SOP_020_Fermentation (hier bes.: S. cerevisiae)

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1 SOP_020_Fermentation (hier bes.: S. cerevisiae) Inhalt Version erstellt am erstellt durch freigegeben durch Versuchsaufbau und Benutzung von Schüttelkolben zur Kultivierung von z.b. Hefen mit gleichzeitiger Messung von gasförmigem CO2 und O Holger Müller Frank Eiden Frank Eiden ergänzende SOP s: mitgeltende Dokumente: SOP_002_Messen, SOP_003_Komplexmedium, SOP_011_Biomasse MD_ MD_015_sterile_Verwendung_von Schüttelkolben_und_Abgasanalytik Einsatzgebiet: Einsatz von Schüttelkolben zur Prozessoptimierung und Ermittlung von Parametern wie z.b. OUR, CTR, RQ für das Scale-up Hinweis: die blau-gefärbten Textpassagen gelten NICHT für das Praktikum (diese SOP ist allgemein angelegt!) ACHTUNG WICHTIG: DIE KOLBEN SIND O F F E N zu betreiben => Vermeidung von zu hohen Innendrücken! Inhalt: 1. Theoretischer Hintergrund 2. Material und Methoden 3. Schüttler / Schüttelkolben 4. Abgasanalytik 5. Versuchsdurchführung Fermentation von S. cerevisiae 6. Aufgabenstellung und Diskussion 7. Kurzversion / Versuchsablauf: 1 / 14

2 1 Theoretischer Hintergrund Hefen Hefen zählen zu den Protoascomyceten oder Sprosspilzen. Charakteristisch sind ein septiertes Mycel sowie die Ausbildung von Kondiosporen. Ascomyceten (Schlauchpilze) gehören zusammen mit den Basidiomyceten zu den höheren Pilzen. Den eigentlichen Hefen (Saccharomycetaceae) fehlt allerdings das Mycel. Bäcker- und Bierhefen sind physiologische Rassen von Saccharomyces cerevisiae. Industriell werden meist diploide oder polyploide Rassen verwandt. Da es sich um Eukaryonten handelt, ist ihre Ähnlichkeit zu höheren Organismen deutlich größer als bei Bakterien. Eine durchschnittliche Hefezelle hat eine näherungsweise ellipsoide Form mit den Ausmaßen 5,5 x 7,0 μm (Escherichia coli, 1,0 x 3,0 μm). Daraus ergibt sich ein Volumen von ca. 100 μm³. Saccharomyces cerevisiae Die Hefe Saccharomyces cerevisiae, nach dem binomischen System mit Gattungs- und Artnamen benannt, lebt einzellig. Die Vermehrung geschieht in der asexuellen Phase durch Sprossung. Dabei werden an den Zellen nacheinander bis zu 30 Knospen gebildet, die nach der Abschnürung an der Mutterzelle sichtbare Narben hinterlassen. Das Genom ist auf einen haploiden Satz von 16 Chromosomen verteilt und umfasst zwölf Mbp (Megabasenpaare). Die Gesamtsequenz ist seit 1996 aufgeklärt und veröffentlicht. S. cerevisiae ist fakultativ anaerob, das bedeutet die Energiegewinnung für Vermehrung und Wachstum kann sowohl durch Atmung (aerob), als auch durch Gärung (anaerob), erfolgen, d.h.: Veratmung von Kohlenhydraten Veratmung von Ethanol Vergärung von Kohlenhydraten. Hefen sind also in der Lage ihren Metabolismus flexibel an Umweltbedingungen anzupassen. 2 / 14

3 Physiologie der Hefe Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae ist möglicherweise die am meisten untersuchte Hefe. Dies ist nicht nur eine Folge ihrer Bedeutung in der Industrie, wo sie in erster Linie zur Erzeugung von Alkohol in der Brennerei und Brauerei und als Biomasseproduzent in der Backhefeindustrie eingesetzt wird. Weitere Anwendungsgebiete dieser Zellen liegen in der Gewinnung von Geschmacks- und Aromastoffen, Enzymen, monoklonalen Antikörpern sowie in der Expression von Proteinen [HEYSE, 1995]. Aber auch ihre besondere Art der Glucose - Verstoffwechselung hat die Neugier mancher Wissenschaftler geweckt, so dass Saccharomyces cerevisiae zum Modellorganismus für die molekulargenetische Forschung an eukaryotischen Mikroorganismen geworden ist. Das kleine haploide Genom, die geringe Anzahl der Chromosomen sowie die unter Standardzuchtbedingungen erreichbare Generationszeit von nur 1,5 Stunden tragen mit dazu bei [SCHLEGEL, 1992]. In der Natur findet man Hefen an allen Standorten, an denen vergärbare, zuckerreiche Säfte frei werden: im Nektarsaft der Blüten und auf Blättern sowie auf reifen Früchten. Taxonomisch gehören die Hefen zur Abteilung der Pilze (Fungi) und zur Klasse der Schlauchpilze (Ascomycetes). Die weitere Einteilung der Hefen basiert im wesentlichen auf ihrer Morphologie und der Art ihrer Vermehrung. Die für Saccharomyces cerevisiae typische Art der asexuellen Vermehrung ist die Zellsprossung oder Knospenbildung. Die Sprosszellen können miteinander verbunden bleiben, oder sich völlig voneinander lösen. In Abbildung 1 ist schematisch das Querschnittsbild einer einzelnen Hefezelle dargestellt. Sie hat eine runde bis ovale Form und einen Durchmesser, der zwischen 6 und 14 μm liegt [HEYSE, 1995]. Die im Cytoplasma eingeschlossenen Organellen sind für die anabolischen und katabolischen Stoffwechselvorgänge sowie deren Energiekopplung notwendig. Nachfolgend sollen nur die im Rahmen dieser Arbeit interessierenden biologischen Grundlagen des Stoffwechsels der Hefen in komprimierter Form beschrieben werden. 3 / 14

4 Abb. 1. Schematische Darstellung einer Hefezelle Das Wachstumsverhalten von Saccharomyces cerevisiae ist typisch für Glucose -sensitive Hefen, bei denen die Glucoseaufnahme nicht über die Atmungsrate kontrolliert ist. Im Anschluss an die Glykolyse, die Umsetzung von Glucose zu Pyruvat, führt der Pyruvat - Stoffwechsel bei einem Überschuss an Glucose zu einer Bildung von Ethanol, anstelle in den Citratzyklus und die Atmungskette zu münden und dort unter Energiegewinnung zu CO2 abgebaut zu werden. Es handelt sich um eine Überlaufreaktion (Crabtree - Effekt), die beim Abbau der Überschüsse durch Wiederaufnahme des Ethanols verschwindet. Maßgebend für den vollständigen Abbau ist die verfügbare Atmungskapazität [FIECHTER, 1994; PRONK ET AL, 1996]. Diese begrenzte respiratorische Kapazität von Hefen der Gattung Saccharomyces ist in Abbildung 2 [nach SONNLEITNER und KÄPPELI, 1986] als Flaschenhals illustriert. Der als respiratorischer Flaschenhals bezeichnete Engpass in Abbildung 2 bestimmt den Weg der Kohlenstoffumsetzung zu Biomasse. Der oxidative Abbau der Glucose ist bevorzugt. Der reduktive Weg wird nur als Ausweg bei entsprechend hohem Glucoseangebot, und damit verbundener Überlastung der Respirationskapazität zugeschaltet. 4 / 14

5 Abb. 2. Erläuterung der Nutzung des Substrats Glucose bzw. Ethanol bei Hefen der Gattung Saccharomyces als respiratorischer Flaschenhals [nach SONNLEITNER und KÄPPELI, 1986]. Dabei wird das zwangsweise gebildete Ethanol ins Medium ausgeschieden. Dieses kann jedoch bei Unterschreitung der aktuellen Atmungskapazität über den oxidativen Weg von den Zellen verbraucht werden. Solange das Überangebot an Glucose nicht abgebaut ist, bleibt der überschüssige Ethanol unangetastet im Medium [FIECHTER,1994]. Hefen sind fakultativ anaerob, d.h. sie sind auch unter anaeroben Bedingungen lebens-, bzw. wachstumsfähig. Die Glucose wird dann rein reduktiv unter Bildung von Ethanol abgebaut. Bei dieser als alkoholische Gärung bezeichneten Kohlenstoffumsetzung kommt es zu einem nur geringen Wachstum der Hefen. Die Anhäufung des Ethanols im Medium fällt entsprechend stärker aus. Demzufolge werden für Hefen der Gattung Saccharomyces für den Umsatz der Kohlenstoffquellen in Biomasse drei verschiedene Stoffwechselwege unterschieden: oxidatives Wachstum auf Glucose reduktives Wachstum auf Glucose unter Bildung von Ethanol oxidatives Wachstum auf Ethanol 5 / 14

6 Anwendung im Versuch: Für die Fermentation kann handelsübliche Bäckerhefe, die in gepresster Form als Frischhefe angeboten wird oder ggfs. in Form einer Agar-Kultur-Platte, verwendet werden. 2 Material und Methoden Medium zur Kultivierung Das Fermentations-Medium enthält gemäß SOP_003_Komplexmedium die folgenden Bestandteile: - Hefeextrakt: 3g/l - Malzextrakt: 3g/l - Pepton: 5g/l - VE-Wasser: 1000ml Sterilisation: gemeinsam (mit dem Zucker bis max. 100 g/l) Bei der Berechnung der Einwaage ist ggfs. zu beachten, dass die Glucose als Monohydrat vorliegt! Das Volumen im Schüttelkolben wird je nach Versuchsplan und Schüttelkolbengröße angegeben (Normalerweise zwischen 100 und 250 ml) Die Zugabe der Glucoselösung und des Inokulums stellt also eine Verdünnung des Mediums dar, da davon ausgegangen wird, dass diese keine Medienbestandteile enthalten. Die Einwaagen, sowohl für das Fermentationsmedium, als auch für die Vorkultur, sind vor Beginn des Praktikums zu berechnen! 6 / 14

7 Herstellung des Mediums und der Vorkultur Die Bestandteile der Medien werden exakt, gemäß vorangegangener Berechnung, eingewogen und in Wasser gelöst. Es wird Medium für die Fermentation wie für die Vorkultur benötigt. Jede Gruppe stellt für die jeweils nachfolgende Gruppe das Fermentationsmedium sowie die Vorkultur her. Die Medien werden im Autoklaven thermisch sterilisiert. Die Beschickung und Bedienung des Autoklaven erfolgt, unter Beachtung der Anleitung am Gerät, ausschließlich im Beisein eines/r Betreuers/Betreuerin!. Das Anlegen der Vorkultur erfolgt unter der Sterilbank (s. a. Kapitel 4.2). Der Erlenmeyerkolben mit dem sterilisierten Medium wird unter der clean-bench geöffnet und mit Hilfe einer Impföse von einer Agarplatte (o.ä.) beimpft.(hier hätte ich noch einen Film!) Die Zugabe der sterilen Glucose erfolgt selbstverständlich ebenfalls unter der clean-bench. Der beimpfte Kolben wird in einem Schüttel-Inkubator, bei 30 C für ca. 20 h inkubiert, wobei darauf zu achten ist den Schüttelkolben nicht gasdicht zu verschließen. Bei der Verwendung von Schraubdeckeln, diese mit Klebeband fixieren. Das Medium und die Glucoselösung für die Fermentation werden zur späteren Verwendung in einer Kühlzelle gelagert. Hinweis: Es werden fertig sterilisierte Grundmedien bereitgestellt <<< 3 Schüttler / Schüttelkolben Es steht ein Orbitalschüttler der Firma Infors zur Verfügung (Abb. 1). Dieser sollte mit den vorhanden Schüttelkolben und Sensoren bis maximal 250 rpm genutzt werden. Höhere Drehzahlen können zu Beschädigung der Geräte und Kolben führen! Es stehen bis zu 6 Messplätze zur Verfügung. Hier können 3 x 500 ml Schüttelkolben als auch 3 x 1000 ml Kolben platziert und mit Messtechnik bestückt werden. Die Auswahl der Kolben, ob mit oder ohne Schikane, hängt dabei von den gewünschten Versuchsbedingungen ab. Versuchsaufbau 7 / 14

8 Auf dem Schüttler (Abb. 1) befindet sich eine Schüttelplatte für bis zu 6 Schüttelkolben. Die Schüttelkolben können jeweils mit einem CO2 und einem O2 Sensor bestückt werden, so dass online die entsprechenden Konzentrationen gemessen werden können. Die Sensoren sind wiederum an die BACCom12, einem elektronischen Multiplexer, angeschlossen. Dieser versorgt die Sensoren mit Spannung und leitet die aufgenommen Messwerte an die Software BACVis (alle Sensorsignale) oder FermVis (nur CO2 und O2 Signale) per RS232 oder Ethernetschnittstelle weiter. Weitere Einzelheiten entnehmen Sie bitte der Bedienungsanleitungen 3-10 (s. mitgeltende Dokumente). Vergleiche auch :SOP_002_Messen 8 / 14

9 Aufbau: A F B C G D E H Abb. 1 Gassensoren für CO2, O2 oder Ethanol F Sterile Begasungsöffnung (PTFE-Filter mit 0,22µm Poren) B Schüttelkolben G Klammerhorde zum Halten von Schüttelkolben C BACCom12 (Multiplexer) Datentransfer per TCP/IP zu PC H Einstellung eines Timers (wird nicht benötigt!) D Schüttelplatte E Einstellung der Drehzahl (max 250 rpm!!) 9 / 14

10 4 Abgasanalytik IR-Sensoren Die verwandten Kohlendioxid- (BCP-CO2) und Ethanol-Sensoren arbeiten mit Infrarotlicht (IR). Der Sensorkopf beinhaltet die IR Strahlungsquelle, den Detektor und die Auswertelektronik. Der Lichtstrahl durchstrahlt einen Messraum mit dem Analytgas und wird in dem Messadapter reflektiert. Ein Detektor misst die Intensität des reflektierten Lichts, welche von der jeweiligen Analytgaskonzentration abhängig ist. Der Sensorkopf beheizt den Messadapter, so dass keine Feuchtigkeit kondensieren kann. Das Messprinzip sowohl für Kohlendioxid als auch für Ethanol ist identisch, so dass die Sensoren mit dem entsprechenden Gas von Seiten des Herstellers kalibriert wurden. ZrO2-Sensoren Der Sauerstoff-Sensor (BCP-O2) basiert dagegen auf einer Sauerstoffpumpzelle und besteht aus dem Sensorkopf und dem Messadapter. Der Sensorkopf beinhaltet die Elektronik und den elektrischen Anschluss des Messadapters. Der Messadapter enthält das eigentliche Sensorelement aus Zirkoniumdioxid, welches auf eine Betriebstemperatur von 580 C aufgeheizt wird. Wird eine Spannung an die Zelle angelegt, werden Sauerstoffionen von der Kathode zur Anode gepumpt. Wird die Kathode zusätzlich mit einer Gas- Diffusionsbarriere abgedeckt, so stellt sich bei einer Erhöhung der Spannung ein Sättigungsstrom ein, welcher ein Maß für die Sauerstoffkonzentration ist. O 2 O 2 O 2- A 10 / 14

11 5 Versuchsdurchführung Fermentation von S. cerevisiae Die Hefe wird im Batch-Verfahren kultiviert. Dies erfordert Herstellung eines Fermentationsmediums sowie die Vorbereitung des Schüttelkolbens. Anschließend wird die Fermentation, durchgeführt. Stellen Sie die Betriebsparameter der durchzuführenden Fermentation ein: Wahl des Schüttelkolbens: 1000 ml mit und ohne Schikanen, 500ml mit und ohne Schikanen Füllhöhe im Schüttelkolben: max. 250 ml (nur 1000 ml-kolbern) / max. 100 ml im 500 ml-kolben Einwaage der Hefe: Schüttlerdrehzahl [U min-1] (max 250 prm) 5.1 Vorbereitung des Versuchsaufbaus - Sensoren an BACCom12 anschließen und diese an Spannung anschließen, denn Sensoren benötigen 1 Stunde Aufwärmzeit. - Schüttelkolben mit Medium füllen und nach Anleitung im Autoklaven sterilisieren. Software (BACVis oder FermVis) starten. 11 / 14

12 5.2 Start der Fermentation Nachdem Abkühlen des Kolbens diesen mit Hefe unter der Clean-bench animpfen. Schüttelkolben zum Schüttler bringen und dort schnellstmöglich die Sensoren ankoppeln (siehe MD_015_sterile_Verwendung_von Schüttelkolben_und_Abgasanalytik). Schüttelfrequenz einstellen (max. 250 prm) und Kultivierung laufen lassen. 5.3 Ende der Fermentation Nach Beendigung der Fermentation (Zeit oder Substrat ist alle) sind die Sensoren zu entfernen und der der Schüttelkolbeninhalt in eine vorbereitete geeignete, Flasche (o.ä,) zu entleeren, die später ggfs. autoklaviert wird um alle MOs (Mikroorganismen) thermisch zu inaktivieren. Nach der vollständigen Entleerung, den Schüttelkolben so oft mit VE-Wasser zu spülen bis keine Spuren von Medium oder Schaum mehr sichtbar sind. 6 Aufgabenstellung und Diskussion am Versuchstag: Fermentation starten, incl. Mess-Software die Werte der Messungen der Abgasmessung grafisch in z.b. Excel darstellen und Prozessparameter berechnen. Reinigen des benutzten Equipments und Aufräumen der Arbeitsplätze Es besteht die Möglichkeit Betriebs-Parameter zu verändern, so dass mit Hilfe bestehender Vorkenntnisse Ideen entwickelt werden können, welche Änderung einer Stellgröße, zu einer Reaktion des Systems führt und in welcher Weise sich diese Änderung auf den Versuch auswirkt. Die Änderungen müssen sorgfältig dokumentiert werden. 12 / 14

13 Auswertung: Als Ergebnis können sowohl die Konzentration des entstehenden CO2s und Ethanols und der Verbrauch von Sauerstoff online gemessen werden. Somit kann mit Kenntnis der Diffusionskonstante die Sauerstoffverbrauchsrate (Oxygen transfer rate OTR), die Kohlendioxidbildungsrate (carbon dioxide production rate CPR) und der Respirationsquotient (RQ) berechnet werden. (Siehe SOP_OTR_CPR_RQ_Berechnung.) 13 / 14

14 7. Kurzversion / Versuchsablauf: Komplexmedium herstellen: - Hefeextrakt 3g/l - Malzextrakt 3g/l - Pepton 5g/l - VE-Wasser 1000ml Medium: - in die großen Schüttelkolben (1,2 und 4) je 150ml eingießen - in die kleinen Schüttelkolben (3,5 und 6) je 50ml eingießen je nach Bedarf Hefemenge hinzufügen, z.b. einen 41g Bäckerhefeklotz in 100ml VE-Wasser lösen und auf die Schüttelkolben verteilen rote Verschlusskappe mit Teflonmembran (->aerober Versuch) und Dichtungsgummi zum Verschließen der Kolben nutzen rote Verschlusskappe mit Dichtungsgummi, Eisenring und Teflonmembran seitlich auf die Schüttelkolben drehen vorsichtig die Sensoren in die seitlichen Öffnungen der Schüttelkolben drücken, zur Not vorher noch mal ein wenig aufdrehen auf dem PC: Programm Fermvis starten Schüttler links an der Seite mit einem Knopf anstellen und vorne die rpm (Drehzahl) einstellen und starten 14 / 14