4. Kursprogramm Kurstag 1 Werkzeuge und histologische Techniken Lernziele Prüfungsrelevante Lehrinhalte Mikroskopaufbau- und Funktionsweise. Optische Systeme. Artefakte im Präparat erkennen und deuten. Histologische Präparierschritte. Gängige Färbetechniken: H.E.-Färbung, Azan-Färbung, HOPA, van Gieson, Elastikafärbung, Eisenhämatoxylinfärbung, PAS-Reaktion. Immunhistologie, Enzymhistochemie, In-situ-Hybridisierung, in vivo Tracing, genetische Marker. Lernziele der Vorlesung Histologie Die Studierenden sollen die Grundlagen der Mikroskopie verstehen und erläutern können. die Herstellung eines histologischen Präparates und die wichtigsten Färbemethoden den Begriff der Metachromasie anhand eines Beispieles erläutern können. Verschiedene Zell- und Molekularbiologische Techniken kennen und die Eigenschaften embryonaler Stammzellen kennen und deren Einsatz bei der Herstellung von Knock-out Mäusen Lernziele des Kurses Histologie Die Studierenden sollen Komponenten des Mikroskops benennen und zeigen können. die allgemeine Funktionsweise eines Mikroskops erklären und anwenden können. das Mikroskop köhlern können. Größendimensionen wichtiger Zelltypen und subzellulärer Strukturen kennen. die Herstellung eines Paraffinpräparats erläutern können. typische Artefakte im Präparat kennen und identifizieren können. die Dreidimensionalität der Gewebe im Präparat rekonstruieren können. wichtige histologische Färbungen erkennen und erklären können: H.E.-Färbung, Azan-Färbung, HOPA, van Gieson, Elastikafärbung, Eisenhämatoxylinfärbung, PAS-Reaktion den Begriff der Metachromasie erläutern können. Immunhistologie, Enzymhistochemie, In-situ- Hybridisierung, genetische Markierungen als histologische Verfahren erläutern können. 15
Beispielpräparate Kurstag 1 34. Blutausstrich (Leukozytenkonzentrat), Mensch, Pappenheim 73. Niere, Schwein, H.E. 11. Unterhaut-Bindegewebe, Ratte, Semidünnschnitt, Richardson Herstellung histologischer Präparate 1. Fixierung: Das Gewebe wird chemisch durch Eiweißfällungsmittel konserviert und gehärtet. Häufig verwendete Fixierungsmittel sind z. B. Formalin (wässrige Lösung von Formaldehyd) oder Mischungen von Formalin, Pikrinsäure, Essigsäure (Bouinsche Lösung). 2. Entwässern und Einbetten: Nach der Fixierung Auswaschen des Fixierungsmittels, Entwässern durch aufsteigende Konzentrationen von Alkohol, Einbringen über Xylol oder Toluol in flüssiges Paraffin bei ca. 60 C. 3. Schneiden: Nach dem Aushärten werden die Gewebsstückchen im Paraffinblock auf einem Mikrotom geschnitten (Schnittdicke ca. 5-10 µm) und auf Glasobjektträger aufgezogen. 4. Entparaffinieren: Die Schnitte werden durch Einstellen in Xylol entparaffiniert und über absteigende Alkoholkonzentrationen in destilliertes Wasser überführt. 5. Färben, Eindecken: Die Schnitte werden meist mit wässrigen Färbelösungen gefärbt. Nach der Färbung, die oft aus zahlreichen Schritten besteht (beizen, oxydieren u. a. Vorbehandlungen; verschiedene Farbstoffe simultan oder nacheinander), erneute Entwässerung und Eindecken in Kunstharz unter einem Deckglas. Um dünnere Schnitte anfertigen zu können (Semidünnschnitte zur lichtmikroskopischen Beobachtung ca. 1 µm, Ultradünnschnitte zur elektronenmikroskopischen Beobachtung ca. 0,01 µm), müssen die Gewebsstücke in Kunststoffpolymere (wesentlich härter als Paraffin) eingebettet und mit Glas- oder Diamantmessern auf einem Ultramikrotom geschnitten werden. Zahlreiche Modifikationen bestehen für Spezialzwecke: z. B. kommt für den Nachweis von Fetten eine Paraffineinbettung wegen der dabei verwendeten Lösungsmittel nicht in Frage. Für viele histochemische Reaktionen muss sogar unfixiertes Gewebe verarbeitet werden. Nichtein-gebettetes Gewebe (fixiert oder unfixiert) kann nach Einfrieren mit dem Gefriermikrotom oder im Kryostaten geschnitten werden. 16
Häufig verwendete Färbungen Färbung Farbstoffe Kerne Zytoplasma Kollagenfasern Elastische Fasern H.E. Azan van Gieson HOPA Elastika Hämatoxylin Eosin Azokarmin Anilin/Orange G Eisenhämatoxylin Pikrinsäure Säurefuchsin Hämatoxylin Orange G Phosphomolybdänsäure Anilin Orcein oder Resorcin-Fuchsin violett rosa bis rot rot ungefärbt bis blass-rosa leuchtend rot rötlich bis bläulich Hämatoxylin - Eosin = H.E.: Hämatoxylin (Hämalaun) ist ein (bei niedrigem ph) positiv geladener Farbstoff, färbt daher negativ geladene ("basophile") Gewebsbestandteile, vor allem Nukleinsäuren, aber auch saure Proteoglykane. Eosin: negativ geladener Farbstoff, färbt Proteine des Zytoplasmas hellrot ("Acidophilie"). Ähnlich wie Eosin verhält sich Thiazinrot oder Orange G. In die Gruppe der positiv geladenen Farbstoffe gehört auch das zur Nissl-Färbung verwendete Kresylviolett oder Toluidin. Trichromfärbungen dienen zur Differenzierung von extrazellulären Bindegewebsfasern und Zellbestandteilen. Azan (Azan = Azokarmin Anilin - Orange G) färbt kollagene Fasern leuchtend, Zellkerne und Zytoplasma (u.a. auch Muskelfasern) in verschiedenen Rottönen. ungefärbt bis zart schwarz gelb rot ungefärbt bis blass-gelb braun bis violett grau- (Erys: gelb) ungefärbt bis - - - braun bis rot (Orcein) violett (Resorcin-F.) HOPA (HOPA = Hämatoxylin Orange G Phosphomolybdänsäure - Anilin) färbt Bindegewebsfasern, Zytoplasma grau-, Zellkerne braun bis violett, Erythrozyten gelb. (Weigert) van Gieson färbt kollagene Fasern rot, Zytoplasma gelb, Zellkerne schwarz. Silberimprägnation Darstellung von retikulären Fasern. Aldehyd- oder Resorcin-Fuchsin, Orcein Darstellung von elastischen Fasern. PAS-Reaktion (Periodic acid Schiff - Reaktion) - Darstellung von histochemischen Bestandteilen des Gewebes, z.b. von kohlenhydrathaltigen Molekülen (beispielsweise Muzine). Semidünnschnitte werden häufig nach Richardson mit einem en Farbstoffgemisch (Azur II - Methylen) gefärbt, der bevorzugt basophile Strukturen darstellt. Ultradünnschnitte für die Elektronenmikroskopie werden nicht mit Farblösungen, sondern mit Schwermetallsalzen (Osmium-, Uranyl- oder Wolframsalze), die eine unterschiedliche Elektronenstreuung (und damit unterschiedliche Schwärzung des photographischen Negativs) erzeugen, "kontrastiert". Immunhistologie selektiver Nachweis von Proteinen im Gewebe mit Hilfe spezifischer Antikörper. In-situ-Hybridisierung selektiver Nachweis von spezifischer mrna im Gewebe und damit Nachweis der Expression einzelner Gene. 17
Beispiele wichtiger Größenordnungen von Zellen- und Organbestandteilen Leberläppchen 1mm Schilddrüse-Follikel 0,05-0,5 mm Oocyte 600-1000 µm Perikaryon eines Neurons bis zu 150 µm Zellen des weißen Fettgewebes 100 µm Betz-Zellen bis zu 100 µm Zellen des braunen Fettgewebes 30 µm Hepatozyten 20-30 µm Darmepithelzelle (Höhe) 20-25 µm Venulen 10-30 µm (Länge bis zu 500 µm) Blutkapillaren 3-20 µm Neuriten Dicke: 0,5-20 µm; Länge: bis zu 1 m Lymphozyten 8 µm Erythrozyten 7-8 µm Thrombozyten 1-4 µm Mitochondrien 0,5-1 µm (Länge: 2-5 µm) Mikrovilli (Dünndarm) Länge: 1-1,5 µm Bakterien 1-2 µm Viren 10-100 nm Glykogenpartikel 20 nm cm = 0,01 m Keratinfilamente 10 nm mm = 0,001 m Bündel kollagener Fibrillen 30-200 nm µm = 10-6 m Myosinfilamente 16 nm (Länge: 8 µm) nm = 10-9 m Quellen: Welsch, Lehrbuch der Histologie, Elsevier, 2. Auflage, 2006; Bucher, Cytologie, Histologie und Mikroskopische Anatomie, Huber, 11. Auflage 1989; Geyer, Histologie, Thieme, 1980; Lüllmann-Rauch, Histologie, Thieme, 2. Auflage, 2006 Das Lichtmikroskop Was heißt Köhlern? August Köhler (1866-1948) war ein früher Mitarbeiter von Carl Zeiss in Jena und veröffentlichte 1893 Regeln für die richtige Beleuchtung mikroskopischer Präparate. Die von Köhler eingeführte Beleuchtung führt zu homogen ausgeleuchteten Bildern und ermöglicht gleichzeitig eine Steigerung des Auflösungsvermögens durch die Verwendung eines Kondensors. Besonders vorteilhaft ist dabei, dass durch die Aperturblende im Kondensor Bildkontrast und Auflösungsvermögen gegeneinander abgewogen werden können, ohne dass sich an der Homogenität der Bildhelligkeit etwas ändert. 18
So köhlern Sie Ihr Mikroskop Kondensor durch den Kondensortrieb in eine Position direkt unter dem Objekttisch bringen - Beleuchtung einschalten und das mit dem Deckglas nach oben aufgelegte Präparat mit dem 10x Objektiv fokussieren. Aperturblende am Kondensor vollständig öffnen und Leuchtfeldblende im Stativfuß vollständig schließen - beim Blick durch das Mikroskop erscheint ein unscharf konturiertes Bild der Blende. Wenn das mikroskopische Bild völlig dunkel wird, so befindet sich das Bild der Leuchtfeldblende außerhalb des Gesichtsfeldes und muss durch die Zentrierschrauben des Kondensors in das Gesichtsfeld gebracht werden. Kondensor so lange in der Höhe verstellen, bis das Bild der Leuchtfeldblende scharf im Gesichtsfeld erscheint. Bei manchen Mikroskopen besteht die Gefahr, dass man den Kondensor zu weit anhebt und es zu einer Kollision mit dem Objektträger kommt. Hier ist also etwas Vorsicht geboten. Mit den Zentrierschrauben des Kondensorträgers das Bild der Leuchtfeldblende in die Mitte des Gesichtsfeldes bringen. Leuchtfeldblende wieder öffnen, vollständig geöffnete Aperturblende während der Betrachtung durch das Mikroskop soweit schließen, bis kontrastreiches Bild entsteht. Nun ist ihr Mikroskop richtig geköhlert. 19