Der Nachweis von Antibiotika in Milch mit Biosensor E. Märtlbauer, A. Strasser, R. Dietrich Lehrstuhl für Hygiene und Technologie der Milch, Ludwig-Maximilians- Universität, München M. Weller, B. Knecht, R. Niessner Lehrstuhl für Hydrogeologie, Hydrochemie und Umweltanalytik, Technische Universität, München Kempten, November 2004 Projektförderung: FEI/AiF
Antibiotika-Verbrauch (EU und CH) 1997 Humanmedizin Tiermedizin "Leistungsförderer" beim Tier 46.0% 33.0% 6.0% 15.0% 8.0% 3.0% 1.0% 1.0% 4.0% 31.0% 52.0% Penicilline (322 t) Tetracycline (2294 t) Makrolide (424 t) Aminoglycoside (154 t) Fluorochinolone (43 t) Trimethoprim/Sulfonaminde (75 t) Andere Antibiotika (182 t) Leistungsförderer (1599 t)
Tierarzneimittelmarkt Deutschland 2001 Umsätze Prozentual bzw. in Antiparasitika 87 Mio 18,0% Antiinfektiva 132 Mio. 27,4% Biologika 134 Mio. 28,0% Hormone 21 Mio. 4,4% Sonstige 107 Mio 22,2% Quelle: VETimpulse, 15. Juni 2002
Gesetzliche Grundlagen Milch-Güteverordnung Hemmstoffuntersuchung 2,3 Preisabzug (5 Ct/kg) nach 4 bei positivem Ergebnis Keine Identifizierung des Hemmstoffes Lebensmittelrecht LMBG, AMG, VO über Stoffe mit pharmakologischer Wirkung EG-Verordnung Nr. 2377/90 Milch-Verordnung (20.07.00) Verkehrsverbot bei Überschreitung der Höchstmenge, Nicht-Einhaltung der Wartezeit sowie bei Anwendungsverbot des Tierarzneimittels
Beispiele für Höchstmengen (MRL), Antiinfektiva in Kuhmilch, VO (EWG) Nr. 2377/90 Substanz(en) MRL (µg/kg) Penicillin G, Amoxycillin, Ampicillin 4 Cloxacillin, Oxacillin, Dicloxacillin 30 Cephalosporine 10-125 Streptomycin 200 Sulfadiazin, Sulfamethazin 100
Anlieferungsmilch: Hemmstoffauswertung 2000 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 Prozent pos. Proben 0 Sachs. Thür. Brand. Sa.-A. Meckl. Rhl.Pf. Hess. Schl.H Brem. Bayern
Derzeitige Hemmstoffuntersuchung Mikrobiologische Tests Dauer(3 h) retrospektives Ergebnis Keine Substanzidentifizierung Beschränktes Spektrum Schnelltets Dauer (10-20 min) Sammelwagenebene nur ß-Laktamantibiotika
Zukunft? Verlagerung der Untersuchung auf die Erzeugerebene Vermeidung der Anlieferung antibiotikahaltiger Milch Schadensminimierung für Erzeuger und Verarbeiter Verbesserung des Verbraucherschutzes Allergien Resistenzen Direkte pharmakologische Wirkung Qualitätsvorteil für Milch und Milcherzeugnisse
Biosensor (IUPAC Definition) Biologischer Rezeptor direkt verbunden mit Physischem Transducer Reversibles Signal Ein-aus Reaktion Wiederholte Messung Kompact, integriert, klein Signaltransduktion electrochemisch piezoelektrisch optisch (SPR) Analytical Chemistry, March 1998
Entwicklung eines Biosensors (Immunosensors) Herstellung monoklonaler Antikörper zum Nachweis von Antibiotika und Sulfonamiden Indirekter kompetitiver Immuntest Multitest auf Mikrotiterplatte Strep. Cloxa. SDA SMA Ampi. LW 2 x MRL 1 x MRL 1/2 x MRL
Entwicklung eines Biosensors (Immunosensors) Umstellung auf Lumineszenz Umstellung auf Biochip Entwicklung des Biosensor- Prototyps Nachweis von Antibiotika und Sulfonamiden mit Biochip
Biosensor: Aufbau schematisch chip with microarray flow cell in dark chamber lens CCD camera sample loop out flow cell in Cavro pumps with sample, antibody solutions and substrate
Flußzelle und Biosensor-Prototyp Durchflußzelle mit Biochip L x B x H: 65 x 8,5 x 0,25 mm Vol.: 100 µl
Indirekter kompetitiver Immuntest
Biosensor: Prototyp
Durchflusszelle CCD-Kamera Objektiv Durchflusszelle
Messprotokoll Immunsensor Dauer Schritt 15 Sek. Spülen 15 Sek. Vorinkubation Probe und Antikörper 70 Sek. Inkubation von Probe und Antikörper in der Flußzelle 30 Sek. Spülen 70 Sek. Inkubation der markierten Sekundärantikörper 45 Sek. Spülen 5 Sek. Zugabe des Substrates 30 Sek. Belichtungszeit/Messung 280 Sek. Gesamtmeßzeit Strep Cloxa SDA SMA 0,001 ng/ml 1 ng/ml 100 ng/ml
Messung 0.8 5-10 Parallelspots Mittelung der 9 intensivsten Pixel pro Spot Normalisierung durch Vergleich mit Referenzsspots Relative intensity 0.6 0.4 0.2 0.0 3 s = 30 % detection limit 0 1E-3 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 Cloxacillin [µg/l] Calibration curve for cloxacillin in milk
Nachweis von Antibiotika und Sulfonamiden in Milch Relative intensity 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Streptomycin Cloxacillin Sulfadiazin Sulfamethazin NH OH HO O NH NH2 O OH H3C CHO NH HO O H2N NH HOCH 2 O HO NHCH 3 OH Relative intensity 0.8 0.6 0.4 0.2 H H H N S N O O Cl N O COOH Relative intensity 1.2 1.0 0.8 0.6 O N H2N 0.4 S N H O N 0.2 Relative intensity 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 O N 0.3 H2N S N H O N 0.2 0.1 0.0 0 1E-3 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 Streptomycin [µg/l] 0.0 0 1E-3 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 Cloxacillin [µg/l] 0.0 0 1E-3 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 Sulfadiazine [µg/l] 0.0 0 1E-3 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 Sulfamethazine [µg/l] Nachweisgrenze (µg/kg) Substanz MRL (µg/kg) Biosensor MTP Einzeltest MTP Multitest Streptomycin 200 5,1 3,2 14 Cloxacillin 30 0,3 0,8 1,7 Sulfadiazin 100 3,5 9 20 Sulfamethazin 100 4,9 7 13
Optimierte Meßparameter 7 Spotreplikate Verwendung von Referenzantikörpern 8.5 mm 65 mm active area: 4.2x12 mm trinitrophenyl penicillin G trinitrophenyl cloxacillin trinitrophenyl cephapirin trinitrophenyl sulfadiazine trinitrophenyl sulfamethazine trinitrophenyl streptomycin trinitrophenyl gentamicin trinitrophenyl neomycin trinitrophenyl erythromycin trinitrophenyl tylosin 0 ng/ml 1 ng/ml 100 ng/ml
Ergebnisse Substanz MRL (µg/kg) LOD (µg/kg) Penicillin G 4 3,3 Ampicillin 4 8,0 Cloxacillin 30 0,3 Cephapirin 60 0,12 Sulfadiazine 100 3,5 Sulfamethazine 100 4,9 Streptomycin 200 5,1 Gentamicin 100 12,1 Neomycin 1500 32 Erythromycin 40 0,36 Tylosin 50 0,95
Wiederfindung found concentration [µg/l] 1000 100 10 1 Penicillin G Cloxacillin Cephapirin Sulfadiazine Sulfamethazine Streptomycin Gentamicin Neomycin Erythromycin Tylosin 1 10 100 1000 spiked concentration [µg/l]
Realproben 8,30% 8,30% 8,30% 66,60% 8,30% Pencillin G* Cloxacillin Pen G*, Cloxa, Ampi* Ampi*, Strep, SDA Erythromycin
Projektstatus und Ausblick Miniaturisierung: (Test auf Objektträger) Automatisierung: (Proben- u. Reagenzien) Parallelisierung: 11 Tests gleichzeitig Testdauer: 4 min 40 sec. Keine Probenvorbereitung ermöglicht prinzipiell die on-line Erfassung Praktische Umsetzung
Zukunft! Verlagerung der Untersuchung auf die Erzeugerebene Vermeidung der Anlieferung antibiotikahaltiger Milch Schadensminimierung für Erzeuger und Verarbeiter Verbesserung des Verbraucherschutzes Allergien Resistenzen Direkte pharmakologische Wirkung Qualitätsvorteil für Milch und Milcherzeugnisse