Einfluss mechanischer Dehnung auf das Wachstum vaskulärer glatter Muskelzellen des Menschen
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- Bastian Lukas Weber
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1 Aus dem Julius-Bernstein-Institut für Physiologie der Martin-Luther-Universität zu Halle-Wittenberg, Magdeburger Straße 6, Halle/Saale Direktor: Prof. Dr. G. Isenberg Einfluss mechanischer Dehnung auf das Wachstum vaskulärer glatter Muskelzellen des Menschen Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin (Dr. med.) vorgelegt der medizinischen Fakultät der Martin-Luther-Universität zu Halle-Wittenberg von Tanja Angelina Gradištanac geboren am in Böblingen Gutachter: 1. Prof. Dr. Isenberg 2. Prof. Dr. Holtz 3. PD Dr Schubert (Rostock) urn:nbn:de:gbv: [
2 Der schöpferische Irrtum Irrtümer haben ihren Wert; Jedoch nur hie und da. Nicht jeder, der nach Indien fährt, entdeckt Amerika. Erich Kästner
3 Referat und bibliografische Beschreibung Die Rolle der Proliferation vaskulärer glatter Muskelzellen im Rahmen von Gefäßveränderungen wird nach wie vor kontrovers diskutiert. In der vorliegenden Arbeit wurde in der ersten Fragestellung der Einfluss physiologischer zyklischer mechanischer Dehnung auf die DNA-Synthese und die metabolische Aktivität humaner vaskulärer glatter Muskelzellen untersucht. Verwendet wurden primäre vaskuläre glatte Muskelzellen aus der Aorta (haosm) und aus einer Koronararterie (hcasm) des Menschen. In der Flexercell strain unit wurden die Zellen mittels Unterdruck gedehnt. Durch Bestimmung der BrDU-Inkorporation wurde die DNA-Synthese, mittels der Wst-1-Aktivität die metabolische Aktivität untersucht. Unter dem Einfluss zwei-/dreitägiger zyklischer mechanischer Dehnung (5% Dehnung, 0,5 Hz) zeigten die niedrigen Passagen der haosm Zellen eine signifikant verminderte DNA-Synthese (um 32,4±26,2%; n=6, P=0,013). Gleichzeitig bestand eine signifikante Zunahme der metabolischen Aktivität (um 39,1±17,9%, n=7, P< 0,0001). Eine Abnahme der DNA-Synthese aufgrund eines Nekrose- bzw. Apoptose-bedingten Zelltodes konnte mittels Bestimmung der Zellzahl, der LDH-Aktivität und der Apoptose ausgeschlossen werden. Um den Widerspruch von gleichzeitiger Abnahme der DNA-Synthese bei Zunahme der metabolischen Aktivität weiter abzuklären, wurde die Gesamtzellzahl und der Mitoseindex der haosm Zellen ermittelt. Weder die Gesamtzellzahl (24,6%, P=0,287) noch der Mitoseindex (52,8%, P=0,215) wiesen eine signifikante Änderung unter dem Einfluss physiologischer Dehnung aus. In den Versuchen mit haosm Zellen niedriger Passagen konnte demnach ein antiproliferativer Effekt physiologischer Dehnung nachgewiesen werden. So könnte mechanische Dehnung selbst zu einem Gleichgewicht der Vorgänge in der Gefäßwand beitragen. Die untersuchten hcasm Zellen zeigten weder eine dehnungsinduzierte signifikante Veränderung der DNA-Synthese (serumfrei: 4,9±115,1%, n=4, P=0,87; Vollmedium:+14,6±44,2%, n=3, P=0,6) noch der metabolischen Aktivität (serumfrei: +14,6±44,2%, n=3, P=0,6; Vollmedium: +81,66±61,95%, n=3, P=0,085). Eine dehnungsinduzierte Zellschädigung konnte durch Bestimmung der LDH-Aktivität der hcasm Zellen ausgeschlossen werden. In der zweiten Fragestellung interessierte, ob die Situation nach unphysiologischer Dehnung - nach PTCA - im Zellkulturmodell nachgestellt werden kann. haosm Zellen zeigten nach viermaliger Dehnung für 120 sec im technischen Maximalbereich (15% Dehnung, bis 80 kpa) über einen Zeitraum von einem Monat keine signifikanten Veränderungen der DNA-Synthese oder der metabolischen Aktivität. Eine dehnungsinduzierte Zellschädigung konnte mittels Bestimmung der LDH-Aktivität ausgeschlossen werden. Ein Restenosemodell war unter ausschließlichem Einfluss mechanischer Dehnung in der Zellkultur nicht nachvollziehbar, möglicherweise weil in vivo die Entwicklung einer Restenose multifaktoriell ist. Gradištanac, Tanja: Einfluss mechanischer Dehnung auf das Wachstum vaskulärer glatter Muskelzellen des Menschen. Halle, Univ., Med. Fak., Diss., 76 Seiten, 2006
4 Inhaltsverzeichnis 1.1. Einleitung Aufgabenstellung Materialien und Methoden Materialien Zellkultur Zellkulturmedien Passagieren der Zellen Einfrieren und Auftauen Methoden Zyklische mechanische Dehnung der Zellen Bestimmung der DNA-Synthese und der metabolischen Aktivität mit Hilfe colorimetrischer Methoden Bestimmung der Zellzahl mit dem In situ cell proliferation kit, AP Bestimmung der Aktivität der Laktatdehydrogenase mit dem LDH optimized Lactatdehydrogenase EC UV Test Bestimmung der Apoptoserate mit dem Cell Death Detection ELISA plus kit Datenwiedergabe und Statistik Ergebnisse Humane glatte Muskelzellen aus der Aorta (haosm) Charakterisierung Zyklische mechanische Dehnung reduziert die DNA-Synthese in den niedrigen Passagen der haosm Zellen Abnahme der DNA-Synthese ist nicht auf eine Zellschädigung zurückzuführen Humane glatte Muskelzellen aus einer Koronararterie (hcasm) Charakterisierung Zyklische mechanische Dehnung zeigt keinen Einfluss auf die DNA-Synthese und die metabolische Aktivität der hcasm Zellen 41
5 Mechanische Dehnung hat keine Zellschädigung der hcasm Zellen zur Folge Restenosemodell: Kann die Situation nach einer PTCA im Zellkulturmodell nachgestellt werden? Diskussion Zusammenfassung Literatur Thesen 75
6 Abkürzungsverzeichnis Abb. ACE AII bfgf/hfgf-b BrdU BSA camp Cas Cav-1 Crk c-src DAG DAG-PKC DMEM DNA EDTA ELISA ERK FAK FBS FCS Fyn g Grb2 GTP haosm hcasm hegf ICAM IGF-I ITS JNK LDH LW MAPK MEK Abbildung Acetylcholinesterase Angiotensin II bovine/human recombinant fibroblast growth factor 5-Bromo-2 -desoxyuridin bovine serum albumin cyclo-adenosin-3,5 -monophosphat Caspase Caveolin-1 Onkogen hergeleitet vom Rous sarcoma virus oncoprotein Diacylglycerol Diacylglycerol-Proteinkinase C Dulbecco`s modified Eagle Medium Desoxyribonukleinsäure Ethylendiamintetraessigsäure enzym-linked-immunosorbent-assay extracellular signal-regulated kinase fokal adhesion kinase fetal bovine serum fetal calf serum Protein-Tyrosin-kinase Erdbeschleunigung growth factor receptor bound protein-2 Guanosintriphosphat human aortic smooth muscle human coronary smooth muscle human recombinant epidermal growth factor intercellular adhesion molecule Insulin growth factor Insulin-Transferrin-Selenite c-jun amino terminal kinase Laktatdehydrogenase Leerwert mitogen activated protein kinase mitogen activated ERK activating kinase = MAPKK
7 MMP NADH NADPH PAX PBS PCNA PDGF PKC PLC-IP POD PTCA Raf Ras RER RGD R-TK S6K SAPK SH-2 Shc SMBM SmGM Sos TGF-beta TNF Wst-1 Matrixmetalloproteinase Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Hydrogen Phosphorylierte Form des NADH Paired box gene Phosphat gepufferte Salzlösung proliferating cell nuclear antigen platelet derived growth factor Proteinkinase C Phospholipase C-Inositolphosphat Peroxidase konjugierter Antikörper percutaneous transluminal coronar angioplasty eine MAPKKK eine monomere GTPase rauhes endoplasmatisches Retikulum Zell-Adhäsionsequenz Arg-Gly-Asp Rezeptor-Tyrosinkinase S6 kinase stress-activated protein kinase Src homolog 2 domain SH-2 containing adaptor protein smooth muscle basal medium smooth muscle growth medium Säugerhomolog von Son-of-sevenless (ein Drosophila-Genprodukt) transforming growth factor-beta Tumornekrosefaktor water soluble Tetrazolium
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