Eukaryontische Gen Expression Voet Kapitel 34 Expression of Ube3a in the Head of a 15.5 day mouse fetus 1. Chromosomen Struktur 2. Genomische Organisation 3. Kontrolle der Genexpression
1. Chromosomenstruktur U. Albrecht A. Histone B. Nucleosomen: erste Stufe der Chromatinorganisation C. 30nm Filamente: zweite Stufe der Chromatinorganisation D. Radiale Loops: dritte Stufe der Chromatinorganisation E. Polytene Chromosomen Eukaryonten vs Prokaryonten Unterschied: Page 1423 Eukaryontische Zelle hat Nukleäre Membran -> Chromosomen vom Zytoplasma separiert -> eukaryontischer Transkriptionsprozess separiert von Trnaslation.
U. Albrecht Eukaryontische Chromosomen -> Dynamische Struktur (ändert sich im Zellzyklus Chromatin = DNA, RNA, Protein Komplex Euchromatin: weniger dicht gepackt -> wird exprimiert Heterochromatin: dichter gepackt -> wird nicht exprimiert Chromosomale DNA -> Verpackungsverhältnis = Verhältnis der Konturlänge zu Verhältnis des Kontainers. 1 Chromosom -> 1.5 bis 8 cm Länge in Metaphase -> 1.3 bis 10 µm Länge Wie kann ein so hoher Verpackungsgrad erreicht werden? Electron micrograph of a human metaphase chromosome.höchst kondensiert
Im Zellkern gibt es zwei Arten von Chromatin Interphase-Zellkern Heterochromatin Euchromatin Nucleolus
Sie unterscheiden sich in der Art der Verpackung Euchromatin Interphase Heterochromatin Mitose
A. Histones U. Albrecht Die Proteinkomponente des Chromatins welche etwas mehr als die Hälfte der Masse ausmacht, sind sogenannte Histone. 5 Klassen von Histonen: alle grossen Anteil an positiv geladenen Aminosäuren (Arg and Lys) -> binden negativ geladenen Phosphat-Rückgrat der DNA. Calf Thymus Histones
a. Histone sind evolutionär konserviert U. Albrecht Histon H4 von Kühen und Bohnen sind konserviert (nur 2 Aenderungen!) Val -> Ile, Lys -> Arg = konservative Aenderungen Page 1424 Evolutionäre Stabilität -> Kritische Funtion der Histone Histon H1 weniger konserviert -> spezielle Funktion (siehe später).
b. Histone können modifiziert werden unterstrichene AS werden modifiziert. Dies für alle Histone -> methylierung, acetylierung, phosphorylierung -> Abseken der positiven Ladung -> Veränderung der Interaktion mit DNA Grad der Modifizierung variiert mit Spezies, Gewebe und Zellzyklus. Ubiquitinierung moduliert eukaryontische Genexpression. Histon H5 = H1 Variante in Vogel erythorcyten (haben im Gegesatz zu Säuger Erythorcyten einen Zellkern).
B. Nukleosomen: erste Stufe der Chromatinorganisation Page 1424 Perlenkette Electron micrograph of D. melanogaster chromatin showing that its 10-nm fibers are strings of closely spaced nucleosomes. U. Albrecht
Nucleosomen sind die kleinste Verpackungseinheit H2A H2B H2A H4 H2B H3 H3 H4 Die 30 nm Faser wird durch Kontakte der Histone stabilisiert H1
Page 1426 a. DNA windet sich um ein Histone Oktamer um den Nukleosom Kernpartikel zu bilden U. Albrecht X-Ray structure of the nucleosome core particle. (a) The entire core particle as viewed (left) along its superhelical axis and (right) rotated 90 about the vertical axis.
Page 1426 U. Albrecht X-Ray structure of the nucleosome core particle. (b) The top half of the nucleosome core particle as viewed in Part a, left, and identically colored.
b. Histone H1 schliesst das Nukleosom U. Albrecht Page 1427 Model of the interaction of histone H1 with the DNA of the 166-bp chromatosome.
Page 1428 U. Albrecht H1-containing chromatin H1-depleted chromatin
U. Albrecht c. Nukleosomen der Eltern werden während der DNA Replikation auf Tochterduplexe transferiert Väterliche und mütterliche Nukleosomen werden dabei nach dem Zufallsprinzip verteilt. Die Oktamere bleiben mit der DNA assoziiert während der Replikation. d. Zusammensetzen der Nukleosomen wird von Chaperonen assistiert Page 1428 Nukleoplasmin funktioniert als molekulares Chaperon um DNA und Histone auf eine kontrollierte Art und Weise zusammenzubringen. Dabei wird unspezifische Aggregation verhindert. Topoisomerase I ermöglicht dabei den geeigneten Supercoil in die DNA zu bringen damit sie gut um das Nukleosom gewunden wird.
U. Albrecht Page 1429 C. 30nm Filamente: zweite Stufe der Chromatinorganisation Electron micrograph of the 30-nm chromatin filaments.
U. Albrecht 6 Nucleosomen pro Undrehung mit Ganghöhe 110 Angsröm. Page 1430 Model of the 30-nm chromatin filament. The filament is represented (bottom to top) as it might form with increasing salt concentration.
D. Radiale Loops: dritte Stufe der Chromatinorganisation U. Albrecht Halo of DNA Page 1430 Electron micrographs of a histone-depleted metaphase human chromosome. (a) The central protein matrix (scaffold) serves to anchor the surrounding DNA.
Page 1430 U. Albrecht Electron micrographs of a histone-depleted metaphase human chromosome. (b) At higher magnification it can be seen that the DNA is attached to the scaffold in loops.
U. Albrecht Page 1431 Organization of DNA in a metaphase chromosome. (a) Electron micrograph of a human metaphase chromosome in cross section.
U. Albrecht How MARs structural domains interact and form Scaffold protein complex not known non histone proteins Matrix associated regions (MARs) Page 1431 Organization of DNA in a metaphase chromosome. (b) Diagram showing how the radial loops are thought to combine with the scaffold.
Uebersicht U. Albrecht
E. Polytene Chromosomen U. Albrecht replizierte DNA bleibt miteinander verbunden und zwar so dass identische DNA exakt nebeneinander zu lioegen kommt. In Speicheldrüse der Fruchtfliege beobachtet -> Cytologische Karte der Gene sichtbar. -> in situ hybridisierung bestätigt. Page 1432 Photomicrograph of the stained polytene chromosomes from the D. melanogaster salivary gland.
U. Albrecht mehr transkription als in dichten Regionen Page 1432 Electron micrograph of a segment of polytene chromosome from D. melanogaster.
U. Albrecht Page 1432 Autoradiograph of a D. melanogaster polytene chromosome that has been in situ hybridized with yolk protein cdna.
2. Genomische Organisation A. Das C- Wert Prardox B. Repetitive Sequenzen C. Verteilung von Genen D. Tandem Gen Cluster E. Gen Amplifikation F. Geclusterte Genfamilien: Hämoglobin Genorganisation G. Thalassämien: Genetische Fehlfunktion der Hämoglbin Synthese Verschiedene Zellen exprimieren verschiedene Gene, obwohl sie die gleiche genetische Information besitzen. -> Zellen haben grosse Flexibilität in der Genexpression. Kleiner Anteil des Genoms höherer Eukaryonten ist exprimiert. -> was mit unexprimierten Sequenzen?
A. Das C-Wert Paradox U. Albrecht Verhältnis von morphologischer Komplexität zu Menge von DNA in einem Organismus definiert den C-Wert. Erwartung: je höher Komplexität des Organismus desto mehr DNA Dem ist aber nicht so. Hat extra DNA eine Funktion? Wenn nein warum über Generationen erhalten geblieben? Page 1433 The range of haploid genome DNA contents in various categories of organisms indicating the C-value paradox.
U. Albrecht a. Cot Kurvenanalyse zeigt DNA Komplexität Die Rate mit welcher DNA renaturiert ist indikativ für die Länge ihrer einzgartigen Sequenzen. (Fragmentieren um mechanische Einflüsse zu erniedrigen). Cot1/2 = x / k x = Anzahl Basenpaare einer einzigartigen Sequenz k= Geschwindigkeitskonstante mit welcher Einzelstrang DNA miteinander in Lösung kollidiert. Page 1433 The reassociation (C 0 t) curves of duplex DNAs from the indicated sources.
b. Repetitive Sequenzen Variierender Grad von Komplexität -> komplexe Cot Kurve U. Albrecht Page 1435 C 0 t curve of a hypothetical DNA molecule.
komplexe Cot Kurve von Seeigel DNA U. Albrecht eukaryontische Cot Kurven: 1) inverted repeats 2) hoch repetitive Sequenzen 3) moderat repetitive Sequenzen 4) segment Duplikationen 5) einmalige Sequenzen Page 1435 The C 0 t curve of Strongylocentrotus purpuratus (a sea urchin) DNA.
a. inverted repeats bilden foldback Strukturen Page 1436 Foldback structures in DNA. (a) Single-stranded DNA containing an inverted repeat will, under renaturing conditions, form a base paired loop known as a foldback structure.
U. Albrecht Funktion von inverted repeats unbekannt. Vemutet wird dass sie in der Chromatinstruktur als eine Art molekularer Switch funktionieren könnten. Page 1436 Foldback structures in DNA. (b) An inverted repeat in duplex DNA could assume a cruciform conformation consisting of two opposing foldback structures.
b. Hochrepetitive DNA is häufig an Telomeren und Centromeren U. Albrecht Centromer Solche Sequenzen oft tausend mal wiederholt. Telomer simple sequence repeats= SSR s SSR s sind spezies spezifisch Wiederholungseinheit 1-13 nt -> microsatellites 14-500 nt -> minisatellites
Was gibt es noch außer Genen? 1) Elemente mit bekannter Funktion: Replikationsursprung Telomere Centromere Strukturelemente, wie z. B. SARS, den Ankern der DNA an das Strukturrückgrat aus Protein 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Bruchteil % des menschlichen Genoms
satelliten Banden Diese Sequenzen sind in Drosophila 11, 3.6 und 3.6 Millionen mal wiederholt. An Telomeren G-reiche SSR s Page 1436 The buoyant density pattern of Drosophila virilis DNA centrifuged to equilibrium in neutral CsCl.
U. Albrecht Centromer SSR s werden nicht transkribiert -> mögliche Funktion in der Anordunung von homologne Chromosomen in der Meiose und/oder um Rekombination zu erleichtern. Page 1437 Autoradiograph of mouse chromosomes showing the centromeric location of their SSR DNA through in situ hybridization. 3% des menschl. Genoms sind SSR s (CA und TA) Durch template slippage während DNA Replikation entstanden. -> hoher Grad and Längen variation in der Population -> längen Polymorphismen -> kann als genet. Marker benutzt werden.
c. Moderat repetitive DNA is in dispersed repeats angeordnet U. Albrecht Long interdespersed nulcear elements 6-8 kb long encode proteins that mediate their transposition. Pol II still transpositionally active Short interdespersed nuclear elements 100-400 bp elelments Pol. III promoter repeat cleaved by Alu derived from trna sequences Long terminal repeats flanked by gag and pol genes Page 1437
U. Albrecht d. Moderat repetitive DNA ist wahrscheinlich selfish DNA Wie jeder gute Parasit haben sich transposable elements (TE s) mit dem Wirt zusammen entwickelt. Zu viel Transposition tötet den Wirt Einige Transpositionen mögen einen selektiven Vorteil haben. TE s stimulieren grössere genetische Variation und schnellere Evolution. Deshalb haben TE s verschiedene Strategien entwickelt, welche zu selektiver ineffizienter oder mittelmässigen Tranposition führen. Dies ist eine mögliche Erklärung für das C-Wert paradox, da in verschiedenen Organismen wahrscheinlich die Transpositionseffizienz unterschiedlich ist und sich somit verschieden Mengen sogenannter junk DNA anhäufen.
Was gibt es noch außer Genen? 2) Elemente ohne bekannte Funktion: Konservierte, nicht kodierende Sequenzen Repetetive Sequenzen ( junk oder selfish ) Transposons, Überreste von Retroviren Einfache repetetive Sequenzen (e.g. CACACACACACA..) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 > 55 % % des menschlichen Genoms
C. Verteilung von Genen U. Albrecht Nur etwa 1.1 bis 1.4% des menschlichen Genoms sind exprimierte Sequenzen. Etwa 24% sind Introns und etwa 75% sind intragene Sequenzen (nichttranskribierte Sequenzen zwischen Genen). -> Schwierig Gene zu finden auch wenn man Sequenz kennt. Humanes Genom zudem sehr kurze Exons (150 nt) unterbrochen durch längere Introns (durchschnittlich 3500 nt). Expressed Sequence Tags (ESTs, cdna reverse transkribiert von mrna) helfen bei der Identifikation von Genen. CpG Inseln -> oft vor Gen -> kann auch als Marker gebraucht werden (mit Alu Sequenzen) Etwa 30 000 Gene im menschl. Genom (durchschnittlich 1 Gen pro 100kb, variiert aber von 0-64 Gene pro 100 kb). Page 1439 Density of structural features along the length of human chromosome 12.
Die genetische Information ist fragmentiert Die Gene liegen fragmentiert als Exons vor, die durch Introns getrennt werden Gen Exon Gespeicherte Information Exon Exon Intron Intron 1.5% Benutzte Information Introns Exons 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % des menschlichen Genoms
Proteincodierende Gene non coding RNA s trna, rrna, snrna, snorna, other RNA in protein complexes. Page 1439 Figure 34-27 Distribution of molecular functions of 26,383 putative structural genes in the human genome.
Die Introns verändern sich relativ schnell 100 Exon Exon Exon % identisch 90 80 70 60 Intron Intron Vergleich verwandter Gene zwischen Maus und Mensch Das Gen der Duchenne-Muskeldystrophie ist 2,4x10 6 groß (79 Exons), aber die mrna nur 14000 nt (3685 AS). Die Transkription dieses Gens dauert etwa 16 h.
D. Tandem Gene Clusters U. Albrecht Die meisten Genen kommen nur einmal im haploiden Genom vor. Allerdings gibt es für rrna und trna eine sehr grosse Nachfrage (80% aller RNA einer Zelle) -> Gene in mehreren Kopien die gliechzeitig abgelesen werden können. Einziges proteinkodierendes Gen in multiplen Kopien = Histone. Page 1440 The 18S, 5.8S, and 28S rrna genes are organized in tandem repeats in which sequences encoding the 45S rrna precursor are interspersed by untranscribed spacers.
Die verschiedenen RNA-Polymerasen Virale Polymerase (manchmal nur ein Protein) Eubakterielle Polymerase (4 Untereinheiten) Drei Polymerasen bei den Eukaryoten (sehr viele Untereinheiten) CTD ortholog Pol I Pol II Pol III rrna identisch mrna paralog trna
Die ribosomale RNA Funktion Hauptkomponenten der Ribosomen Struktur Sehr kompakt, wichtig für die Funktion Synthese Ort der Synthese: Nucleolus Ein großes Vorläufertranskript wird in die einzelnen rrna gespalten ~175-200 Gene
Der Nucleolus ist der Ort der rrna-synthese Nucleolus 2 µm Eine große Menge ist für die Zelle notwendig Sehr starke Transkription der Gene, die im Tandem angeordnet sind.
U. Albrecht Page 1440 nicht transkribierter Spacer Electron micrograph of tandem arrays of actively transcribing 18S, 5.8S, and 28S rrna genes from the nucleoli of the newt Notophthalmus viridescens.
Die Reifung von rrna aus dem 45S-Vorläufermolekül 45S rrna-vorläufer 5 3 Spaltung 18S rrna 5,8S rrna 28S rrna 5S rrna (250 Gene) Kleine Untereinheit des Ribosoms Große Untereinheit des Ribosoms
Die Biogenese der Ribosomen beginnt direkt an der 45S-Vorläufer-RNA
Die ribosomale RNA repräsentiert vom Gewicht her die meiste RNA-Menge groß 28S 100% 80% 18S 60% 40% 20% 5S, 5.8S klein 0% Auftrennung von Gesamt-RNA aus einer eukaryotischen Zelle durch Gelelektrophorese Ribosomale RNA 80% der Gesamt- RNA-Menge 2,5 x 10 6 Moleküle pro Zelle
Die Transfer-RNA haben eine definierte Struktur 5 3 Funktion Adaptermolekül während der Proteinsynthese Struktur Sehr auf sich selbst zurückgefaltet Synthese Kleine RNA-Transkripte von etwa 500 Genen, viele werden später noch modifiziert.
Weitere kleine RNA (teils PolII, teils PolIII) snrna Funktion Erfüllen verschiedene Funktionen (Spleißen, Telomere) Struktur Ebenfalls stark zurückgefaltet Synthese ~500 Gene unterschiedlicher Funktion
Die Transfer-RNA sind die häufigste RNA-Spezies groß 100% 80% 60% 40% 20% trna klein 0% Auftrennung von Gesamt-RNA aus einer eukaryotischen Zelle durch Gelelektrophorese Transfer-RNA 10-15% der Gesamt- RNA-Menge 2 x 10 7 Moleküle pro Zelle
Die Boten- RNA (mrna) 5 -nichtkodierende Region kodierende Region 3 -nichtkodierende Region 5 3 Protein Jede mrna kodiert für ein Protein
Die Boten- RNA (mrna) groß mrna 100% 80% 60% 40% 20% klein 0% mrna 3-5% der Gesamt-RNA- Menge 3 x 10 5 Moleküle pro Zelle Sehr unterschiedliche Größe (500 nt bis mehr als 10000 nt) Sehr unterschiedliche Anzahl (1 bis 100000 pro Zelle)
Das 5 -Ende der mrna ist durch eine Kappe geschützt 7-Methylguanosine (Kappe) 5 -Ende Einzigartig bei mrna Benötigt drei verschiedene Enzyme Wird kurz nach dem Start der Transkription angehängt ( Cotranskriptionell ) Ist eine wichtiges Signal für die Translation
Das 3 -Ende der mrna wird polyadenyliert Polyadenylierungssignal 10-30 Nucleotide 5 3 Spaltung 5 3 Polyadenylierung 5 3 AAAA-----AA (~ 250) Variables 3 -Ende Abbau Die Poly(A)-Polymerase benötigt kein Template!
Die Reifung der mrna benötigt eine Zusammenführung der richtigen Exons durch Spleißen Exon Intron Exon Intron Exon Synthese des Primärtranskripts 5 3 Spleißen 5 3 reife mrna AAAAAA
Die Signale für das richtige Spleißen der mrna befinden sich auf der mrna selbst Notwendige Sequenzen für das Herrausnehmen des Introns Exon 1 Intron Exon 2 Primärtranskript mrna herrausgeschittenes Intron wird abgebaut
rrna synthese findet im Nucleolus statt. RNA polymerase I transkribiert rrna Gene kontinuierlich. rrnas werden auch hier posttranslationell processiert, es entstehen unreife ribosomale Untereinheiten die erst im Zytoplasma fertiggestellt werden -> unreife mrna (hnrna) im Nucleus kann nicht translatiert werden. Histone Gene sind in Wiederholungseinheiten organisiert Histone mrna kurze Lebenszeit da kein poly(a) Schwanz. Während S-Phase aber viel Histone nötig um DNA zu verpacken. -> multiple Kopien der Histon Gene. Histon Sequenzen haben keine Introns.
U. Albrecht Page 1441 The organization and lengths of the histone gene cluster repeating units in a variety of organisms.
Gruppierte Genfamilien: Hämoglobin Gen Organisation U. Albrecht 2 Entwicklungbiologisch geordnete Gruppen α und β HbF HbA Page 1443 The progression of human globin chain synthesis with embryonic and fetal development.
U. Albrecht In Säugern sind diese zwei Hämoglobin Untereinheiten auf verschiedenen Chromosomen. Page 1444 The organization of human globin genes on their respective sense strands.
Structure of the prototypical hemoglobin gene. U. Albrecht Page 1444