RIDASCREEN Risk Material 10/5

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1 RIDASCREEN Risk Material 10/5 Enzymimmunoassay zur qualitativen Bestimmung von Risikomaterial (ZNS) in/auf rohem Fleisch sowie auf kontaminierten Oberflächen Enzyme immunoassay for the qualitative analysis of risk material (CNS) in/on raw meat and on contaminated surfaces Art. No.: R6703 In vitro Test Lagerung bei 2-8 C Storage at 2-8 C R-Biopharm GmbH, Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) / Telefax: +49 (0)

2 Anschrift: R-Biopharm GmbH Dolivostr. 10 D Darmstadt Für weitere Fragen stehen Ihnen gerne zur Verfügung: Telefon: Zentrale / Auftragsannahme ( ) Sekretariat Marketing ( ) Marketing ( ) Frau Dr. Haas-Lauterbach ( ) Herr Dr. Lübbe Telefax/ Auftragsannahme ( ) orders@r-biopharm.de Marketing ( ) info@r-biopharm.de RIDA und RIDASCREEN sind eingetragene Warenzeichen der R-Biopharm GmbH Hersteller: R-Biopharm GmbH, Darmstadt, Deutschland Inhaltsverzeichnis/Contents Seite Kurzinformation Allgemeines Einleitung Testprinzip Packungsinhalt Zusätzlich benötigte Reagenzien - erforderliches Zubehör Vorsichtsmaßnahmen Reagenzien und ihre Lagerung Anzeichen für Reagenzienverfall Probenvorbereitung Testdurchführung Auswertung Sensitivität Spezifität page Brief information Intended use General Test principle Reagents provided Materials required but not provided Warnings and precautions for the users Storage instructions Indication of deterioration of reagents Preparation of samples Test implementation Results Sensitivity Specificity...18 Anhang/Appendix Literatur/Literature...19 RIDA and RIDASCREEN are registered trademarks of R-Biopharm GmbH Manufacturer: R-Biopharm GmbH, Darmstadt, Germany 2 RIDASCREEN Risk Material 10/ RIDASCREEN Risk Material 10/

3 Kurzinformation RIDASCREEN Risk Material 10/5 (Art.-Nr.: R6703) Enzymimmunoassay zur qualitativen Bestimmung von Risikomaterial (ZNS) in/auf rohen Fleisch- und Wurstwaren sowie auf kontaminierten Oberflächen. Alle Reagenzien für die Durchführung des Enzymimmunoassays - inkl. Standards - sind im Testkit enthalten. Der Testkit ist ausreichend für 96 Bestimmungen (einschl. Standardbestimmungen). Die Auswertung erfolgt visuell oder mit einem Mikrotiterplatten-Photometer (650 nm). Für die Probennahme werden Abstrichtupfer (swabs) und Probenröhrchen benötigt, die unter der Art.-Nr.: Z0010 (Probennahme Zubehör) bestellt werden können. Für die Durchführung des Tests ist keine spezielle über die eines Laboranten / Technikers hinausgehende Ausbildung erforderlich. Falls gewünscht, wird jedoch auf Anfrage eine Einarbeitung angeboten. Probenvorbereitung: Zeitbedarf: Nachweisgrenze: Hinweis: mit einem Swab aufgenommene Probe in Verdünnungspuffer überführen Probenvorbereitung für 10 Fleischproben...ca. 10 min Testdurchführung...ca. 15 min (unabhängig von der Probenzahl) 0,1 % für ZNS-Gewebe in rohen Fleisch- und Wurstwaren Für die Untersuchung von prozessierten Fleischund Wurstwaren ist ein RIDASCREEN Risk Material-Test unter der Art.Nr. R6701 erhältlich. 1. Allgemeines Der RIDASCREEN Risk Material 10/5 - Test ist ein Sandwich-Enzymimmunoassay zur qualitativen Bestimmung von Risikomaterial (ZNS) in/auf rohen Fleischund Wurstwaren sowie auf kontaminierten Oberflächen. 2. Einleitung BSE (Bovine Spongiforme Enzephalopathie) wurde 1986 zuerst in Großbritannien diagnostiziert. Der Infektionsmechanismus ist bisher nicht genau geklärt, aber es ist unbestritten, dass das krankhaft veränderte Prion Protein (PrPsc) eine große Rolle bei der Übertragung und Entwicklung dieser Gehirnerkrankung spielt. Das Verfüttern von unzureichend erhitztem Tiermehl führte zu einer Ausbreitung dieser Erkrankung, infolge derer bis Ende 2000 über Tiere getötet wurden. Durch die Applikation von infektiösem Gehirnmaterial konnte eine Infektion bei verschiedenen Tierarten induziert werden. Ähnliche Krankheitsbilder werden bei Schafen, Ziegen, Katzen und anderen Säugetieren beschrieben. Mit einer an Sicherheit grenzenden Wahrscheinlichkeit wird die neue Variante der Creutzfeldt- Jakob-Krankheit (vcjk) durch die Aufnahme von infektiösem Fleisch und Fleischprodukten ausgelöst. Die Mortalität dieser Erkrankung, an der bis Ende 2000 in Großbritannien über 80 Menschen verstorben sind, beträgt 100 %. Als Schutzmaßnahmen wurden das Verfüttern von Tiermehl (2000/766/EG) (1) und das Verarbeiten von spezifischem Risikomaterial in Lebensmitteln (2000/418/EG) (2) von der EU verboten. Mit dem RIDASCREEN Risk Material 10/5 Enzymimmunoassay kann Gehirn und Rückenmark (ZNS) in/auf rohen Fleisch- und Wurstwaren, sowie auf kontaminierten Oberflächen sensitiv und schnell nachgewiesen werden. 3. Testprinzip Grundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion. Der Nachweis von Risikomaterial erfolgt über die Bestimmung von saurem Gliafaserprotein (GFAP), einem zellulären Marker, der in besonders hoher Konzentration im ZNS vorkommt (3,4). Die Vertiefungen der Mikrotiterstreifen sind mit spezifischen Antikörpern gegen GFAP beschichtet. Im Falle eines Vorhandenseins von Material des ZNS bindet darin enthaltenes Protein an den Fänger-Antikörper. Mit einem Peroxidase-gekoppelten Antikörper gegen GFAP (Enzymkonjugat) wird gebundenes Antigen nachgewiesen. Nicht gebundenes Enzymkonjugat wird anschließend in einem Waschschritt wieder entfernt. Hinzu gegeben wird Chromogen/Substrat, gebundenes Enzymkonjugat wandelt das rot eingefärbte Chromogen in ein blaues Endprodukt um. Die Zugabe des Stopp-Reagenzes führt zu einem Farbumschlag nach grün. Eine photometrische Messung kann bei 650 nm erfolgen; die Extinktion der Lösung ist proportional zur Risikomaterial - Konzentration in der Probe. 4 RIDASCREEN Risk Material 10/ RIDASCREEN Risk Material 10/

4 4. Packungsinhalt Mit den Reagenzien einer Packung können 96 Bestimmungen durchgeführt werden (incl. Standardbestimmungen). Jeder Testkit enthält: 1 x Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten (12 Streifen à 8 Einzelkavitäten); beschichtet mit Antikörpern gegen GFAP 3 x Kontrollen (je 1,3 ml); negativ, schwach positiv (cut off), stark positiv GFAP in wäßriger Lösung 1 x Konjugat (6 ml), gebrauchsfertig; Peroxidase-konjugierter Antikörper gegen GFAP... roter Verschluss 1 x Probenpuffer; 10 ml als 10fach Konzentrat;... weißer Verschluss 1 x Waschpuffer (Salz); zur Herstellung eines 10 mm Phosphatpuffers (ph 7,4); (enthält 0,05 % Tween 20) 1 x Substrat-/Chromogenlösung (12 ml), rötlich gefärbt; (enthält Tetramethylbenzidin) weißer Verschluss 1 x Stopp-Reagenz (12 ml); (enthält 1 N Schwefelsäure)... oranger Verschluss 2 x Pasteurpipette; 1 ml, graduiert 5. Zusätzlich benötigte Reagenzien - erforderliches Zubehör 5.1. Geräte Wenn nicht visuell ausgewertet wird: Mikrotiterplatten-Photometer (650 nm) Abstrichtupfer Probenröhrchen als Probennahme Zubehör unter Art.-Nr. Z0010 von Einmalpipetten R-Biopharm zu beziehen 6. Vorsichtsmaßnahmen Nach Ablauf des Verfalldatums (siehe Testkit-Aussenetikett unter Expiration) kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Ein Austausch von Einzelreagenzien zwischen Kits verschiedener Chargennummern ist nicht möglich. 7. Reagenzien und ihre Lagerung Die Reagenzien bei 2-8 C lagern. Den Testkit auf keinen Fall einfrieren. Nicht benötigte Kavitäten zusammen mit dem Trockenmittel im Folienbeutel gut verschlossen aufbewahren und weiterhin bei 2-8 C lagern. Der Test kann bei entsprechender Lagerung mindestens bis zum Verfallsdatum (angegeben auf der Kitpackung) für eine ordnungsgemäße Analyse eingesetzt werden. Die Substrat-/Chromogenlösung ist lichtempfindlich, deshalb direkte Lichteinwirkung vermeiden. 8. Anzeichen für Reagenzienverfall Eine bläuliche Färbung der roten Substrat-/Chromogenlösung vor Zugabe in die Kavitäten weist auf einen Reagenzienverfall hin. Eine Extinktion kleiner 0,3 (E 650 nm < 0,3) für die stark positive Kontrolle weist ebenfalls auf einen Reagenzienverfall hin. 9. Probenvorbereitung 9.1. Rohe Fleisch- und Wurstproben bei homogenisierten Proben den trockenen Abstrichtupfer mehrmals in die rohe Probenmasse eintauchen, feste Fleischstücke gründlich mit dem Abstrichtupfer abwischen, dabei durch Drehen die gesamte Oberfläche des Tupfers in Kontakt mit der Probe bringen Probe durch mehrmaliges Ausdrücken des Tupfers am Gefäßrand bei gleichzeitigem Drehen in 1 ml verdünnten Probenpuffer überführen pro Kavität 2 Tropfen (alternativ 50 µl) im Test einsetzen 9.2. Oberflächen und Geräte Abstrichtupfer mit verdünntem Probenpuffer benetzen gründliches kreuzweises Abwischen einer ca. 10 x 10 cm großen Fläche oder einer Gerätefläche Probe direkt durch mehrmaliges Ausdrücken des Tupfers am Gefäßrand bei gleichzeitigem Drehen in 1 ml verdünnten Probenpuffer überführen pro Kavität 2 Tropfen (alternativ 50 µl) im Test einsetzen 6 RIDASCREEN Risk Material 10/ RIDASCREEN Risk Material 10/

5 10. Testdurchführung Testvorbereitungen 1. Alle Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen. 2. Nicht verwendete Reagenzien sofort wieder bei 2-8 C lagern. 3. Ein Eintrocknen der Kavitäten zwischen den Arbeitsschritten vermeiden. 4. Die Reproduzierbarkeit der Testergebnisse hängt in starkem Maße vom gleichmäßigen Waschen der Kavitäten ab. Die beschriebenen Waschsequenzen deshalb immer einhalten. 5. Bei allen Inkubationen direkte Sonneneinstrahlung vermeiden und deshalb die Mikrotiterplatten abdecken Probenpuffer Der Probenpuffer liegt als 10fach Konzentrat vor und muss deshalb vor Gebrauch 1:10 mit destilliertem Wasser verdünnt werden. Eventuell im Konzentrat vorhandene Kristalle sind vorher durch Erwärmen (Wasserbad bei 37 C) zu lösen. Wir empfehlen, den Probenpuffer in einem Schritt zu verdünnen (d.h. 10 ml Pufferkonzentrat, ad 100 ml destilliertes Wasser). Der verdünnte Probenpuffer kann bei 2 8 C im Kühlschrank bis zum angegebenen Verfallsdatum aufbewahrt werden. Pro Bestimmung 1 ml Puffer mit den im Testkit enthaltenen graduierten Pipetten in ein Probenröhrchen vorlegen Herstellung des Waschpuffers Der Testkit enthält einen Beutel Puffersalz. Zur Herstellung des Puffers wird der gesamte Inhalt des Beutels in 1 Liter destilliertem Wasser aufgelöst. Der gelöste Waschpuffer ist bei 2 8 C vier Wochen haltbar Testablauf 1. So viele Kavitäten in den Halterahmen einsetzen, wie für alle Standards und Proben benötigt werden. Die Positionen der Standards und der Proben protokollieren. Es sollten nicht mehr als 4 Streifen zu je 8 Kavitäten gleichzeitig bearbeitet werden (29 Proben + 3 Standards). 2. Je 2 Tropfen (alternativ 50 µl) der Standardlösung bzw. der nach Abschnitt 9. vorbereiteten Proben mit Einmalpipette in die entsprechenden Kavitäten pipettieren *). 3. Je 1 Tropfen (alternativ 50 µl) des Konjugates (rote Tropfflasche) in die entsprechenden Kavitäten pipettieren und 10 min (+/- 1 min) bei Raumtemperatur (20 25 C) inkubieren. 4. Die Kavitäten durch Ausschlagen der Flüssigkeit leeren und die Restflüssigkeit durch kräftiges Ausklopfen (dreimal hintereinander) auf sauberen, saugfähigen Labortüchern entfernen. Die Kavitäten mit jeweils 250 µl Waschpuffer (siehe 10.4.) waschen. Diesen Vorgang noch zweimal wiederholen. 5. Je 2 Tropfen (alternativ 100 µl) Substrat-/Chromogenlösung (weiße Tropfflasche) in die Kavitäten pipettieren. Durchmischen und 5 min (+/- 1 min) bei Raumtemperatur (20 25 C) im Dunkeln inkubieren. 6. Je 2 Tropfen (alternativ 100 µl) Stopp-Reagenz (orange Tropfflasche) in jede Kavität pipettieren. Gut durchmischen und das Ergebnis durch visuellen Vergleich der Farbintensität des Standards mit der Farbintensität der Probe innerhalb von 10 min ablesen. Zur photometrischen Auswertung s. Punkt *) Einmalpipetten sind Bestandteil des Zubehörkits für die Proben - vorbereitung, Art. Nr.: Z Antikörper-beschichtete Mikrotiterstreifen Den Folienbeutel an der Querseite entlang der Verschlussleiste aufschneiden. Die benötigten Kavitäten zusammen mit dem Halterahmen entnehmen. Die nicht be nötigten Kavitäten zusammen mit dem Trockenmittel im Folienbeutel gut verschlossen aufbewahren und weiterhin bei 2-8 C lagern. 8 RIDASCREEN Risk Material 10/ RIDASCREEN Risk Material 10/

6 11. Auswertung Die Farbintensität des ausgewählten Standards dient als Referenz. Nach Zugabe des Stopp-Reagenz kommt es zu einem Farbumschlag von blau nach grün Visuelle Auswertung 13. Spezifität Mit dem RIDASCREEN Risk Material 10/5 Test wird ZNS-Gewebe von Rind, Kalb, Schaf, Ziege, Pferd, Huhn und Schwein nachgewiesen. Eine Aussage über die Gewebeart (Hirn oder Rückenmark) ist nicht möglich. Der erhaltene Extinktionswert für die Probe wird mit dem Extinktionswert der Cut Off Kontrolle verglichen. 1 stark positiv Liegt die Extinktion der Probe unterhalb des Cut Offs, so ist die Probe als negativ zu bewerten. Ist die Extinktion der Probe größer oder gleich dem Cut Off, so ist die Probe als positiv zu bewerten. OD (650 nm) 0,8 0,6 0,4 Cut Off Photometrische Auswertung Für eine bessere Dokumentation kann ein Mikrotiterplatten-Photometer zur Messung der Extinktion herangezogen werden. Die Extinktion sollte innerhalb von 10 min nach Zugabe des Stopp-Reagenz bei 650 nm gemessen werden. Der Abgleich des Nullwertes erfolgt gegen Luft. 0,2 0 % risk material NK + 3SD Der erhaltene Extinktionswert für die Probe wird mit dem Extinktionswert der Cut Off Kontrolle verglichen. Abb. 1: Eichkurve eines RIDASCREEN Risk Material 10/5 -Teskits Liegt die Extinktion der Probe unterhalb des Cut Offs, so ist die Probe als negativ zu bewerten. Ist die Extinktion der Probe größer oder gleich dem Cut Off, so ist die Probe als positiv zu bewerten. 12. Sensitivität Die Bestimmungsgrenze des RIDASCREEN Risk Material 10/5 Tests ist 0,1 % für ZNS-Gewebe in rohen Fleisch- und Wurstwaren. Bei der Interpretation der Ergebnisse ist zu berücksichtigen, dass der Gehalt an Markerproteinen in verschiedenen Geweben von Risikomaterial (Hirn, Rückenmark) unterschiedlich hoch ist und Rückenmark-Gewebe in geringeren Konzentrationen zu einem positiven Ergebnis führen kann als Hirngewebe. Untersuchte Oberflächen und Geräte werden mit dem Ergebniss kontaminiert, nicht kontaminiert, bzw. unterhalb der Bestimmungsgrenze beurteilt. Diese Angaben entsprechen dem heutigen Stand unserer Kenntnisse und sollen über unsere Produkte und deren Anwendungsmöglichkeiten informieren. Sie haben somit nicht die Bedeutung, bestimmte Eigenschaften der Produkte oder deren Eignung für einen konkreten Einsatzzweck zuzusichern. R- Biopharm übernimmt keine Gewährleistung, außer für die standardisierte Qualität der Reagenzien. Defekte Produkte werden ersetzt. Darüber hinausgehende Ansprüche für direkte oder indirekte Schäden oder Kosten aus der Nutzung der Produkte bestehen nicht. 10 RIDASCREEN Risk Material 10/ RIDASCREEN Risk Material 10/

7 1. Intended use The RIDASCREEN Risk Material 10/5 test is a sandwich enzyme immunoassay for the qualtitative analysis of risk material (CNS) in/on raw meat, meat products, and on contaminated surfaces. Brief information RIDASCREEN Risk Material 10/5 Enzyme immunoassay for the qualitative analysis of risk material (CNS) in/on raw meat and on contaminated surfaces RIDASCREEN Risk Material 10/5 (Art. No.: R6703) Enzyme immunoassay for the qualitative analysis of risk material (CNS) in/on raw meat, meat products and on contaminated surfaces. All reagents required for the enzyme immunoassay - including standards - are contained in the test kit. The test kit is sufficient for 96 determinations (including standards). Results are read visually or with a microtiter plate spectrophotometer (650 nm). Technicians need no specialized training to perform the RIDASCREEN Risk material 10/5 test, however, training is offered from the distributor on request, if necessary. Sample preparation: Time requirement: Detection limit: Note: place the sampling swab into the dilution buffer Sample preparation for 10 samples... approx. 10 min Test implementation... approx. 15 min (regardless of the number of samples) 0.1 % for CNS tissue in raw meat, meat products For the determination of risk material (CNS) in processed meat and sausages we refer to the RIDASCREEN Risk Material test with Art.No. R General BSE (bovine spongiform encephalopathy) has been diagnosed first in Great Britain in The molecular mechanisms of infection are still unresolved, but it is clear, that the Prion protein (PrPsc) plays a major role in the transmission and development of the brain disease. Feeding of insufficient heated animal meal is likely to be the main cause of the spread of the disease, which has caused more than 180,000 dead cows up to the end of Application of extracts from infected brain induced infection in different animal species. Similar diseases are now described in cows, sheep, goat, cat, and many other mammalians. With a high presumption, the new variant of the human Creutzfelt-Jakob Disease (vcjd) is caused by infected beef and beef products. The mortality of this disease is 100 %, with more than 80 deaths in Great Britain up to the year As a protective measurement, animal meal / protein as animal feed is no longer allowed (2000/766/EG) (1) and potential risk material has been banned from food production by the EU (2000/418/EG) (2). With the RIDASCREEN Risk Material 10/5 enzyme immunoassay, brain and spinal cord (CNS) tissue can be detected sensitive and fast in/on raw meat, meat products and on surfaces. 3. Test principle The basis of the test is the antigen-antibody reaction. The detection of risk material ensues by the determination of Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), a cellulary marker, which can be found very highly concentrated in CNS tissue (3,4). The wells of the microtiter strips are coated with specific antibodies against GFAP. If the sample is contaminated with risk material, the contained Glial Fibrillary Acidic Proteins will bind to the specific capture antibodies. The bound GFAP is detected by an antibody peroxidase-conjugate directed against GFAP (enzyme conjugate). Any unbound enzyme conjugate is then removed in a washing step. Chromogen/substrate is added to the wells, bound enzyme conjugate converts the red dyed chromogen into a blue product. The addition of the stop reagent leads to a color change from blue to green. The measurement is made photometrically at 650 nm. The absorbance is proportional to the risk material concentration in the sample. 12 RIDASCREEN Risk Material 10/ RIDASCREEN Risk Material 10/

8 4. Reagents provided Each kit contains sufficient materials for 96 measurements (including standard analyses). Each test kit contains: 1 x Mikrotiter plate (12 strips with 8 removable wells each); coated with antibodies against GFAP 3 x Controls (1.3 ml each); negative, low positive (cut off), high positive; GFAP in buffer; ready to use 1 x Conjugate (6 ml), ready to use; peroxidase conjugated antibody against GFAP... red cap 1 x Sample Dilution Buffer; (10 ml as a 10x concentrate);... white cap 1 x Washing Buffer (Salt); for preparation of a 10 mm Phosphate Buffer (ph 7.4); (contains 0.05 % Tween 20) 1 x Substrate/Chromogen (12 ml), stained red; (contains Tetramethylbenzidin) white cap 1 x Stop reagent (12 ml); (contains 1 N sulfuric acid)... orange cap 2 x Pasteur pipettes; 1 ml, graduated 5. Materials required but not provided 5.1. Equipment If photometric determination is needed: microtiter plate spectrophotometer (650 nm) swabs pipettes available as part of a Sampling Tool kit from your distributor test tubes 7. Storage instructions Store the kit at 2-8 C. DO NOT FREEZE. Return any unused microwells to their original foil bag and reseal them together with the desiccant provided. The test kit can be regularly used at least up to the expiry date (indicated on the kit package), if stored correctly. The substrate/chromogen solution is light sensitive, therefore, avoid exposure to direct light. 8. Indication of deterioration of reagents Any bluish coloration of the red substrate/chromogen solution is indicative of deterioration and the reagent should be discarded. A value of less than 0.3 absorbance units (A 650 nm < 0.3) for the high positive control may indicate deterioration of reagents. 9. Preparation of samples 9.1. raw meat and meat products if samples are homogeneous, insert the swab several times into the sample, if samples are solid, swap the surface thoroughly while rotating the swab squeeze the swab thoroughly in a test tube containing 1 ml sample buffer employ two drops (or 50 µl) per well into the assay 9.2. surface swabbing pre-moisten the swab by placing it into sample buffer swab a representative area (10 x 10 cm, resp. 4 x 4 ) squeeze the swab in a test tube containing 1 ml sample buffer thoroughly employ two drops (or 50 µl) per well in the assay 6. Warnings and precautions for the users Do not use RIDASCREEN Risk Material 10/5 kit past the expiration date on the kit label. Dilution or adulteration of these reagents may result in loss of sensitivity. Do not interchange individual reagents between kits of different lot numbers. 14 RIDASCREEN Risk Material 10/ RIDASCREEN Risk Material 10/

9 10. Test implementation Preliminary comments 1. Bring all reagents to room temperature (20-25 C, F) before use. 2. Return all reagents to 2-8 C immediately after use. 3. Do not allow microwells to dry between working steps. 4. Reproducibility in any EIA is largely dependent upon the consistency with which the microwells are washed. Carefully follow the recommended washing sequence as outlined in the EIA test procedure. 5. Avoid direct sunlight during all incubations. Covering the microtiter plates is recommended Sample Dilution Buffer The sample dilution buffer is provided as a 10 fold concentrate. Before use the buffer has to be diluted 1:10 with dist. water. Crystals in the buffer concentrate can be dissolved in a waterbath at 37 C. We recommend dilution of the buffer concentrate in only one step (i.e. 10 ml concentrate + 90 ml dist. water). The diluted buffer can be used up to the expiry date printed on the buffer label if stored at 2 8 C. Place 1 ml of the diluted buffer into each test tube by using the graduated pipettes contained in the kit Preparation of the washing buffer The kit contains a packet with buffer salt. One pouch is dissolved in 1 liter of distilled water. The prepared washing buffer expires after 4 weeks at 4 C Antibody coated microtiter strips The foil bag is cut open along the transverse side beyond the zip. The required wells are extracted, together with the frame. Those wells not required are kept, together with the drying agent, well sealed in the foil bag and should continue to be stored at 2 8 C Test procedure 1. Insert a sufficient number of wells into the microwell holder for all standards and samples to be run. Record standard and sample positions. It shouldn t be performed more than 4 strips with 8 wells at the same time (29 samples + 3 standards). 2. Add two drops (or 50 µl) of standard or prepared sample to separate wells using disposable pasteur pipettes *). 3. Add one drop (or 50 µl) of enzyme conjugate (red cap) to the bottom of each well and incubate for 10 min (+/- 1 min) at room temperature (20-25 C; F). 4. Pour the liquid out of the wells and tap the microwell holder upside down vigorously (three times in a row) against absorbent paper to ensure complete removal of liquid from the wells. Fill all the wells with 250 µl washing buffer (see 10.4.) and pour out the liquid again. Repeat two more times. 5. Add two drops (or 100 µl) of substrate/chromogen to each well (white cap). Mix thoroughly and incubate for 5 min (+/- 1 min) at room temperature (20 25 C; F) in the dark. 6. Add two drops (or 100 µl) of stop solution to each well (orange cap). Mix well and compare visually the absorbance (color intensity) of the standard with the absorbance (color intensity) of the sample. Read within 10 minutes. Photometric evaluation see point Results *) available as part of a Sampling Tool kit from your distributor The color obtained for the standards (blue without stop, turned into green after addition of stop solution) serves as the references value Visual evaluation The absorption value for the sample is compared with the absorption values obtained for the cut off. If the absorption value of the sample is below the cut off value, the sample is considered to be negative. If the absorption value of the sample is higher than or equal to the cut off value, the sample is considered to be positive Photometric evaluation For better documentation, a microtiter spectrophotometer may be used for measuring the samples. After adding the stop solution the results should be read within 10 min. Use a filter at 650 nm, the blank should be read against air. The absorption value for the sample is compared with the absorption values obtained for the cut off. 16 RIDASCREEN Risk Material 10/ RIDASCREEN Risk Material 10/

10 If the absorption value of the sample is below the cut off value, the sample is considered to be negative. If the absorption value of the sample is higher than or equal to the cut off value, the sample is considered to be positive. OD (650 nm) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 cut-off % risk material high positive NC + 3SD Abb. 1: Results for the standards of the RIDASCREEN Risk Material 10/5 kit Anhang/Appendix Literatur/Literature 1. 00/766/EG: (also available in English language) Entscheidung des Rates vom 4. Dezember 2000 über Schutzmaßnahmen in Bezug auf die transmissible spongiforme Enzephalopathien und die Verfütterung von tierischem Protein Amtsblatt nr. L 306 vom 07/12/2000 S /418/EG: (also available in English language) Entscheidung der Kommission vom 29. Juni 2000 zur Regelung der Verwendung von bestimmtem Tiermaterial angesichts des Risikos der Übertragung von TSE-Erregern und zur Änderung der Entscheidung 94/474/EG (Bekanntgegeben unter Aktenzeichen K (2000) 1735) Amtsblatt nr. L 158 vom 30/06/2000 S Schmidt G.R., K.L. Hossner, R.S. Yemm, D.H. Gould and J.P. O`Callaghan (1988): An Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Glial Fibrillary Acidic Protein as an Indicator of the Presence of Brain or Spinal Cord in meat J. Food Protect. 62, Lücker E., S. Horlacher, E. Eigenbrodt und M. Bülte (2000): Verfahren zum Nachweis von im Hinblick auf BSE unerwünschten Zutaten in Fleischerzeugnissen Fleischwirtschaft 5, Sensitivity The Limit of Detection of the RIDASCREEN Risk Material 10/5 kit is 0.1% for CNS tissue in raw meat or meat products. When results are interpreted it has to be considered, that the contents of marker proteins in different risk materials (brain, spinal cord) may vary. Therefore, spinal cord may give positive results in lower concentrations than brain. The judgement of examined surfaces or technical equipment reads contaminated or not contaminated, below the detection limit respectively. 13. Specificity R-Biopharm makes no warranty of any kind, either expressed or implied, except that the materials from which its products are made are of standard quality. If any materials are defective, R-Biopharm will provide a replacement product. There is no warranty of merchantability of this product, or of the fitness of the product for any purpose. R-Biopharm shall not be liable for any damages, including special or consequential damage, or expense arising directly or indirectly from the use of this product. The RIDASCREEN Risk Material 10/5 kit allows detection of CNS tissue from cattle, veal, sheep, goat, horse, chicken and pig. A specification of the kind of tissue (brain or cord) is not possible. 18 RIDASCREEN Risk Material 10/ RIDASCREEN Risk Material 10/