Gut Defense Mechanisms in the Fight against Salmonella Typhimurium

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1 DISS.ETH Nr Gut Defense Mechanisms in the Fight against Salmonella Typhimurium A dissertation submitted to the ETH Zurich for the degree of Doctor of Sciences presented by Kathrin Barbara Endt Master of Science, Biochemistry, Technical University of Munich Born on April 2th, 1982 in Augsburg, Germany Accepted on the recommendations of Prof. Dr. Wolf-Dietrich Hardt Prof. Dr. Annette Oxenius Prof. Dr. Andrew Macpherson Zurich, 2010

2 Thesis summary S. Typhimurium can induce potent gut inflammation via its sophisticated set of virulence factors. As a consequence of S. Typhimurium intestinal invasion, host defense mechanisms are induced. The host mucosal immune system and the gut microbiota provide mechanisms to fight S. Typhimurium inflicted disease. Here, the streptomycin mouse model provides a powerful system to study the course of S. Typhimurium induced gut infection (colitis). To date, the importance of Lipopolysaccharide (LPS), a major surface component of gramnegative bacteria, for Salmonella virulence has been discussed controversially. Hence, we were interested to study the role of S. Typhimurium LPS O side-chains for triggering intestinal inflammation in streptomycin-pretreated mice. We showed that a LPS O antigen deficient S. Typhimurium strain (ΔwbaP) was attenuated in a competitive mouse infection experiment compared to wild type S. Typhimurium. This reduced competitive fitness of the ΔwbaP mutant was explained by a reduced resistance to antimicrobial peptides and impaired motility. The latter is crucial for S. Typhimurium to colonize the intestine under inflamed conditions. However, the induction of an acute intestinal inflammation upon infection with the ΔwbaP strain was not impaired in streptomycin-pretreated mice The in vitro invasion efficiency was even enhanced. The results indicated that the presence of complete LPS is neither essential for in vitro invasion of S. Typhimurium nor for triggering an acute colitis in vivo. So far, the importance of mucosal defense mechanisms such as secretory antibodies (siga) and a complex microbial community for S. Typhimurium inflicted disease remains still unclear. We developed an experimental setup based on the streptomycin mouse model to study the termination of acute intestinal inflammation, pathogen clearance from the gut lumen and induction of a protective humoral immunity upon S. Typhimurium infection. We revealed that the intestinal microbiota and the adaptive immune system hold complementary functions in fighting S. Typhimurium induced gut infections. Our data showed that a primary S. Typhimurium infection elicits Salmonella specific siga, which prevents disease when animals are infected with S. Typhimurium for a second time. However, a T-cell dependent, adaptive mucosal siga response was dispensable for resolving the initial inflammatory response to S. Typhimurium and was not sufficient for clearing the pathogen from the intestinal lumen. Instead, pathogen clearance was mediated by the microbiota, since the gut commensals re-established their normal density and composition after streptomycin treatment and thereby eliminated persistent S. Typhimurium from the gut lumen. Hence, the microbiota clears the pathogen from the gut lumen, while siga protects from disease upon reinfection with the same pathogen. 7

3 Epidemiological studies suggested that antibiotic-treatment increases the risk of long term "asymptomatic Salmonella excretors". However, randomized controlled clinical trials are not available to guide a decision whether patients with Salmonella diarrhea should be subjected to antibiotic therapy. Hence, we characterized the effects of two antibiotics, ciprofloxacin and Rocephin on the incidence, intensity and duration of pathogen excretion in S. Typhimurium infected mice. Antibiotic therapy significantly reduced S. Typhimurium excretion, duration of acute intestinal inflammation and did not interfere with the generation of a Salmonella specific humoral immune response. Nevertheless, asymptomatic pathogen excretion was in general not prevented by antibiotics. Our data reveal a fine line between benefits (alleviated pathogen excretion and cessation of inflammation) and disadvantages (loss of protection after re-infection, asymptomatic pathogen excretors) of antibiotics. Several evidences imply a key role of Interleukin 17 (IL-17) signaling in S. Typhimurium diarrhea, since IL-17A and IL-17F are strongly induced in a Salmonella infected gut. However, the role of those cytokines for the generation of an adaptive immune response has not been analyzed in detail for S. Typhimurium induced infections. Hence, we studied the impact of IL17 signaling for the generation of a protective mucosal immune response in S. Typhimurium inflicted disease. The induction of a Salmonella specific humoral immune response was not impaired in IL17ra -/- or IL17a -/- mice. All knockout animals were protected from disease after re-infection with S. Typhimurium. Hence IL-17A and IL-17F signaling seemed to be negligible for the development of a protective mucosal immunity upon a primary infection with S. Typhimurium. In conclusion, S. Typhimurium virulence is enhanced but not strictly dependent on full length LPS O side-chains. However, LPS O side-chains are a key structure recognized by the mucosal immune system, since protection from disease is mediated by secretory IgA specific for the LPS O side-chains. The induction of a protective humoral immunity upon S. Typhimurium infection and pathogen clearance from the gut lumen seemed to be independent of IL17 cytokines. Instead, elimination of S. Typhimurium from the intestine is mediated by a complex microbial community. Furthermore, antibiotic therapy alleviates pathogen excretion and reduces acute gut inflammation but does not prevent asymptomatic pathogen excretion in general. A combination of antibiotics with potential probiotics might be an option to prevent asymptomatic carriers in the future. 8

4 Zusammenfassung S. Typhimurium kann eine starke Entzündungen des Magen-Darm-Traktes hervorrufen, indem es sein raffiniertes Set an Virulenz-Faktoren einsetzt. In Folge des Eindringens von S. Typhimurium in das Darmgewebe werden körpereigenen Abwehrmechanismen induziert. Das körpereigene Darm- Immunsystem und die Darmflora bieten Mechanismen, die zur Bekämpfung von S. Typhimurium induzierten Erkrankungen beitragen. Hierzu bietet das Streptomycin-Maus-Modell ein brillantes System, um den Verlauf von Darm-Entzündungen (Kolitis), die durch S. Typhimurium hervorgerufen werden, zu analysieren. Bislang wurde der Einfluss von Lipopolysaccharid (LPS), eine der häufigsten Oberflächen- Komponenten von gram-negativen Bakterien, auf die Virulenz von Salmonellen kontrovers diskutiert. Daher waren wir daran interessiert herauszufinden, welche Rolle S. Typhimurium O-Seitenketten für das Auslösen einer Darm-Entzündung in Streptomycin vorbehandelten Mäusen hat. Wir konnten zeigen, dass ein S. Typhimurium Stamm, dem das O Antigen (ΔwbaP) fehlt, in einem Infektionsexperiment in dem beide Stämme in Konkurrenz getestet wurden, im Vergleich zum wildtyp S. Typhimurium Stamm attenuiert war. Die eingeschränkte Wettberwerbsfähigkeit des ΔwbaP Stammes konnte durch die verminderete Resistenz gegen antimiktobielle Peptide und Eingeschränkungen in der Fortbewegung erklärt werden. Letzteres ist für S. Typhimurium von Bedeutung, um den Darm unter Entzündungs-Bedigungen zu besiedeln. Allerdings konnte der ΔwbaP Stamm eine akute Darm-Entzündung in Streptomycin vorbehandelten Mäusen auslösen, und besaß sogar einer erhöhte Effizienz, um in Zellen (in vitro) einzudringen. Diese Daten zeigten, dass die komplette Struktur von LPS weder für das Eindringen von S. Typhimurium in Zellen (in vitro), noch für das Auslösen einer akuten Darmentzündung in vivo notwendig war. Bislang war der Einfluss von Abwehrstrategien des Darms, wie sekretierte Antikörper (SIgA) und eine komplexe Darmflora, für eine durch S. Typhimurium ausgelöste Erkrankung, unklar. Basierend auf dem Streptomycin-Maus-Modell haben wir einen Versuchs-durchführung geplant, um das Abklingen der akuten Darmentzündung, die Eliminierung des Erregers vom Darm-Lumen und das Auslösen einer auf Antikörper basierenden, schützenden Immunität während einer S. Typhimurium Infektion zu analysieren. Wir konnten deutlich machen, dass die Darmflora und das erworbene Immunsystem einander ergänzende Funktionen bei der Bekämpfung einer von S. Typhimurium hervorgerufenen Darm-Entzündungen haben. Unsere Daten zeigten, dass eine erste Infektion mit S. Typhimurium eine Salmonellen spezifische siga Antwort auslöst, welche die Tiere vor einer Erkrankung nach erneutem Kontakt mit S. Typhimurium schützt. Allerdings war eine T-Zell abhängige, erworbene Darm-sIgA-Antwort nicht notwendig für das Abklingen der akuten Entzündung und nicht ausreichend für die Eliminierung des Erregers aus dem Darm. In der Tat war die Pathogen- 9

5 Eliminierung die Aufgabe der Darmflora, die sich nach der Streptomycin Behandlung erneut im Darm ansiedelte, ihre ursprüngliche Dichte und Zusammensetzung wiedererlangte und somit persistierende S. Typhimurium aus dem Darm verdrängte. Folglich eliminiert die Mirofora den Erreger aus dem Darm, während siga vor Erkrankung nach erneutem Kontakt mit dem gleichen Erreger schützt. Epidemiologische-Studien wiesen darauf hin, dass eine Antibiotika-Behandlung das Risiko für die Ausbildung von Langzeit-asymptomatischen Salmonellen-Ausscheidern erhöht. Allerdings, stehen derzeit keine kontrollierten, randomisierten klinischen Studien zu Verfügung, die eine Entscheidung ermöglichen, ob Patienten die an Durchfall durch Salmonellen erkrankt sind, sich einer Therapie mit Antibiotika unterziehen sollen. Daher haben wir die Wirkung von zwei Antibiotika, Ciprofloxacin und Rocephin, auf die Inzidenz, Intensität und Dauer der Erreger-Ausscheidung in S. Typhimurium infizierten Mäusen getestet. Eine Therapie mit Antibiotika verminderte die Ausscheidung von S. Typhimurium, reduziert das Anhalten der Darmentzündung signifikant und hatte keine Auswirkungen auf die Ausbildung einer Salmonellen spezifischen Antikörper-Antwort. Nichtsdestoweniger war eine asymptomatische Ausscheidung des Erregers nicht gänzlich durch Antibiotika unterbunden. Diese Daten zeigen den schmalen Grad der zwischen Vorteilen (verminderte Erreger-Ausscheidung und Genesung der Entzündung) und Nachteilen (Abwesenheit von Schutz und asymptomatische Erreger- Ausscheidung) von Antibiotika liegt. Einige Anhaltspunkte belegen, dass Interleukin-17 (IL-17) vermittelte Signale eine Schlüsselrolle bei S. Typhimurium ausgelösten Durchfallerkrankungen spielen, da IL-17A und IL17F häufig in einem Salmonellen infizierten Darm vorkommen. Allerdings ist die Rolle dieser Zytokine für die Generierung einer erworbenen Immunantwort bei einer durch S. Typhimurium ausgelösten Erkrankung noch weitestgehend unbekannt. Daher haben wir den Einfluss von IL-17 Signalen für die Entwicklung einer schützenden, erworbenen Immunantwort während einer S. Typhimurium Infektion analysiert. Die Induktion einer Salmonellen spezifischen Antikörper Antwort war weder in IL17ra -/- noch in IL17a -/- Mäusen eingeschränkt. Alle knockout Tiere waren vor einer Erkrankung nach erneutem Kontakt mit S. Typhimurium geschützt. Demzufolge schien es, dass IL17A und IL-17F Signale nicht wichtig für die Entwicklung einer schützenden Darm-Immunantwort sind. Zusammenfassend ist die Virulenz von S. Typhimurium verstärkt, aber nicht grundsätzlich abhängig von der kompletten Struktur von LPS. Allerdings ist die LPS O-Seitenkette eine Hauptstruktur, die vom Darm-Immunsystem erkannt wird, da sekretiertes IgA, das spezifisch LPS O- Seitenketten erkennt, Schutz vor einer Erkrankung bietet. Die Induktion einer schützenden Antikörper Antwort nach einer S. Typhimurium Infektion und die Verdrängung von S. Typhimurium aus dem Darm schien nicht abhängig von IL17 Zytokinen zu sein. Stattdessen, war eine komplexe Zusammensetzung der Darmflora für die Eliminierung von S. Typhimurium aus dem Darm nötig. 10

6 Ferner verringert eine Antibiotikatherapie eine Erreger-Ausscheidung und vermindert eine Darmentzündung, aber schützt nicht generell vor einer Langzeit-Ausscheidung des Erregers. Eine Kombination von Antibiotika mit potentiell wirksamen Probiotika wäre eine Strategie um in Zukunft asymptomatische Ausscheider zu verhindern. 11