Aus dem Zentrum Anatomie der Universität zu Köln Institut I für Anatomie Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. K. Addicks

Transkript

1 Aus dem Zentrum Anatomie der Universität zu Köln Institut I für Anatomie Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. K. Addicks Ischämie der Retina- Charakterisierung morphometrischer und immunhistochemischer Alterationen nach ischämischer Exposition anhand zweier in vitro- Glaukommodelle Inaugural-Dissertation zur Erlangung der ärztlichen Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Jan Philipp Radtke aus Dortmund Promoviert am 08. Februar 2012

2 Aus dem Zentrum Anatomie der Universität zu Köln Institut I für Anatomie Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. K. Addicks Ischämie der Retina- Charakterisierung morphometrischer und immunhistochemischer Alterationen nach ischämischer Exposition anhand zweier in vitro- Glaukommodelle Inaugural-Dissertation zur Erlangung der ärztlichen Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Jan Philipp Radtke aus Dortmund Promoviert am 08. Februar

3 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln Druckjahr 2012 Druck durch Copy- Star Druck und Werbung GmbH, Zülpicher Straße 184, Köln 3

4 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h.c. Th. Krieg 1. Berichterstatter: Professor Dr. vet. med. Dr. rer. medic. S. Arnhold 2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. K. Addicks Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente sind von mir nach vorheriger Einführung durch Herrn Professor Dr. vet.med. Dr. rer.medic. S. Arnhold selbst durchgeführt worden. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich keine Unterstützungsleistungen erhalten. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Arbeit wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln, 10. April 2011 Jan Philipp Radtke 4

5 Die in dieser Arbeit angegebenen Experimente sind nach entsprechender Anleitung durch Herrn Professor Dr. vet. med. Dr. rer. medic. Stefan Arnhold und Herrn Christian Hoffmann von mir selbst ausgeführt worden. 5

6 Danksagung Herrn Universitätsprofessor Dr. med. K. Addicks danke ich herzlich für die Möglichkeit, im Rahmen meiner Arbeit in seinem Institut I für Anatomie Einstieg in die anatomische Grundlagenforschung erhalten zu haben. Ebenso danke ich für sein stetes Interesse an meiner Arbeit und die beständige Diskussionsbereitschaft bei der Interpretation der Ergebnisse. Ich danke Herrn Professor Dr. vet. med. Dr. rer. medic. S. Arnhold für die Überlassung des Themas und seine stete hilfsbereite Betreuung. Seine beständige freundschaftliche Diskussionsbereitschaft und hervorragende Einarbeitung waren mir eine entscheidende Hilfe. Weiter danke ich Herrn Professor Dr. vet. med. Dr. rer. medic S. Arnhold für sein stetiges Engagement. Durch die vielen Diskussionen und zahlreiche Anregungen wurde die Arbeit entscheidend weiter vorangetrieben. Ich danke allen Mitarbeitern des Instituts I für Anatomie der Universität zu Köln für die angenehme Arbeitsatmosphäre und die gern gewährte Hilfe. Besonders gilt mein Dank Frau Jansen, Frau Kozlowski und Herrn Hoffmann, welche mir in vielen technischen Fragen hilfreich zur Seite standen. Nicht zuletzt gilt mein Dank Frau Privatdozentin Dr. med. Stefanie Kürten, die während unserer gemeinsamen Arbeit im Institut neben einer jederzeit zur Diskussion bereiten Mitstreiterin auch zu einer guten Freundin wurde. 6

7 In Dankbarkeit meinem Vater In Erinnerung an meine Mutter 7

8 INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG EINLEITUNG KLINISCHER HINTERGRUND PATHOGENESE Glaukom Diabetische Retinopathie Retinale Arterienverschlüsse ANATOMISCHE GRUNDLAGEN Embryologie Makroskopische Anatomie Mikroskopische Anatomie Gefäßversorgung des Auges Retinale Gefäßversorgung ANGIOGENESE, GEFÄßMODULATOREN, WACHSTUMSFAKTOREN Vaskulogenese- Angiogenese- Arteriogenese Physiologische Gefäßentwicklung der Retina Pathologische Gefäßentwicklung VEGF-Rezeptor und intrazellulärer Signalweg VEGFR-1 Signalkaskade VEGFR- 2 Signalkaskade VEGFR-3 Signalkaskade Dilatation existierender Gefäße, Anstieg der Permeabilität Stickstoffmonoxid (NO) Funktionen von Stickstoffmonoxid (NO) Synthese von NO enos Serin NADPH Diaphorase ASTROZYTEN UND GLIAL FIBRILLARY ACIDIC PROTEIN (GFAP) MATERIAL UND METHODIK VERSUCHSTIERE UND HALTUNGSSTANDARD OPERATIONSVERFAHREN Versuchsaufbau Anästhesieschema Quetschläsion (Crush) des Nervus opticus HIOP GEWEBEAUFARBEITUNG Gewebeentnahme Anfertigen von Gefrierschnitten Anfertigen von Paraffinschnitten IMMUNHISTOCHEMIE Immunhistochemische Färbungen, Grundlagen Immunhistochemische Färbungen NADPH- DIAPHORASE HISTOLOGISCHE FÄRBUNG Hämatoxylin- Eosin- Färbung REZEPTE VERWENDETER PUFFERLÖSUNGEN UND FÄRBUNGEN TBS Puffer TritonX BSA- Lösung DAB- Entwicklung ELEKTRONENMIKROSKOPIE UND SEMIDÜNNSCHNITTE Elektronenmikroskopie Fixierung der Proben für Elektronenmikroskopie Probenaufarbeitung für Elektronenmikroskopie

9 2.8.2 Semidünnschnitte AUSWERTUNG REZEPTE Aqua dest BSA- Lösung Epon QUANTITATIVE UND QUALITATIVE BEURTEILUNG DER PRÄPARATE STATISTISCHE AUSWERTUNG ERGEBNISSE QUANTITATIVE AUSWERTUNG Histologische Auswertung Durchmesser der gesamten Retina Durchmesser der Ganglienzellschicht Quantität der Ganglienzellen Durchmesser der inneren plexiformen Schicht Durchmesser der inneren nukleären Schicht Durchmesser der äusseren plexiformen Schicht QUALITATIVE AUSWERTUNG Einleitung GFAP Nachweis von NADPH- Diaphorase Nachweis von VEGF Nachweis von enos Nachweis von enos Serin ELEKTRONENMIKROSKOPIE Ultrastrukturelle Veränderungen der retinalen Ganglienzellschicht Ultrastrukturelle Veränderungen der inneren Retinaschichten Ultrastrukturelle Veränderungen der äusseren Retinaschichten DISKUSSION QUANTITATIVE VERÄNDERUNGEN DER RETINA NACH ISCHÄMIE- LITERATURÜBERBLICK Pathogenese quantitativer Veränderungen Einfluss unterschiedlicher Reperfusionszeiten Einfluss unterschiedlicher Ischämiezeiten auf die Apoptoserate Selektion der Ischämiezeit und der Reperfusionsdauer KRITIK DER METHODE EINFLÜSSE VERSCHIEDENER ISCHÄMIEVARIANTEN AUF DEN DURCHMESSER DER RETINA MORPHOMETRISCHE AUSWIRKUNGEN VERSCHIEDENER ISCHÄMIEMODELLE AUF EINZELNE RETINASCHICHTEN AUSWIRKUNGEN VERSCHIEDENER GLAUKOMMODELLE AUF DIE SYNTHESE RETINALER GLIAMATRIX DIE ENDOTHELIALE NITRIC OXIDE SYNTHASE- EINFLUSS DER GLAUKOMMODELLE AUF DEREN EXPRESSION EINFLUSS VERSCHIEDENER GLAUKOMMODELLE AUF DIE REAKTIVITÄT DER ENOS SERIN NADPH- EIN SUBSTRAT DER NO- SYNTHESE ALS INDIKATOR FÜR DIE WERTIGKEIT EINES GLAUKOMMODELLS? VEGF- EIN POTENTER MARKER POST- ISCHÄMISCHER VERÄNDERUNGEN DER RETINA SCHLUSSFOLGERUNGEN DER DISKUSSION ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK LITERATURVERZEICHNIS VORVERÖFFENTLICHUNGEN LEBENSLAUF 150 9

10 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS EDRF enos GC GC- S GFAP GW inos NADPH NADPH-d nnos NO NOS I NOS II NOS III NOS NOS Ser 116 VEGF Endothelium- derived relaxing factor endothelial nitric oxide synthase Guanylatcyclase lösliche Guanylatcyclase glial fibrillary acidic protein Gestationswoche inducible nitric oxide synthase nicotinamide adenine dinucleotide phosphate nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-diaphorase neuronal nitric oxide synthase nitric oxide nitric oxide synthase I (neuronal nitric oxide synthase) nitric oxide synthase II (inducible nitric oxide synthase) nitric oxide synthase III (endothelial nitric oxide synthase) nitric oxide synthase nitric oxide synthase Serin 116 phosphoryliert vascular endothelial growth factor 10

11 1 EINLEITUNG 1.1 Einleitung Der retinalen Ischämie kommt eine prominente Rolle bei Neovaskularisationen der Netzhaut zu. Zwar werden durch Ischämien auch andere Abschnitte des Auges und des Sehapparates geschädigt, Ischämien der Netzhaut, als die die Photorezeptoren beherbergende Struktur, können allerdings die bedeutendsten Folgen nach sich ziehen. Retinale Neovaskularisationen und Angiogenese können als gemeinsame Endstrecke unterschiedlicher Erkrankungen wie diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, Netzhautablösung und vor allem Glaukombildung zu schwerer Beeinträchtigung des Sehvermögens führen (Patz et al., 1980; Yassur et al., 1980; Yassur et al., 1980) und stellen auch unter heutigem Stand der Augenheilkunde immer noch ein großes Problem dar. Ischämien und Angiogenese sind somit für einen großen Teil der irreversiblen Blindheit der westlichen Welt verantwortlich. In vorliegender Arbeit wurden zwei verschiedene Glaukomodelle der Induktion retinaler Ischämie und Neovaskularisation im Rahmen der Grundlagenforschung im Tiermodell verglichen. Ziel war es, qualitativ, anhand von histologischen und immunhistochemischen Nachweisen Gefäßmodulationen, Angiogenese sowie Zelldegenerationen nachzuweisen. Darüber hinaus sollten die retinalen Veränderungen als Folge von Überdruck-induzierter Ischämie sowie Ischämie durch Kompression des N. opticus mit den Begleitgefäßen quantitativ erfasst werden um beide Glaukom- Modelle hinsichtlich ihrer Effektivität zu vergleichen. 1.2 Klinischer Hintergrund Vaskuläre und degenerative Netzhauterkrankungen machen einen hohen Anteil ophthalmologischer Krankheitsbilder aus. Im Vordergrund stehen dabei das Glaukom, die diabetische Retinopathie, und die degenerative altersbedingte Makuladegeneration (AMD). Unter einem Glaukom versteht man eine Sehnervenschädigung infolge eines Missverhältnisses zwischen erhöhtem Augeninnendruck und Perfusionsdruck der Papille (arterieller Druck). Der Augeninnendruck übersteigt den mittleren Blutdruck der Gefäße der Sehnervpapille und die Papille wird komprimiert (Patzelt, 2009). 1

12 Bei niedrigem Blutdruck kann ein Glaukom schon bei normalem Augeninnendruck entstehen (Normaldruckglaukom). Verursacht ein erhöhter Augeninnendruck aufgrund eines ausreich hohen Blutdruckes kein pathologisches Korrelat, liegt eine okuläre Hypertension vor (Patzelt, 2009). Glaukome lassen sich wie folgt klassifizieren: Als primär werden Glaukome bezeichnet, die nicht Folge einer anderen Erkrankung sind, als sekundär wenn sie in Folge einer anderen Krankheit oder eines Eingriffs auftreten. Kongenitale Glaukome können ebenfalls auftreten. Weiter wird je nach Beschaffenheit des Kammerwinkels zwischen Weitwinkelglaukom und Winkelblockglaukom unterschieden. Die Therapie besteht in der medikamentösen, chirurgischen oder Therapie durch Laseranwendung (Patzelt, 2009). Die diabetische Retinopathie stellt auch heute noch in den Industrienationen die häufigste Erblindungsursache der Altersgruppe zwischen 20 und 74 Jahren dar (Klein et al., 1989; Klein et al., 1989). Praktisch alle Typ-1-Diabetiker und der überwiegende Anteil der Typ-2-Diabetiker erkranken im Laufe ihres Lebens an einer Form der diabetischen Retinopathie (Lang et al., 2002). 1.3 Pathogenese Glaukom Pathoenetisches Korrelat des Glaukoms ist ein Missverhältniss zwischen Augeninnendruck, der pathologisch erhöht ist, und mittlerem arteriellen Blutdruck in der Papilla nervi optici. Der Augeninnendruck übersteigt den arteriellen Mitteldruck und sorgt für eine Kompression der Papille (Patzelt, 2009) Diabetische Retinopathie Die diabetische Retinopathie stellt eine Mikroangiopathie dar. Zunächst kommt es zu einer Verdickung der Basalmembran der Gefäße und zum Verlust von Perizyten und Gefäßendothelzellen. Im Verlauf der Erkrankung kommt es zu Kapillarverschlüssen und retinaler Ischämie. Die weitere Entwicklung wird durch eine retinale Hypoxie getriggert. In der ischämischen Retina werden angiogene Faktoren, wie vascular endothelial growth factor (VEGF) und Insulin like growth factor 1 (IGF 1) gebildet (Boden et al. 2003). 2

13 Unter Einwirkung dieser Wachstumsfaktoren kommt es zu präretinalen Neovaskularisationen. In jedem Stadium kann es zu einem Zusammenbruch der der Blut- Retina- Schranke durch erhöhte Gefäßpermeabilität kommen mit nachfolgender Ausbildung eines Makulaödems. Der Diabetes mellitus kann zu Veränderungen fast aller okulären Gewebe führen; Sicca- Symptomatik, transitorische Refraktionsänderungen, Katarakt, Glaukom, Optikusneuropathie. 90 % der Sehbeinträchtigungen bei Diabetikern werden jedoch durch die diabetische Retinopathie verursacht. Nach der Airly House Classification unterscheidet man nicht proliferative und proliferative Stadien (Lang et al. 2002) Retinale Arterienverschlüsse Beim retinalen Arterienverschluss kommt es zum Verschluss der Zentralarterie der Netzhaut (Arteria centralis retinae) des Auges. Daraus resultiert ein Sauerstoffmangel der Retina. Die plötzliche schmerzlose Erblindung auf einem Auge direkt nach dem Verschlussereignis ist ein Kardinalsymptom der Erkrankung. Ursache für den Verschluss ist ein eingeschwemmter Thrombus, der zumeisten der Arteria carotis interna entstammt oder durch einen Vorhofthrombus entsteht. Bereits nach 60 bis 90 Minuten tritt eine dauerhafte Schädigung der Netzhaut auf (Pschyrembel, 2002; Wikipedia Online, 2009). Seltene Ursachen sind entzündliche Veränderungen wie die Arteriitis temporalis. Als Amaurosis fugax werden transitorische Verschlüsse der Arteria centralis retinae bezeichnet, die reversibel sind (Boden et al. 2003). 1.4 Anatomische Grundlagen Embryologie Die Retina entwickelt sich aus einer Ausstülpung des Vorderhirns (Prosencephalon). Es entstehen Augenbläschen, die sich eindellen und zu einem doppelwandigen Kelch, dem Augenbecher, umformen (Lang, 2002). Die äußere Wand wird zum Pigmentepithel. Das innere, zur Glaskörperseite gelegene) Blatt entwicklet sich zur neuronalen Retina. Sie besteht aus Rezeptorzellen, Interneuronen und Ganglienzellen (Lüllmann- Rauch, 2003). Die Verbindung von Netzhaut und Vorderhirn bleibt durch die retinohypothalamische Bahn, die im Nervus opticus verläuft, zeitlebens erhalten (Lang et al., 2002) 3

14 1.4.2 Makroskopische Anatomie Die Wand des Bulbus ist aus drei Schichten aufgebaut: Innere, mittlere (Uvea) und äußere Augenhaut (Sklera und Cornea) (Lüllmann- Rauch, 2003). Die Netzhaut ist der innerste von 3 übereinander liegenden Schichten des Augapfels. Sie teilt sich in einen lichtempfindlichen Teil (Pars optica retinae) und einen lichtunempfindlichen Teil (Pars caeca retinae). Die Pars optica retinae geht an der Ora serrata in die Pars caeca retinae über (Lüllmann- Rauch, 2003) Mikroskopische Anatomie Die Pars optica retinae kleidet den hinteren Abschnitt des Augapfels aus. Besonders prominent sind die Papille, die Austrittsstelle des Nervus opticus, und die temporal davon gelegene Macula lutea mit einer trichterförmigen Vertiefung in der Mitte, der Fovea centralis, dem Bereich des schärfsten Sehens (Lüllmann- Rauch, 2003). Die Retina enthält die ersten drei Neurone der Sehbahn: 1. Neuron: Die Photorezeptorzellen (Stäbchen- und Zapfen, insgesamt ca 130 Millionen) setzten Lichtreize in elektrochemische Signale um. 2. Neuron: Bipolare Zellen nehmen die Signale von den Rezeptorzellen auf und geben sie weiter an das 3. Neuron 3. Neuron: Ganglienzellen. Die Axone der Ganglienzellen streben in Richtung Papille, vereinigen sich zum Nervus opticus und verlassen das Auge in Richtung des 4. Neurons, des intrathekalen Corpus geniculatum laterale (Lüllmann- Rauch, 2003). Der Aufbau der Retina wird in zehn Schichten beschrieben. Dieses Schichtbild kommt histologisch dadurch zustande, dass vergleichbare Bestandteile der Neurone auf gleicher Höhe liegen. Die äußerste Schicht bildet das Pigmentepithel, ihr lagert die Schicht der Stäbchen und Zapfen auf, die durch die Fortsätze der Photorezeptorzellen gebildet wird. 4

15 Zwischen der Pigmentepithelschicht und den Stäbchen und Zapfen bleibt zeitlebens ein kapillärer Spalt als embryologisches Artefakt bestehen: Hier besteht die Möglichkeit der Ablösung beider Blätter voneinander (Netzhautablösung, Amotio)(Lüllmann- Rauch). Zwischen den Fortsätzen der Photorezeptorzellen und deren Perikaryen, also den Perikaryen des 1. Neurons im Stratum nucleare externum (äußere Körnerschicht) liegt die äußere Grenzschicht (Stratum limitans externum). Synapsen zwischen den Axonen des ersten Neurons und den Dendriten des zweiten Neurons werden in der äußeren plexiformen Schicht repräsentiert (Stratum plexiforme externum). Die Perikaryen des zweiten Neurons, also der bipolaren Zellen liegen in der inneren Körnerschicht (Stratum nucleare internum). Ebenso die Perikaryen der Horizontalzellen, amakrinen Zellen und Müller- Zellen, die als eine Sonderform der Astroglia die glialen Stützellen der Retina sind (Lüllmann- Rauch, 2003). Die Synapsen zwischen Axonen des 2. und Dendriten des 3. Neurons liegen in der inneren plexiformen Schicht (Stratum plexiforme internum). Die Perikayen des dritten Neurons, der Opticusganglienzellen liegen in der Ganglienzellschicht (Stratum ganglionicum). In der nächstinneren gelegenen Schicht, der Nervenfaserschicht (Stratum neurofibrarum) liegen die Axone der Ganglienzellen. Die innerste Schicht (Stratum limitans internum), auch innere Grenzschicht bezeichnet, enthält die Endfüßchen der Müller- Zellfortsätze und die Basallamina (Lüllmann- Rauch, 2003). Die Zellen des einschichtigen Pigmentepithels enthalten zahlreiche Melanosomen (Lüllmann- Rauch, 2003). Die Zellen sind durch Haftkomplexe mit Tight junctions untereinander verbunden und bilden die Blut- Retina- Schranke. Das Pigmentepithel vermittelt den Stoffaustausch zwischen der Choriokapillaris und den Photorezeptorzellen und ist am Umsatz der Rezeptorzellfortsätze beteiligt. Das Pigment (Melanin) verhindert Lichtreflexionen. Die Photorezeptorzellen besitzen zwei Arten von Sinneszellen: Stäbchenzellen mit hoher Lichtempfindlichkeit zur Wahrnehung von Helligkeitsunterschieden, die sich für das Dämmerungssehen verantwortlich zeigen, allerdings eine geringe räumliche Auflösung haben; und Zapfenzellen mit geringer Lichtempfindlichkeit zur Wahrnehmung von Helligkeits- und Farbunterschieden, die für das Sehen bei Tageslicht verantwortlich sind (Lüllmann- Rauch, 2003). 5

16 1.4.4 Gefäßversorgung des Auges Die arterielle Gefäßversorgung der Orbita und des Augapfels geschieht durch Äste der Arteria ophthalmica, welche aus der Arteria carotis interna stammt und mit dem Nervus opticus durch das Foramen opticum des Keilbeins in die Augenhöhle gelangt (Goebel, 1995). Sie versorgt den Bulbus oculi, die Musculi bulbi, die Tunica conjunctiva, das Os ethmoidale, die Regio frontalis, die Glandula lacrimalis, die Palpebrae und Teile der Cavitatis nasi. Die Arteria ophthalmica teilt sich kurz hinter dem Augapfel in zwei getrennte Stromgebiete. Das eine entspricht der Arteria centralis retinae und versorgt die inneren Schichten der Retina, das andere Stromgebiet wird durch die Uvea repräsentiert und über die Arteriae ciliares gespeist. Iris, Corpus ciliare und die Choroidea bilden zusammen die Uvea, die mittlere Augenhaut (Goebel, 1995). 6

17 Abbildung 1: Arterien und Venen des Bulbus Oculi, Kiss F, Szentágothai J. 1968: Anatomischer Atlas. Bd III. Thieme Verlag, Leipzig Retinale Gefäßversorgung Die retinalen Gefäße entspringen aus der Arteria centralis retinae, einer direkten Fortsetzung der Arteria ophthalmica. Sie teilt sich an der Papille in einen oberen und einen unteren Ast und wiederum in einen nasalen und einen temporalen Zweig (Rohen, 2001). Die Arteriolen werden im Inneren von lückenlosem Endothel ausgekleidet. Die Endothelzellen sind über tight junctions miteinander verbunden und im intakten Zustand für Proteine praktisch undurchlässig. Die Endothelzellen bilden das morphologische Korrelat der Blut-Hirn-Schranke (Kühnel, 1992). Das Gefäßendothel sitzt einer Basallamina auf, welche von den Endothelzellen gebildet wird. Innerhalb der Basalmembran liegen die Perizyten, denen kontraktile Eigenschaften zugeschrieben werden. Im Unterschied zu den Netzhautkapillaren wird die Basalmembran der Arteriole von ringförmigen und längsverlaufenden glatten Muskelzellen umgeben. Dieser Muskelschlauch ist nicht kontinuierlich und wird durch kollagene und elastische Fasern unterbrochen (Hogan et Feeney, 1963). Die retinalen Arteriolen durchdringen die Netzhautschichten und bilden Kapillarnetze, welche die inneren Netzhautschichten bis einschließlich der inneren plexiformen Schicht versorgen. Um die Sehfunktion zu gewährleisten ist die äußere Netzhaut komplett avaskulär. Sie bezieht Sauerstoff und Nährstoffe aus der chorioidalen Zirkulation. Um den Transport zu steigern, existiert eine große Anzahl fenestrierter chorioidaler Kapillaren unterhalb der Retina, die sogenannte Choriokapillaris (Kühnel, 1992). 7

18 Abbildung 2: Schematischer Aufbau der Netzhaut, Mutschler E, Wiederholt M, Upmeyer HJ. Hrsg Regulationsdynamik beim Glaukom - Flüssigkeitsbewegungen und Nährstofftransport am Auge Ein interdisziplinäres Expertengespräch. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbh, Stuttgart Danach erfolgt der Ablauf in das venöse System über die Venae vorticosae. Über die Vena ophthalmica superior erfolgt mit Venen aus dem Nasenwurzel- und Stirnbereich der Zusammenfluss mit der Vena ophthalmica inferior in den Sinus cavernosus (Kühnel, 1992). 1.5 Angiogenese, Gefäßmodulatoren, Wachstumsfaktoren Vaskulogenese- Angiogenese- Arteriogenese Die Entstehung des Gefäßsystems gliedert sich in der Embryonalphase in Vaskulogenese, Angiogenese und Arteriogenese (Risau 1991, van Royen et al. 2001, Hughes et al. 2000). Die Vaskulogenese umfasst die Entwicklung und Differenzierung von mesenchymalen Vorläuferzellen, den Angioblasten, zu Endothelzellen und die Gefäßformierung (Risau 1991). 8

19 Im Gegensatz dazu wird während der Angiogenese eine Aussprossung von Kapillaren aus den während der Vaskulogenese entstandenen Arteriolen vollzogen, die dann fusionieren (van Royen et al. 2001). Durch Migration und Proliferation der Endothelzellen entsteht so ein reifes Gefäßsystem (Boden et al, 2003). Die Arteriogenese beschreibt den Umbauvorgang von Arteriolen zu größeren Arterien. Induziert wird dieser Prozess durch eine erhöhte Schubspannung in den angiogenetischen Kollateralen und Arteriolen (van Royen et al. 2001). Dabei kommt es zu einer Querschnittsvergrößerung der Arteriolen und einer Proliferation der glatten Muskelzellen um die Gefäße herum. Gefäßneubildungen im Auge entstehen während der Embryonalentwicklung ab der 15. Schwangerschaftswoche, ferner als pathologische Neovaskularisationen als Folge einer Ischämie der Retina bei diabetischer Retinopathie oder Frühgeborenenretinopathie (Hughes et al. 2000) Physiologische Gefäßentwicklung der Retina Entsprechend der phylogenetischen Zugehörigkeit der Retina zum zentralen Nervensystem vollzieht sich die Genese der retinalen Gefäße zwischen der 14. und 38. Gestationswoche entlang von Gliaschienen (Hughes et al. 2000). Die vollständig entwickelte Retina besitzt ein tiefes und ein oberflächliches Gefäßnetz. Das tiefe Netz entwickelt sich früher als das oberflächliche (Boden et al. 2003). Ab der 14. Gestationswoche wandern spindelförmige mesenchymale Vorläuferzellen vom Nervus opticus in die tiefe Schicht in Richtung Netzhautperipherie aus (Hughes et al 2000)(Boden et al. 2003). Nach der 15. GW formieren sich die Progenitorzellen zu Strängen und differenzieren von der 18. bis zur 25. GW zu Endothelzellen (Hughes et al. 2000). Die durch Endothelzellen geformten Röhren reagieren nicht auf VEGF, was darauf hinweist, dass das innere Gefäßnetz der Retina ausschließlich durch Vaskulogenese entsteht (Boden et al. 2003). Das oberflächliche Gefäßnetz entsteht nur durch Aussprossung aus der tiefen Schicht und somit durch Angiogenese. Es wird angenommen, dass die Stoffwechselsituation der Neurone am Rand der avaskulären Zonen der Retina eine Hypoxie der Retina auslöst. Durch diese Hypoxie wird eine gesteigerte Expression von VEGF ausgelöst, die die Angiogenese initialisiert (Boden et al. 2003, Stone et al 1995). Bis zur 25. Gestationswoche folgen die Vorläufer der Gefäße Astrozyten als Leitstrukturen, die von der 18. Gestationswoche an, sich von der zentralen Retina in die Peripherie erstrecken (Hughes et al. 2000). 9

20 Die endothelialen Vorläuferzellen sind während dieser Zeit nicht auf der gesamten Retina nachzuweisen: Die Fovea centralis bleibt bis zur 25. Gestationswoche avaskulär und wird nur von kleinsten Arteriolen umgeben, die dann durch Angiogenese einsprossen (Boden et al. 2003, Hughes et al. 2000). Das periphere Gefäßnetz entwickelt sich von der 26. bis zur 38. Gestationswoche ausgehend von der Fovea centralis durch Angiogenese (Boden et al. 2003). Aufgrund dessen, dass sich in der temporalen Peripherie und der Fovea centralis keine Progenitorzellen befinden, lässt sich mutmaßen, dass beide Regionen ebenfalls ausschließlich durch Angiogenese vaskularisiert werden (Boden et al. 2003) Pathologische Gefäßentwicklung Pathologische Gefäßentwicklungen entstehen durch ein Missverhältnis von angiogenen und antiangiogenen Faktoren. Ursachen für dieses Missverhältnis sind in einer Reihe von vaskulären Erkrankungen der Retina und des Bulbus begründet, so z.b. bei der diabetischen Retinopathie und dem Verschluss der Arteria centralis retinae. Infolge dieser Erkrankungen kommt es zu einer Minderperfusion der Retina und im Verlauf der Pathogenese zu Ischämien der Retinaareale. Die ischämischen Areale exprimieren vermehrt angiogene Faktoren, wie VEGF. Durch gesteigerte Expression dieser Mediatoren kommt es zu Neovaskularisationen in und auf der Retina (Boden et al. 2003) Vascular endothelial growth factor Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor VEGF, zeitgleich von Ferrara und Henzel (Ferrara, 1989), Gospodarowicz (Gospodarowicz et al., 1989) und Tischer (Tischer et al., 1989), ist in den letzten Jahren als der wichtigste angiogene Wachstumsfaktor in den Mittelpunkt des Interesses gerückt. Verschiedene Arbeiten haben die prominente Rolle von VEGF bei der Entwicklung des kardiovaskulären Systems belegt. Die Angiogenese ist von einer hohen VEGF- Konzentration abhängig, sinkt dieser Konzentrationsgradient während der Embryonalphase sind fatale Konsequenzen die Folge (Neufeld et al. 1999). Eine Hypoxie- induzierte VEGF- Produktion ist der bedeutenste Trigger- Faktor der Angiogenese während der Entwicklung einzelner Organe, so auch der Retina (Neufeld et al. 1999). Während der Gefäßentwicklung der Retina zwischen der 18. und 25. Gestationswoche sprossen vaskuläre Vorläuferzellen an Astrozyten als Leitstrukturen von den existierenden Arteriolen in 10

21 Richtung Peripherie aus (Hughes et al. 2000). Je weiter die Astrozyten in die Peripherie aussprossen nähern sie sich hypoxischen Arealen in der temporalen Peripherie an. Da Astrozyten sensitiver auf hypoxische Umgebungen reagieren als die übrigen neuronalen Zelltypen, werden sie in erhöhtem Maße zur Produktion von VEGF stimuliert (Neufeld et al. 1999). Ein gesteigerter VEGF- Gradient stimuliert die Neovaskularisation neuer Arteriolen in Richtung der Astrozyten, die als Resultat mit einer weiteren Migration in Richtung der temporalen Netzhautperipherie reagieren. Die Produktion an VEGF seitens der Astrozyten nimmt somit wieder ab. Eine anhaltende Konzentration von VEGF ist somit notwendig für die Inhibition der Apoptose endothelialer Zellen und in der Folge essentiell für die Stabilisierung neu gebildeter Arteriolen (Neufeld et al. 1999). VEGF ist ein potenter und bedeutender Regulator des Gefäßwachstums (Neufeld et al., 1999), dessen räumliches, zeitliches und quantitatives Vorkommen sehr genau reguliert sein muss, um Fehlbildungen in der Neovaskularisation zu verhindern (Rieke et al., 2004). Funktionieren die Regulationsmechanismen der VEGF- Synthese nicht mehr, sind angiogenetische Erkrankungen die Folge. Die Entfernung auch nur eines VEGF-Allels zeigt gleiche Auswirkungen wie die Blockade seines Rezeptors VEGF-R, was sich durch ein annähernd komplettes Fehlen von Blutgefäßen in Mäusen äußert. Dies führt zu embryonaler Letalität aufgrund schwerster Gefäßanomalien (Carmeliet et al., 1996; Ferrara et al., 1996). Andererseits ist bei der Frühgeborenenretinopathie eine Überproduktion an VEGF nach relativer Hypoxie. Ursache für eine fulminante Angiogenese, die zu einer deregulierten Hyperproliferation von Blutgefäßen führt. Resultat ist eine Erblindung der Frühgeborenen (Neufeld et al. 1999). Ähnliche Verläufe nehmen auch die übrigen Retinopathien, bei denen die Pathogenese ebenfalls von einer Überexpression an VEGF nach Hypoxie ausgeht. Neben der Hyperproliferation von Gefäßen finden sich noch weitere Schäden, die durch eine VEGF- Überproduktion induziert sind: Neu geformte Blutgefäße in Wachtel- Embryonen zeigten unter VEGF- Expression unregulierte und exzessive Gefäßfusionen, die in vergrößerten Gefäßlumen resultierten (Drake et Little, 1995). 11

22 VEGF ist im Gegensatz zu den Mitgliedern der Familie der Fibroblastenwachstumsfaktoren, die mitogene Aktivität für ein breites Spektrum von Zielzellen besitzen, ein spezifisches Mitogen für Endothelzellen (Ferrara et al., 1992). Diese selektive Wirkung erklärt sich aus dem nahezu ausschließlichen Vorkommen von VEGF-Rezeptoren auf Endothelzellen (Ferrara et al., 1992). VEGF ist ein Glykoprotein von etwa 46 kda Molekülgröße, das als Homodimer sezerniert wird und strukturelle Verwandtschaft zu PDGF (Platelet derived growth factor) aufweist (Rieke et al., 2004; Conn et al., 1990). VEGF existiert in verschiedenen Homologen, VEGF-A bis -E, die von verschiedenen Genen des menschlichen Genoms kodiert werden (Rieke et al. 2004). Neben seiner Beteiligung an Vaskulogenese und physiologischer Angiogenese ist VEGF-A der am besten untersuchte Vertreter der angiogenen Wachstumsfaktoren (Rieke et al. 2004). VEGF-B bis -E sind nicht hypoxieinduzierbar (Goldberg et Schneider, 1994). VEGF-C und -D wirken auf vaskuläre und lymphatische Endothelzellen mitogen (Rieke et al., 2004). Im Gegensatz zu VEGF-A bis -D wurde VEGF-E bisher nur bei einem Virus nachgewiesen (Meyer et al., 1999). Das kleinste VEGF-A-Protein besteht aus 121 Aminosäuren, das größte aus 206 Aminosäuren. Die größte biologische und auch am besten untersuchte Wirksamkeit hat das VEGF-A mit 165 Aminosäuren (Clauss, 2000). Das angiogene Signal von VEGF aktiviert Endothelzellen über einen eigenen Rezeptor und überführt sie in ihren angiogenen Phänotyp (Rieke et al., 2004) VEGF-Rezeptor und intrazellulärer Signalweg Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor ist ein extrazellulärer Mediator, der an hochaffine membrangebundene Rezeptoren mit Tyrosinkinase-Aktivität bindet (Jakeman et al., 1992; Thieme et al., 1995). Bisher sind vier VEGF-Rezeptoren bekannt, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 und Neuropilin 1 (NRP-1) (Rieke et al., 2004). 12

23 Abbildung 3: Rieke et al. 2004, nach: VEGF- Receptor- Pathway, Hicklin DJ, Ellis LM. J Clin Oncol. 2005;23: Während VEGFR-1 und VEGFR-2 fast ausschließlich auf Blutgefäßendothelzellen zu finden sind, spielt VEGFR-3 eine wesentliche Rolle bei der Lymphangiogenese. VEGF Rezeptoren Funktion VEGF (VEGF-A) VEGFR-1,VEGFR-2, Neuropilin-1 Angiogenese Vaskuläre Wachstumsfaktoren VEGF-B VEGFR-1 Nicht bekannt VEGF-C VEGFR-2, VEGFR-3 Lymphangiogenese VEGF-D VEGFR-2, VEGFR-3 Lymphangiogenese VEGF-E (viral) VEGFR-2 Angiogenese Placental growth Factor (PlGF) VEGFR-1, neuropilin-1 Angiogenese Inflammation Tabelle 1: VEGF- Subtypen, Rezeptoren und Funktion 13

24 Die membrangebundenen Rezeptoren bestehen aus einem extrazellulären, einem transmembranösen und einem intrazellulären Anteil (Rieke et al. 2004). Mit dem kurzen transmembranösen Anteil wird sichergestellt, dass das Protein in der Zellmembran verankert ist. Bindet ein Ligand wie im Fall von VEGF als Dimer an die extrazelluläre Erkennungsstelle, lagern sich zwei Rezeptoren über bestimmte Erkennungssignale ihrer extrazellulären Domänen zusammen. Geschieht dies mit zwei gleichen Rezeptoren spricht man von einem Homodimer (Rieke et al., 2004). Es ist außerdem möglich, dass sich zwei unterschiedliche Rezeptoren, beispielsweise VEGFR-1 und VEGFR-2, nach Interaktion mit einem Liganden gruppieren. Die Bildung dieser Heterodimere kann Signalübertragung verhindern (Weiss et Schlessinger, 1998) und ist somit ein zusätzlicher Mechanismus, die Funktion einer Zelle zu steuern (Rieke et al., 2004). Hat sich ein signalisierendes Rezeptordimer nach Bindung eines Liganden gebildet, phosphorylieren enzymatische Anteile (Kinasen) eines Rezeptors intrazelluläre Tyrosinreste des jeweiligen Partnermoleküls. Diese führen zu einer Änderung des Funktionszustandes, was als der erste Schritt der intrazellulären Signalübertragung angesehen wird (Rieke et al., 2004) Auf dem Weg vom Rezeptor zur DNA oder der Zellmembran der Zielzelle läuft das Signal über eine Reihe von Signalträgern, die im wesentlichen Kaskaden von Phosphorylierungs- reaktionen darstellen (Rieke et al., 2004) 14

25 Abbildung 4: VEGF- Receptor- Pathway, Rini et al., 2005 Journal of Clinical Oncology VEGFR-1 Signalkaskade Eine Bindung von VEGF an den VEGFR- 1 Rezeptor induziert eine sensitive Autophosphorylierungskaskade, in deren Verlauf Proteinkinase C und mitogen aktivierte Protein Kinase phosphoryliert werden. VEGFR- 1 induziert durch diese Phosphorylierungskaskade den Plasminogen Aktivator von Urokinase Typ (upa), den Plasminogen Aktivator vom Gewebe Typ (tpa), Matrixmetalloproteinasen (MMP) und eine Freisetzung von Gefäßbett-spezifischen Wachtumsfaktoren (ResearchVEGF,2009; Ferrara, 2004; Park, Chen, Winer, 1994; Lesslie et al. 2006) VEGFR- 2 Signalkaskade Nach Bindung an VEGFR-2 wirkt VEGF hemmend auf die Apoptose (Akt; Bcl-2), aktiviert Migration (Proteinkinase C, Vinculin) oder beeinflusst die Transskription anderer Proteine, die an Gefäßwachstum beteiligt sind, wie beispielsweise VEGFR-1, 15

26 Matrixmetalloproteinasen (MMP), endothelzellspezifische NO-Synthetase (enos) (Rieke et al., 2004) VEGFR-3 Signalkaskade Nach Bindung an den VEGFR-3 Rezeptor induziert VEGF die Proliferation, Migration und Lymphangiogenese in lymphatischen Endothelzellen (ResearchVEGF, 2009) Dilatation existierender Gefäße, Anstieg der Permeabilität Nach einem angiogenen Stimulus ist Vasodilatation der erste Schritt der Angiogenese. Sie erfolgt hauptsächlich als Antwort auf Stickstoffmonoxid (NO). NO kann VEGF hoch- regulieren (Kimura et al., 2000), das seinerseits die Gefäßpermeabilität steigert (Dvorak et al., 1995). Die biologische Bedeutung der permeabilitätssteigernden Eigenschaft von VEGF liegt in der mikrovaskulären Extravasation von Blutplasmaproteinen. Auf diese Weise kommen Interaktionen zwischen induzierten Endothelzellproteinen und den als Folge der Hyperpermeabilität extravasierten Plasmaproteinen zustande, die perizelluläre Proteolyse und Endothelzelladhäsion steuern (Senger et al., 1996) (Rieke et al. 2004) Stickstoffmonoxid (NO) Funktionen von Stickstoffmonoxid (NO) Stickstoffmonoxid ist eine gasförmige Verbindung aus Sauerstoff und Stickstoff. Das Gas ist farbund geruchslos. Es handelt sich um eine hochreaktive Verbindung mit einer sehr kurzen Halbwertszeit. Die Halbwertszeit beträgt etwa 3-5 Sekunden (Marsden et Brenner, 1991). Damit ist sein Signalübertragungspotential auf nahe gelegene Zielmoleküle begrenzt. Gerade diese Kurzlebigkeit macht es aber zu einem geeigneten Signalüberträger innerhalb der Zelle oder zwischen benachbarten Zellen (Stryer, 2007), wobei es im Gegensatz zu klassischen Transmittern nicht in distinkten Quantitäten und lokal, sondern diffus und variabel ausgeschüttet wird. 16

27 Es besitzt spezifische (z.b. der Rezeptor von NO) und unspezifische Ziele und weist somit pleiotrope Effekte auf (Schmidt et Walter, 1994). Seit Erforschung des endothelium derived relaxing factors (EDRF) als vasoaktive Substanz im menschlichen Organismus und der Entdeckung, dass die beobachtete Vasodilatation durch die endogene Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO) ausgelöst wird (Furchgott et Zawadzki, 1980), ist die Untersuchung der Funktion von NO im Hinblick insbesondere auf physiologische Kaskaden des Herz-Kreislaufsystems Ziel von zahlreichen Studien (Langer et al., 2007). NO wird im Organismus aus der Aminosäure L-Arginin von einer Gruppe von Enzymen synthetisiert (NO-Synthasen, NOS) die als Isoenzyme in verschiedenen Organsystemen exprimiert werden und dort bestimmte Funktionen durch die Freisetzung von NO und Folgeschritte vermitteln (Langer et al., 2007). Somit spielt NO als ubiquitär vorkommendes Molekül eine wesentliche Rolle in der Signalübertragung von Organfunktionen (Langer et al., 2007). Im zentralen Nervensystem wird NO in Neuronen synthetisiert und dient als Neuromediator bei der Entstehung von Gedächtnis, der zentralen Kreislaufregulation und der Modulation von Schmerz (Garthwaite, 1991; Snyder et Bredt, 1992; Langer et al., 2007). NO, in Endothelzellen und Thrombozyten gebildet, inhibiert die Thrombozytenaggregation und adhäsion, inhibiert die Leukozytenadhäsion und beeinflusst das Wachstum glatter Muskelzellen (Moncada, Palmer, Higgs, 1990; Moncada, Palmer, Higgs, 1991; Moncada et Higgs, 1991; Moncada et Higgs, 1993; Moncada et Higgs, 2006; Langer et al., 2007). Im peripheren, autonomen Nervensystem wird der Tonus der glatten Muskulatur von Magen- Darm Trakt, Niere und Urogenitalsystem wesentlich durch die Freisetzung von NO beeinflusst (Gillespie et al., 1990; Reid et Rand, 1992; Toda, 1995; Okamura, Kimura, Toda, 1995; Langer et al., 2007). Im Immunsystem wirkt NO durch die Blockade von Enzymen in der Atmungskette von Bakterien und Tumorzellen zytostatisch und zytotoxisch und spielt damit eine wichtige Rolle in der Abwehr von Krankheitserregern (James et al., 1990; Nguyen et al., 1992; Langer et al., 2007). Vermittelt wird die Wirkung von NO über die Stimulation einer löslichen Guanylylcyclase (GC-S). GC-S katalysiert die Umwandlung von GTP zu cgmp. Das so entstandene cgmp wirkt als second messenger und aktiviert cgmp- abhängige Enzyme oder Ionenkanäle (Erler et al., 2001). Die Wirkung höherer NO-Konzentrationen, wie sie zum Beispiel durch aktivierte Makrophagen entstehen, werden cgmp-unabhängig vermittelt (Erler et al., 2001). 17

28 Synthese von NO NO wird enzymatisch aus L-Arginin freigesetzt. Bei den dafür verantwortlichen Enzymen handelt es sich um Dioxygenasen, die als NO- Synthasen (NOS) bezeichnet werden. Es lassen sich vier Isoformen der NOS unterscheiden: NOS-I NOS- II NOS- III mitochondriale NOS NOS- I und NOS- III sind konstitutive Enzyme und werden auch unter dem Begriff cnos zusammengefaßt.. Die Bildung von Stickstoffmonoxid wird induziert, indem auf einen Reiz hin auf der präsynaptischen Seite zweier miteinander kommunizierender Zellen L-Glutamat freigesetzt wird. Nach Diffusion durch den synaptischen Spalt bindet es auf der postsynaptischen Seite an N- methyl- D- Aspartat und bewirkt so die Öffnung spezifischer Kaliumkanäle (Garthwaite et al., 1988; Snyder, 1992). Die Bildung von NO im Nervensystem ist nicht ohne die Beteiligung von Calmodulin möglich, einem Cofaktor der NO- Synthase. Durch intrazelluläre Bindung des Calciums an Calmodulin entsteht ein aktivierter Ca- Calmodulinkomplex, der nun die NOS zur Bildung von Stickstoffmonoxid aus L- Arginin anregt. Dieses entsteht unter O2 und NADPH als Cofaktor und Bildung von Citrullin (Bredt et Snyder, 1992; Palmer et al., 1988; Wascher et al., 1997). Charakteristisch ist für die cnos somit die Aktivierbarkeit durch hohe intrazelluläre Ca2+-Ionen- Konzentrationen, die über die Bindung von Calmodulin am Enzym vermittelt wird (Prast et Philippu, 2001) Das Hauptprodukt, das durch die NOS gebildet wird, ist das Stickstoffmonoxid. Die NOS wandelt L-Arginin in NO und Citrullin um. Dabei werden Sauerstoff und NADPH Verbraucht (Erler et al., 2001). 18

29 NOS L-Arginin Calmodulin Ca NADP NO + Citrullin NADPH O2 Abbildung 5: Stickstoffmonoxid- Genese aus L- Arginin nach Erler et al Neben NO werden noch andere Stickstoffverbindungen aus L- Arginin gebildet: NO2, N2O2, NO2 Radikal. Gehemmt werden kann die Aktivität der NOS durch Strukturanaloga des Substrates L- Arginin. Durch die strukturelle Ähnlichkeit zu L-Arginin kommt es zu einer kompetitiven, reversiblen Hemmung des Enzyms (Erler et al., 2001). Zu solchen Hemmstoffen zählen unter anderem (Erler et al. 2001): Nω-Monomethyl-L-Arginin (=L-NMMA) Nω-Nitro-L-Arginin-Methylester Nω-Nitro-L-Arginin Nω-Methyl-L-Arginin (Valentin et al., 2004) Die NOS- I, auch als neuronale NOS oder nnos bezeichnet, kommt sowohl im zentralen als auch im peripheren Nervensystem, desweiteren auch in der Skelettmuskulatur vor (Valentin et al.,2004). Im Gehirn ist sie u.a. für das Verhalten und die Erinnerungsbildung zuständig. Im peripheren Nervensystem ist sie für die gastrointestinale Motilität verantwortlich und an neuroendokrinen Funktionen beteiligt. Im Skelettmuskel reguliert sie u.a. die Muskelkontraktilität (Valentin et al., 2004). Die zweite Isoform der cnos- Gruppe ist die NOS- III, auch als endotheliale NOS (enos) bezeichnet. Sie ist an den Golgi-Apparat und an die Caveolae vom Endothel gebunden und daher vorwiegend ortsständig. Ihre Aufgabe ist es, den vaskulären Tonus zu regulieren: 19

30 Aktivitätsänderungen des Gefäßtonus spiegeln Veränderungen der NO-Konzentration wider und stellen somit ein indirektes Maß der NO-Produktion dar (Valentin et al., 2004). Die enos steht bei vorliegender Arbeit besonders im Fokus, da sie vaskuläre Tonusveränderungen als Reaktion auf die retinale Ischämie anzeigt. Die dritte Isoform ist die NOS- II, die induzierbare NOS, kurz inos. Sie wird unter physiologischen Bedingungen nicht exprimiert. Eine Produktion erfolgt erst als Antwort auf inflammatorische Signale, wie z. B. Zytokin- oder Endotoxinfreisetzung. Sie ist in die Modulation der Entzündungsantwort eingebunden. Ihre Aktivität ist unabhängig von der zellulären Calmodulin-Konzentration, da sie selbst mit Calmodulin eine sehr feste Bindung eingeht (Valentin et al., 2004). Die Eigenschaften der einzelnen NOS-Formen sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst (nach Erler et al., 2001): Nachweis in Expression Regulation Aktivierungszeit NOS I u.a. Kleinhirn Konstitutiv (cnos) Ca 2+ Calmodulin Sekunden, Minuten NOS II Makrophagen induktiv (inos) Zytokine Stunden Granulozyten NOS III Endothel Konstitutiv (cnos) Ca 2+ Calmodulin Sekunden, Minuten Tabelle 2: Nitric Oxide Synthetasen, Funktion und Regulation enos Serin 116 Die NOS kann durch Phosphorylierung verschiedener Epitope in ihrer Aktivität beeinflusst werden: Serin 1177 (Ser1177), Threonin 495 (Thr495) und Serin 116 (Ser116). Die Regulation der enos über Ser1177-Phosphorylierung wird nach Ludolph durch die Proteinkinase A und die Proteinkinase C (PKC), die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK)53 sowie über die zyklische AMP-abhängige Proteinkinase54 modifiziert. Die enos ist unter basalen Bedingungen an Serinund Threoninresten schwach phosphoryliert (Ludolph, 2007). 20

31 Verschiedene Stimuli, wie z.b. Scherstress, bewirken eine verstärkte Phosphorylierung an Ser1177 und damit eine Aktivierung der enos. Die Phosphorylierung an Thr495 geht mit einer Abnahme der Enzymaktivität einher. Obwohl die Aktivierung der enos simultan mit Veränderungen der Phosphorylierung von Ser1177 und Thr495 einhergeht, gibt es zusätzliche Phosphorylierungswege des Enzyms: Ser116 ist an der Oxygenase-Domäne lokalisiert (Ludolph, 2007). Eine Phosphorylierung an Ser116 geht, wie auch bei Thr495, mit einer Abnahme der Enzymaktivität einher (Li et al., 2007)(Ludolph, 2007). Die am Serin 116 phosphorylierte enos ist in den Nervenfasern der Glandula palatina (Korkmaz Y et al., 2004) und im Plexus myentericus (Korkmaz H et al., 2007) nachgewiesen worden. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, eine etwaige Anwesenheit der enos Ser116 in den Neuronen der Retina nachzuweisen. Darüber hinaus sollen etwaige Veränderungen unter hypoxischen Bedingungen nach retinaler Ischämie skizziert werden. Die enos Ser116 hat somit im Rahmen der Auswertung der angewandten retinalen Ischämiemodelle nicht die basale Aufgabe die post- ischämischen Veränderungen zu validieren, sondern es soll zunächst die Anwesenheit in der Retina nachgewiesen werden. Etwaige postischämische Veränderungen sollen rein deskriptiv erfasst werden und nicht, wie die übrigen Antikörpernachweise und der Nachweis der NADPH- Diaphorase immunhistochemische semiquantitative Gradmesser pathologischer Veränderungen und Gewebereaktionen auf die retinale Ischämie sein NADPH Diaphorase Obwohl man mit immunhistochemischen Methoden (AK gegen NOS) im Gewebe die Zellen mit NOS- Aktivität nachweisen kann, stehen auch andere Methoden zur Verfügung. So werden bestimmte Nervenzellen des Cortex cerebri und der Basalganglien bei Zugabe des Farbstoffes Nitro- Tetrazoliumblau, eines gelben, gut wasserlöslichen Pulvers, und des enzymatischen Cofaktors NADPH, leuchtend blau, da eine Redox- Reaktion stattfindet (Pearce 1961) (Bergua et al. 1995). Der Farbstoff nimmt Elektronen auf, die frei werden, wenn Arginin oxidiert wird und NO entsteht, und wird zu einem unlöslichen Salz, welches blau wird, wenn es im Gewebe präzipitiert wird (Bergua et al. 1995). 21

32 Mittlerweile ist bekannt, dass die NADPH- Diaphorase ein wichtiger Co-Faktor der NOS ist (Bergua et al. 1995). Mehrere Studien zeigten, dass eine Übereinstimmung besteht zwischen Anwesenheit von NOS und der Lokalisation der NADPH- Diaphorase (Dawson et al 1991, Hope et al 1991). Somit ist es möglich, die Untersuchung der Lokalisation der NOS, in vorliegender Arbeit der enos, durch Anwendung histochemischer Verfahren zum Nachweis der NADPH- Diaphorase zu vereinfachen (Bergua et al. 1995) 1.6 Astrozyten und Glial fibrillary acidic protein (GFAP) Gliazellen werden in drei Kategorien eingeteilt: der epitheliale Typ, Neuroglia und periphere Glia. Ependymale Zellen und Zellen im Plexus choroideus gehören zum epithelialen Typ, Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikrogliazellen zu der Neuroglia und Schwann Zellen und Satellitenzellen zu der peripheren Glia (Magerkurth et al., 2003). Die Entdeckung von saurem glialen Faserprotein (GFAP) im Jahr 1971 durch Eng war ein Meilenstein in der weiteren Erforschung der Funktionen von Astrozyten. GFAP kommt nur in Astrozyten vor und ist ein wertvoller biochemischer Marker für deren Identifikation (Bignami et al., 1972). GFAP ist nur im zentralen Nervensystem lokalisiert (Bignami et al., 1972). Elektronenmikroskopische Studien fanden GFAP in glialen Filamenten, die sich im Zytoplasma von Astrozyten und anderen Typen von Gliazellen befinden (Bignami et al.,1977). GFAP kommt sowohl in protoplasmatischen, als auch in fibrösen Astrozyten vor (Bignami et al., 1972). Protoplasmatische Astrozyten enthalten wenig GFAP, fibröse hingegen enthalten im Zellkörper und in den Fortsätzen reichlich GFAP (Bignami et al., 1972). Deshalb wird GFAP als spezifischer Marker für Astrozyten angesehen und für das Studium von Astrozyten während der embryonalen Entwicklung und unter normalen und pathologischen Bedingungen herangezogen. (Magerkurth et al., 2003). Die Müller- Zellen der Retina gelten als Sonderform der Astrozyten und repräsentieren die Gliazellen der Netzhaut (Lüllmann- Rauch, 2003). Deshalb kann GFAP physiologisch in Müller- Zellen und retinalen Astrozyten nachgewiesen werden (Björklund et al., 1985). 22

33 Eine GFAP Expression wird darüber hinaus allerdings in erster Linie pathologischen Prozessen wie retinaler Degeneration zugeschrieben (Shaw et Weber, 1983; Osborne et al., 1991; Ekström et al.1988; Bignami et Dahl, 1979). Der positive immunhistochemische Nachweis von GFAP kann daher als Hinweis auf eine Aktivierung der Retina angesehen werden (Eisenfeld et al., 1984). Diese Aktivierung der Astroglia wird von einigen Autoren als Hinweis auf eine Müller- Zellschädigung der Retina interpretiert und dient damit der Beurteilung der Schädigung von Gliagewebe bei retinaler Ischämie, einer zentralen Fragestellung der vorliegenden Arbeit (Eisenfeld et al., 1984). 2 MATERIAL UND METHODIK 2.1 Versuchstiere und Haltungsstandard Die bei dieser experimentellen Arbeit verwendeten Versuchstiere waren ausschließlich gesunde Han- Wistar Ratten, die im Tierstall des Instituts I für Anatomie gehalten wurden. Die Tierhaltung erfolgte unter konstanten Bedingungen bei einer Raumtemperatur von 23 C*± 2 C. Um einen künstlichen Tag-/ Nachtrhythmus zu erzeugen, erfolgte zwölfstündig ein Wechsel zwischen Hellund Dunkelperioden. Jeweils zwei Ratten wurden zusammen in einem Standardrattenkäfig gehalten, der mit Sägemehleinstreu (Animal Beding Granular Fa. Altromin, Lage, Deutschland) bestückt war. Die Fütterung bestand aus einer Standardrattendiät (Altromin 1324 Standarddiät Fa. Altromin, Lage, Deutschland). Die Tiere, welche für die vorliegende Untersuchung verwendet wurden, hatten ein Körpergewicht zwischen 400 g und 500 g, das Alter der Tiere lag zwischen 16 und 28 Wochen. 2.2 Operationsverfahren Versuchsaufbau Um die Ischämien für sämtliche Tiere definiert durchzuführen, wurde ein OP- Tisch konstruiert. Die Körpertemperatur der Tiere wurde während der Narkosephase durch eine Wärmelampe konstant gehalten. Der Sauerstoff wurde über Schläuche aus einer 10l Flasche O 2 zum OP-Tisch geleitet, an deren Ende ein Aufsatz befestigt war, aus dem die Tiere nasal O 2 und das Narkosegas 23