % 42,9 % 80,0 % 85,7 % 100,0 % 100,0 % 100,0 % 95,7 % 100,0 % 97,2 % 100,0 % 90,0 % 99,0 % 96,3 % 92,9 % 88,2 % 95,1 % 95,8 % 95,5 % Analytische Sensitivität Die Empfindlichkeit des SPOT-Light HER2 CISH-Kits wurde mithilfe von FFPE-Brustkrebsgewebeschnitten mit nicht-amplifiziertem und amplifiziertem HER2-Status sowie mit den FFPE-Zelllinien in den Kontroll-Objektträgern getestet. Das HER2-Gen wurde als ein einziger Punkt auf dem Gewebeschnitt und dem Zellblockschnitt mit normalem HER2-Gen erkannt. jede amplifizierte und nicht-amplifizierte Probe zeigte 3+ Intensitätsfärbung und gute Gewebemorphologie. Hybridisierungseffizienz Die Hybridisierungseffizienz wurde festgelegt, indem zwei Gewebeproben (1 amplifiziert, 1 nicht-amplifiziert, je 10 Schnitte) und 4 Zelllinien-Proben (2 amplifiziert, 2 nicht-amplifiziert) getestet wurden. Jede Probe wurde hinsichtlich der Anzahl von Zellen mit HER2-Signalen unter der Gesamtanzahl der analysierten Zellen (100-300 Zellen) analysiert. Die Hybridisierungseffizienz wurde mit 94,7-100 % festgelegt. Hinsichtlich der CISH-Färbung auf 226 klinischen Proben aus 3 Labors lag die Versagensrate an jedem Prüfzentrum bei 8,4 % (19), 1,3 % (3) und 0,9 % (2). (28) Analytische Spezifität Zur Festlegung der Spezifität wurden Metaphase-Studien an zytogenetisch präparierten Objektträgern, PCR mit einem HER2-genspezifischen Primerpaar auf der HER2-DNA-Sonde und DNA-Sequenzierung für beide Enden des in der HER2-DNA-Sonde verwendeten BAC-Klons durchgeführt. Die SPOT-Light CISH HER2-Sonde bindet sich nachweislich speziell an den HER2-Genlokus auf Chromosom- Band 17q11.2-21. Die Chromosomlokalisierung wurde durch Metaphasen-FISH bei normalen Lymphozyten festgelegt; PCR-Tests zeigten das gewünschte DNA-Band, und DNA-Sequenzierung zeigte die korrekte Chromosomenlokalisierung und Deckung des HER2-Gens. Verfahrensgrenzen Das SPOT-Light HER2 CISH-Verfahren wurde mit den Extremen der folgenden Parameter getestet: Gewebedicke, Vorbehandlung, Denaturierung, Hybridisierung, Stringent Wash, Immundetektion und Gegenfärbung. Unter den folgenden Bedingungen wurden keine signifikanten Unterschiede in den CISH-Ergebnissen beobachtet: PI84-0150 Version 0.0 Seite 19 von 27

Tabelle 15: Verfahrensgrenzen Akzeptable Bereiche der Testparameter Gewebedicke 4-6 µm Hitzevorbehandlung 99-100 C 10-20 min Enzymverdau 4-14 min Denaturierung PCR-Thermozykliergerät 93-98 C 2-8 min Hybridisierung 30-39 C 10-18 h Stringent Wash 60-78 C 2-8 min Immundetektion HRP-Polymerkonjugat 25v60 min DAB-Chromogen 15-60 min Gegenfärbung 3-30 sek Reproduzierbarkeit Drei separate Chargen des SPOT-Light HER2 CISH-Kits wurden an 3 Brustkrebsgewebeproben und 4 Zelllinien- Proben getestet, mit verschiedenen HER2-Genebenen. Zwischen den 3 getesteten Chargen bestanden keine Unterschiede hinsichtlich der Testleistung. Reproduzierbarkeit innerhalb von Durchläufen (Tag-zu-Tag) In der Studie wurden die CISH-Reproduzierbarkeit innerhalb von Durchläufen an drei verschiedenen Tagen mit Brustkrebsproben mit drei HER2-Statustypen mit jeweils 3 Proben für jeden Typ getestet. Die Zusammenfassung lautet folgendermaßen: Tabelle 16: Reproduzierbarkeit innerhalb von Durchläufen (Tag-zu-Tag) Genkopie N Nicht-amplifiziert Nicht-amplifiziert, Amplifiziert Polysomie Durchschnitt N = 9 1,79 3,45 20,22 Std. Abw. 9 0,05 0,12 1,72 CV 9 3 % 4 % 8 % Beobachterstudie Drei Pathologen wurden in der Auswertung von Objektträgern geschult, die mit dem SPOT-Light HER2 CISH-Kit präpariert und gefärbt wurden. Um die Fertigkeit zu validieren, erhielt jeder Pathologe acht von Invitrogen zur Verfügung gestellte vorgefärbte Objektträger (6 nicht-amplifizierte und 2 amplifizierte). Für beide Fälle (amplifiziert und nicht-amplifiziert) wurden alle Proben richtig interpretiert (100 %). PI84-0150 Version 0.0 Seite 20 von 27

CISH-Signal, mittlere HER2 CISH Punkte/Zelle und HER2- Genstatus Objektträger-Nr. Beobachter 1 Beobachter 2 Beobachter 3 Objektträger- ID 1 Probe 1 () Tabelle 17: Reproduzierbarkeit zwischen Beobachtern 2 Punkte 1-5 Punkte 1-2 2 Probe 2 (AM) 3 Probe 3 () Großer Cluster + mehrere Punkte AM 2-5 Großer Cluster + Punkte AM 1-5 >10 AM 3-5 4 Probe 4 () 2-4 2,8 3-5 5 Probe 5 () 2 1-5 1-2 6 Probe 6 () 2-5 1-5 4 7 Probe 7 (AM) Großer Cluster + mehrere Punkte AM Großer Cluster AM Großer Cluster + mehrere Punkte AM 8 Probe 8 () 2-5 3,4 4,3 Reproduzierbarkeit zwischen Prüfzentren Die Studie zur Reproduzierbarkeit zwischen Prüfzentren basierte auf 226 aufeinander folgenden Fällen, die an drei Prüfzentren wiederholt wurden. Die gesamten Übereinstimmungsprozentsätze für die CISH-Reproduzierbarkeit unter Verwendung von >5 als Grenzwert für positive Ergebnisse betrugen 99,0 %, 98,6 % und 98,1 %, was auf eine starke Reproduzierbarkeit der Tests mit dem SPOT-Light HER2 CISH-Kit hinweist. Tabelle 18: CISH-Reproduzierbarkeit für alle aufeinander folgenden Fälle Untersucht von Prüfzentrum A und B Prüfzentrum A Prüfzentrum B: CISH-Ergebnisse CISH-Ergebnisse Amplifiziert Nicht-amplifiziert Gesamt Amplifiziert 34 0 34 Nicht-amplifiziert 2 170 172 Gesamt 36 170 206 Es wurden 20 Fälle entweder mit fehlenden oder ungültigen CISH-Testergebnissen berichtet und aus der Tabelle ausgeschlossen. Gesamtprozent Übereinstimmung = (34+170)/206 99,0 % (95 % KI: 96,5 %, 99,9 %) PI84-0150 Version 0.0 Seite 21 von 27

Tabelle 19: CISH-Reproduzierbarkeit für alle aufeinander folgenden Fälle Untersucht von Prüfzentrum C und B Prüfzentrum C Prüfzentrum B: CISH-Ergebnisse CISH-Ergebnisse Amplifiziert Nicht-amplifiziert Gesamt Amplifiziert 35 0 35 Nicht-amplifiziert 3 184 187 Gesamt 38 184 222 Es wurden 4 Fälle entweder mit fehlenden oder ungültigen CISH-Testergebnissen berichtet und aus der Tabelle ausgeschlossen. Gesamtprozent Übereinstimmung = (35+184)/222 98,6 % (95 % KI: 96,1 %, 99,7 %) Tabelle 20: CISH-Reproduzierbarkeit für alle aufeinander folgenden Fälle Untersucht von Prüfzentrum C und A Prüfzentrum C Prüfzentrum A: CISH-Ergebnisse CISH-Ergebnisse Amplifiziert Nicht-amplifiziert Gesamt Amplifiziert 32 1 33 Nicht-amplifiziert 3 171 174 Gesamt 35 172 207 Es wurden 19 Fälle entweder mit fehlenden oder ungültigen CISH-Testergebnissen berichtet und aus der Tabelle ausgeschlossen. Gesamtprozent Übereinstimmung = (32+171)/207 98,1 % (95 % KI: 95,1 %, 99,5 %) Wiederholbarkeits- und Reproduzierbarkeitsstudien mit aufeinander folgenden Gewebeschnitten und verschiedener Gewebedicke Die Wiederholbarkeits- und Reproduzierbarkeitsstudien wurden zur Evaluierung der Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse des SPOT-Light HER2 CISH -Kits beim Test von aufeinander folgenden nicht-amplifizierten und amplifizerten Brustkrebsgewebeproben verschiedener Gewebedicke durchgeführt. Die zur Evaluierung verwendeten Proben umfassten Objektträger von drei Brustkrebsgewebeblöcken: HER2-Nicht- Amplifikation (normal), grenzwertige HER2-Amplifikation und HER2-Amplifikation (hoch). Zehn Proben pro Block von aufeinander folgenden Schnitten von 4 µm Dicke wurden Standardverfahren (Kontrollzustand) gemäß verarbeitet und getestet und die Proben mit verschiedener Dicke (Bereich 2-8 µm) aus jedem Block wurden gemäß den Standardverfahren in zweifacher Ausfertigung auf ähnliche Weise verarbeitet und getestet. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle 21-23 angegeben. PI84-0150 Version 0.0 Seite 22 von 27

Mittlere HER2 CISH- Punkte/Zellkern Mittlere HER2 CISH- Punkte/Zellkern Tabelle 21. Mittlere HER2 CISH-Punkte pro Zelle in aufeinander folgenden Schnitten bei 4 µm (Brustkrebs mit normalem HER2) Schnittnummer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1,8 2,0 1,9 2,0 1,6 1,7 1,7 1,6 1,7 2,0 Mittleres HER2 1,8 STD 0,16 % CV 8,9 Tabelle 22. Mittlere HER2 CISH-Punkte pro Zelle in aufeinander folgenden Schnitten bei 4 µm (Brustkrebs mit grenzwertiger Amplifikation von HER2) Schnittnummer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 5,4 5,5 5,3 5,8 5,2 6,2 5,7 5,4 5,5 5,8 Mittlerer HER2 5,6 STD 0,30 % CV 5,4 Tabelle 23. Mittlere HER2 CISH-Punkte pro Zelle in aufeinander folgenden Schnitten bei 4 µm (Brustkrebs mit amplifiziertem HER2) Mittlere HER2 CISH- Punkte/Zellkern Schnittnummer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BC BC BC BC BC BC BC BC BC BC Störungsbeseitigung Problem Mögliche Ursache Empfohlene Maßnahme Schwaches oder kein Signal 1. Die Anweisungen zur Vorbehandlung wurden nicht befolgt. 1. Sicherstellen, dass die richtigen Vorbehandlungsbedingungen verwendet wurden. Siehe Verfahren. a) Inkorrekte Hitzevorbehandlungsbedingungen (Inkubationszeit oder Temperatur) b) Inkorrekte Enzymvorbehandlungsbedingungen (Zeit oder Temperatur) c) Gewebeschnitte zu dick 2. Inkorrekte Denaturierungsbedingungen a) Sicherstellen, dass die richtigen Hitzevorbehandlungsbedingungen verwendet wurden: 15 Minuten bei 98-102 ºC. b) Sicherstellen, dass die richtigen Enzymvorbehandlungsbedingungen verwendet wurden (5 min empfohlen, Bereich von 2-20 min). Sicherstellen, dass das Enzym vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur (15-30 C) gebracht wurde. c) Je nach Gewebedicke (4-6 µm) und Fixierungsbedingungen muss die optimale Inkubationszeit für die Enzymvorbehandlung evtl. verkürzt oder verlängert werden. 2. Sicherstellen, dass die richtigen Denaturierungsbedingungen verwendet wurden. Siehe Verfahren. a) Inkorrekte Denaturierungstemperatur a) Sicherstellen, dass die Denaturierungstemperatur für das PCR- Thermozykliergerät 95 C (Bereich von 95-98 C) und den Heizblock 90 C PI84-0150 Version 0.0 Seite 23 von 27

(Bereich von 85-90 C) beträgt Schlechte Gewebemorphologie Hintergrundfärbung b) Inkorrekte Denaturierungszeit 3. Inkorrekte Stringent Wash-Bedingungen a) Inkorrekte Stringent Wash-Temperatur (mehr als 80 ºC) b) Inkorrekte Stringent Wash- Inkubationszeit 4. Übermäßig hohe Temperatur während der Lagerung oder dem Transport 1. Inkorrekte Hitzevorbehandlungsbedingungen (Zeit oder Temperatur) 2. Inkorrekte Enzymvorbehandlungsbedingungen (Zeit oder Temperatur) 3. Inkorrekte Denaturierungsbedingungen (Zeit oder Temperatur) 4. Deckglasentfernung hat zu einer Beschädigung des Gewebes geführt 5. Gewebe ist während des CISH-Verfahrens ausgetrocknet 6. Inkorrekte Gewebedicke 7. Inkorrekte Fixierungszeit 8. Inkorrektes Fixiermittel 1. Inkorrekte Stringent Wash-Temperatur (<70 ºC) 2. Übermäßige Inkubation mit DAB b) Sicherstellen, dass die Denaturierungszeit für das CR- Thermozykliergerät 5 min beträgt. 3. Sicherstellen, dass die richtigen Stringent Wash-Bedingungen verwendet wurden. Siehe Verfahren. a) Sicherstellen, dass die Stringent Wash- Temperatur 70 ºC beträgt. Zur Bestätigung der Temperatur wird ein kalibriertes Thermometer empfohlen. b) Die richtige Stringent Wash- Inkubationszeit sicherstellen (5 min) 4. Die Lagerbedingungen überprüfen. Das SPOT- Light HER2 CISH-Kit sollte bei Temperaturen von 2-8 C gelagert werden. Das Reagenz J bei Raumtemperatur (15-30 ºC) lagern. 1. Sicherstellen, dass die richtigen Hitzevorbehandlungsbedingungen verwendet wurden. 2. Sicherstellen, dass die richtigen Enzymverdaubedingungen verwendet wurden. Für die meisten Brustkrebsgewebe sind 5 min bei Raumtemperatur (15-30 ºC) optimal. Je nach Gewebedicke und Fixierungszeit muss die optimale Verdau-Inkubationszeit evtl. verlängert oder verkürzt werden. 3. Sicherstellen, dass die richtigen Denaturierungsbedingungen verwendet wurden. Siehe Verfahren. 4. Nicht auf das Deckglas drücken. Die Objektträger für 2-3 min oder bis das Deckglas leicht heruntergleitet in SSC-Puffer mit Raumtemperatur (15-30 ºC) einweichen. 5. Wenn nicht anders angegeben, das Gewebe zu keiner Zeit während des CISH-Verfahrens austrocknen lassen. 6. Sicherstellen, dass das Gewebe 4-6 µm dick ist. 7. Sicherstellen, dass das Gewebe für 6-48 Stunden fixiert wird. 8. Sicherstellen, dass das Gewebe in 10 % neutralgepuffertem Formalin fixiert wird. 1. Korrekte Stringent Wash-Temperatur sicherstellen (70 C). 2. Sicherstellen, dass die korrekte DAB- Inkubationszeit 30 min bei Raumtemperatur (15-30 ºC) beträgt. Signale ersichtlich, aber schwer zu erkennen 3. Inkorrektes Reagenz als Waschpuffer verwendet 3. Während der Immundetektionsschritte muss Waschpuffer (Reagenz E1 + E2) verwendet werden. 1. Übermäßige Gegenfärbung mit Hämatoxylin 1. Sicherstellen, dass das Gewebe für 3-5 Sekunden gegengefärbt wird. Bei Ungewissheit hinsichtlich der optimalen Färbezeit das Gewebe für 3 sek färben und dann für 2 min unter laufendem Leitungswasser waschen. Das PI84-0150 Version 0.0 Seite 24 von 27

Bereiche ohne Signale 1. Luftbläschenbildung unter dem Deckglas nach Zugabe der Sonde 2. Unzureichendes Sondenvolumen für die Gewebegröße gegengefärbte Gewebe unter dem Mikroskop prüfen. Wenn es immer noch zu hell ist, für weitere 3-5 sek färben, bevor das Deckglas aufgelegt wird. 1. Sicherstellen, dass sich bei der Zugabe der Sonde und dem Auflegen des Deckglases keine Luftbläschen bilden. 2. Für Gewebe, dass mit einem 22 x 22 mm großen Deckglas angemessen abgedeckt ist ~15 µl hinzugeben. Bei größeren Gewebeproben könnte ein größeres Deckglas und mehr Sonde erforderlich sein (20 µl probe für Gewebe mit einem 24 x 30 mm großen Deckglas verwenden.) HINWEIS: Ist das Problem oben nicht aufgeführt oder es kann mit den vorgeschlagenen Maßnahmen nicht behoben werden, wenden Sie sich bitte an den Technischen Kundendienst unter +1-800-955-6288 (nur USA) oder per E-Mail an techsupport@invitrogen.com. PI84-0150 Version 0.0 Seite 25 von 27

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Invitrogen Corporation 542 Flynn Road Camarillo CA 93012 USA +1-800-955-6288 Bei technischen Fragen wenden Sie sich per E-Mail an: techsupport@invitrogen.com Bei allgemeinen Informationen zum SPOT-Light HER2 CISH-Kit wenden Sie sich per E-Mail an her2cish@invitrogen.com URL: www.invitrogen.com/her2cish Erklärung der Symbole Katalognummer Temperaturbeschränkung Inhalt ausreichend für <n> Tests Verwendbar bis Lesen Sie die Gebrauchsanweisung Chargennummer Hersteller Autorisierte EU-Vertretung In-vitro-Diagnostikum Die Begleitdokumente konsultieren für IVDD 98/79/EG: Invitrogen Ltd., Inchinnan Business Park, 3 Fountain Drive, Paisley, PA4 9RF, GB Copyright Invitrogen Corporation. 16. Juli 2008 PI84-0150 Version 0.0 Seite 27 von 27

Anhang A: Richtlinien zur Interpretation des HER2 CISH-Tests HER2-Genamplifikation Amplifikation Hohe Amplifikation: >10 Punkte, oder große Cluster, oder eine Mischung aus mehreren Punkten und großen Clustern des HER2- Gens pro Zellkern bei >50 % der Krebszellen. Siehe Abbildung A, B und C. Ein großer Cluster ist eine unregelmäßig geformte Gruppe von A. Große Cluster. B. Mehrere Punkte (>10 Punkte). Signalen mit einem mehr als 5 Mal größeren Durchmesser als ein einzelner Punkt. Ein einzelner Punkt aus den Krebs- oder normalen Epithelzellen vom gleichen Objektträger muss als Referenz herangezogen werden. Siehe Abbildung A. Geringe Amplifikation: >5 Punkte bis 10 Punkte, oder kleine Cluster, oder eine Mischung als mehreren Punkten und kleinen Clustern des HER2-Gens pro Zellkern bei >50 % der Krebszellen. Siehe Abbildung D und E. C. Große Cluster und mehrere Punkte. D. >5 bis 10 Punkte. Ein kleiner Cluster ist eine unregelmäßig geformte Gruppe von Signalen mit einem 3-5 Mal größeren Durchmesser als ein einzelner Punkt. Ein einzelner Punkt aus den Krebs- oder normalen Epithelzellen vom gleichen Objektträger muss als Referenz herangezogen werden. Siehe Abbildung E. E. Kleine Cluster.

Nicht-Amplifikation des HER2-Gens Nicht-Amplifikation Polysomie: Vorhandensein von 3-5 Punkten des HER2-Gens pro Zellkern bei >50 % der Krebszellen. Siehe Abbildung F. Ein einzelner Punkt hat bei normalen oder Krebszellen eine glatte, gerundete Kante. Siehe Abbildung F. F. Polysomie: 3-5 Punkte. G. Diploid: 1-2 Punkte. Diploidie: Vorhandensein von 1-2 Punkten des HER2-Gens pro Zellkern bei >50 % der Krebszellen. Siehe Abbildung G. Ein einzelner Punkt hat bei normalen oder Krebszellen eine glatte, gerundete Kante. Siehe Abbildung G. Duplett Wenn zwei Signale um weiniger als den Durchmesser eines einzelnen Signals voneinander getrennt sind, sollten diese Signale als ein Punkt gezählt werden. Dupletts erscheinen als Paar und stellen keine wahren kleinen Cluster dar. Siehe Abbildung H. H. Duplett = 1 Punkt. Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Dr. Adrienne Morey. www.invitrogen.com 2008 Invitrogen Corporation. Alle Rechte vorbehalten. Für dieses Produkt können eine oder mehrere Lizenzen für beschränkte Warenzeichenbenutzung gelten (siehe Invitrogen Katalog oder www.invitrogen. com). Mit dem Gebrauch dieses Produkts akzeptieren Sie die Bedingungen aller zutreffenden Lizenzen für beschränkte Warenzeichenbenutzung. Wenn nicht anders angegeben nicht für den therapeutischen oder diagnostischen Gebrauch bei Tieren oder Menschen vorgesehen. O-079226-r1 0808

Anhang B: HER2 CISH-Scoring-Blatt SPOT-Light HER2 CISH-Kit, Kat. Nr. 84-0150 Färbelauf-Protokoll-ID: SPOT-Light HER2 CISH-Kit (84-0150) Charge: Proben-ID: CISH-Ergebnisse (Die Anzahl von HER2-Signalen für jede evaluierte Zelle berichten): Diagramm 1. CISH-Ergebnisse Zell-Nr. HER2 Punkte oder Cluster Zell-Nr. HER2 Punkte oder Cluster Zell-Nr. HER2 Punkte oder Cluster 1 11 21 2 12 22 3 13 23 4 14 24 5 15 25 6 16 26 7 17 27 8 18 28 9 19 29 10 20 30 Hinweis: Für Cluster bitte die beste Schätzung der Punkte/Genkopien angeben (kleiner Cluster = 5 Punkte, großer Cluster = 10 Punkte). Summe der Punkte in 30 Zellen Durchschnittliche Punkte in 30 Zellen Liegt der Mittelwert zwischen 4 und 6 Punkten, die Punkte in weiteren 30 Zellen für insgesamt 60 Zellen zählen und die Ergebnisse in Diagramm 2 eintragen. Liegt der Mittelwert bei <4 oder >6, müssen keine weiteren 30 Zellen gezählt werden und die Probe kann als Amplifikation oder nicht-amplifikation eingetragen werden. CISH-Scoring Invitrogen HER2 CISH-Scoring-Richtlinien Nicht-Amplifikation: 1-5 Signale/Zellkern in Tumorzellen Amplifikation: >5 Signale/Zellkern oder Cluster von amplifizierten Signalen/Zellkern bei >50 % der Tumorzellen Ergebnis: Nicht-Amplifikation ( 5) Amplifikation (>5) Unterschrift des Technikers und Datum: Unterschrift des Pathologen und Datum:

Diagramm 2 (CISH-Ergebnisse). Falls erforderlich die Anzahl Punkte im zweiten Satz von 30 Zellen eingeben: Zell-Nr. HER2 Punkte oder Cluster Zell-Nr. HER2 Punkte oder Cluster Zell-Nr. HER2 Punkte oder Cluster 1 11 21 2 12 22 3 13 23 4 14 24 5 15 25 6 16 26 7 17 27 8 18 28 9 19 29 10 20 30 Summer der Punkte in Zelle 31-60 Summer der Punkte in Zelle 1-30 Durchschnittliche Punkte in 60 Zellen CISH-Scoring Invitrogen HER2 CISH-Scoring-Richtlinien Nicht-Amplifikation: 1-5 Signale/Zellkern in Tumorzellen Amplifikation: >5 Signale/Zellkern oder Cluster von amplifizierten Signalen/Zellkern bei >50 % der Tumorzellen Ergebnis: Nicht-Amplifikation ( 5) Amplifikation (>5) Unterschrift des Technikers und Datum: Unterschrift des Pathologen und Datum: www.invitrogen.com 2008 Invitrogen Corporation. Alle Rechte vorbehalten. Für dieses Produkt können eine oder mehrere Lizenzen für beschränkte Warenzeichenbenutzung gelten (siehe Invitrogen Katalog oder www.invitrogen. com). Mit dem Gebrauch dieses Produkts akzeptieren Sie die Bedingungen aller zutreffenden Lizenzen für beschränkte Warenzeichenbenutzung. Wenn nicht anders angegeben nicht für den therapeutischen oder diagnostischen Gebrauch bei Tieren oder Menschen vorgesehen. O-079226-r1 0808