Umweltforschungsplan des Bundesministeriums für Umwelt, Naturschutz und Reaktorsicherheit. Innenraum. Förderkennzeichen (UFOPLAN) /03

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1 Umweltforschungsplan des Bundesministeriums für Umwelt, Naturschutz und Reaktorsicherheit Innenraum Förderkennzeichen (UFOPLAN) /03 Standardisierung von Nachweismethoden für Schimmelpilze im Innenraum zur Vorbereitung von bundesweiten Ringversuchen von Dr. Thomas Gabrio Dr. Ingrid Dill, Dr. Christoph Trautmann Landesgesundheitsamt Baden- Württemberg Umweltmykologie GbR Berlin Präsident Dr. Jürgen Wuthe Dr. Ingrid Dill, Dr. Christoph Trautmann IM AUFTRAG DES UMWELTBUNDESAMTES Dezember 2003

2 Die Etablierung und Ausrichtung der Ringversuche erfolgte unter Mitarbeit folgender Referenzlabore: Herr Dr. Seidl, (vorläufiger wissenschaftlicher Koordinator) Lehrstuhl für Mikrobiologie, Klinik für Dermatologie und Allergologie, TU München, München Frau Dr. Dill, Herr Dr. Trautmann, Umweltmykologie GbR, Berlin Herr Dr. Fischer, Institut für Hygiene und Umweltmedizin - Klinikum Aachen, Aachen Herr Dr. Gabrio, Frau Weidner, Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg, Stuttgart Herr Dr. Grün, Eco-Luftqualität + Raumluft, Köln Herr Dr. Rabe, Labor Dr. Rabe, Essen Herr Dr. Samson, Frau Dr. Hoekstra CBS, 3908 AD Utrecht, Niederlande Herr Dr. Warscheid, MPA Bremen, Bremen Impressum Referat 14 Wiederholdstraße Stuttgart Tel.: 0711/ Fax: 0711/ gabrio@lga.bwl.de 2

3 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 16 2 Validierung der Luftkeimsammlung durch Filtration Problemstellung Validierung des physikalischen Abscheideverhaltens von Schimmelpilzsporen aus der Luft auf Filtern Einfluß der Meßgeometrie Material und Methode Ergebnisse Einfluss des Filtermaterials Material und Methode Ergebnisse Einfluss der Art der Probenahme (Impaktion Filtration) Material und Methode Ergebnisse Anpassung der Probenahme gemäß VDI 4252 Blatt 2 an Fragestellungen des Innenraumbereichs und Optimierung der Probenahme Material und Methode Ergebnisse Diskussion Validierung der Gesamtzellzahl/Gesamtsporenuntersuchung Problemstellung Partikelverteilung auf der Sammeloberfläche Material und Methode Beschreibung des verwendeten Sammlers und der Routineauswertung Vorgehensweise und Auswertung Ergebnisse Statistische Auswertung der Sporenverteilung Material und Methode 60 3

4 3.3.2 Ergebnisse Vergleich der Ergebnisse von 9 Partikelsammlungen Material und Methoden Ergebnisse Partikelabscheidung Material und Methode Ergebnisse Partikelabscheidung auf alternativem Sammelmedium Material und Methode Ergebnisse Vergleich Gesamtsporen und KBE Markierung von impaktierten Partikeln Material und Methode Lichtmikroskopie Fluoreszenzmikroskopie Ergebnisse Lichtmikroskopie Fluoreszenzmikroskopie Diskussion 77 4 Validierung Staubprobenahme Problemstellung Material und Methode Geräte Vorgehensweise Ergebnisse Diskussion Materialuntersuchung Problemstellung 104 4

5 5.2 Pilzablösung vom Material Vergleich von schonenden und intensiven Schüttelverfahren sowie der Kombination mit Ultraschall Material und Methode Ergebnisse Einfluss der Materialzerkleinerung Material und Methoden Ergebnisse Vergleich Schikanekolben und Waring Blender Material und Methoden Ergebnisse Besiedelung von Materialien Material und Methoden Ergebnisse Diskussion Materialproben für den Ringversuch Vergleich von 10 Verdünnungsuntersuchungen Lagerungsversuche Material und Methode Ergebnisse Gesamtzellzahlbestimmung an Materialproben Problemstellung Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung an Reinkulturen Material und Methoden Ergebnisse Anfärbung unterschiedlicher Pilze mit Fluoreszenzfarbstoffen Markierungen mit Acridinorange Markierungen mit DAPI 151 5

6 Markierungen mit Calcofluorweiß Markierung mit Acridinorange an natürlichen Proben Material und Methode Ergebnisse Diskussion Ringversuch Differenzierung von innenraumrelevanten Schimmelpilzen Problemstellung Ringversuch Differenzierung von innenraumrelevanten Schimmelpilzen auf der Basis von Reinkulturen Material und Methode Interne Qualitätssicherung Organisation und Versand Ergebnisse Ringversuch Differenzierung von innenraumrelevanten Schimmelpilzen auf der Basis von realen Proben Material und Methode Luftproben Staubproben Validierung der Vorentwürfe der VDI-Richtlinie 4252 und VDI-Richtlinie 4253 durch den Austausch real gewonnener Proben Ergebnisse Diskussion Weiterer Forschungsbedarf Gesamtabschlußdiskussion Literatur Anhang 206 6

7 Verzeichnis der Abbildungen Abb. 1: Probensammler - Filteradapter mit Einwegfiltereinheit und rotationssymmetrischem Vorabscheider Abb. 2: Hängender Probenahmekopf nach VDI-Richtlinie 4252 [10] Abb. 3: Filterkombination zur Überprüfung des Sammelstresses Abb. 4: Isokinetischer Messkopf Abb. 5: quasi isokinetischer Messkopf für Impaktor Abb. 6: Einfluß von Temperatur und Zeit auf den Sammelstreß Abb. 7: Verteilung von 214 Sporen von Chaetomium sp. über die gesamte Partikelspur Abb. 8: Verteilung von Sporen von Stachybotrys chartarum über die gesamte Partikelspur Abb. 9: Verteilung von Sporen vom Typ Aspergillus/Penicillium über die gesamte Partikelspur. Abb. 10: Verteilung der von 144 Sporen vom Typ Aspergillus/Penicillium über die gesamte Partikelspur Abb. 11: Sammeleffizienz von Sporen vom Typ Aspergillus/Penicillium. Dargestellt ist der Anteil der durch den Partikelsammler zurückgehaltenen KBE in Bezug zur KBE-Konzentration der Probeluft. Abb. 12: Sammeleffizienz von Sporen von Cladosporium. Dargestellt ist der Anteil der durch den Partikelsammler zurückgehaltenen KBE in Bezug zur KBE- Konzentration der Probeluft. Abb. 13: Ergebnisse von Gesamtsporenauswertungen sowie der korrespondierenden KBE-Bestimmungen nach der Partikelabscheidung und in der Raumluft Abb. 14: Filterhalter zur Staubprobenahme gemäß VDI 4300, Blatt 8, Messen von Innenraumluftverunreinigungen-Probenahme von Hausstaub Abb. 15: Spezialsiebsatz 7

8 Abb. 16: Einfluss der Siebzeit auf die aus einer Probe ausgesiebte Menge Staub Fraktion < 63µm Abb. 17: Räumliche Verteilung der Bodenstaubbelastungen in einem Büro Abb. 18: Zusammenhang zwischen dem Gewicht des Gesamtstaubes und dem Gewicht der < 63 µm-fraktion Abb. 19: Zusammenhang zwischen der KBE-Zahl des Gesamtstaubes und der KBE-Zahl der 63 µm-fraktion Abb. 20: Zusammenhang zwischen dem Gewicht der < 63 µm-fraktion in [g] und der KBE-Zahl Abb. 21: Zusammenhang zwischen dem Gewicht des Gesamtstaubs in [g] und der KBE-Zahl Abb. 22: Prozentualer Anteil der KBE von Aspergillus versicolor bei unterschiedlichen Ablösungsverfahren und Materialien im Vergleich zur Ausgangskonzentration Abb. 23: Prozentualer Anteil der KBE von Engyodontium album bei unterschiedlichen Ablösungsverfahren und Materialien im Vergleich zur Ausgangskonzentration Abb. 24: Prozentualer Anteil der KBE von verschiedenen Pilzarten in Pressspan bei unterschiedlichen Ablösungsverfahren im Vergleich zur Ausgangskonzentration Abb. 25: Konzentrationsveränderungen von Aspergillus versicolor nach einer Materialzerkleinerung von 1 cm auf 0,5 cm (GB = Gasbeton; PS = Pressspan; S = Styropor) Abb. 26: Einfluss der Materialzerkleinerung auf die KBE-Konzentration von A. versicolor und E. album im Gasbeton Abb. 27: Prozentualer Anteil der gemittelten Sporenkonzentrationen im Schikanekolben im Vergleich zum Waring Blender Abb. 28: Konzentrationsverlauf von Aspergillus versicolor in Gasbeton (GB), Styropor (ST) und Kalksandstein (KS) 8

9 Abb. 29: Konzentrationsverlauf Engyodontium album in Gasbeton (GB), Styropor (ST) und Kalksandstein (KS) Abb. 30: Prozentualer Teilnahmeerfolg des Ringversuches Abb. 31: Prozentualer Anteil der Labore, die den Ringversuch bestanden haben Abb. 32: Vergleich der Streuung Referenzlabore - Ringversuchteilnehmer 9

10 Bild. 1: Pressspanblock mit starker Schimmelpilzentwicklung Bild 2: Aufgebrochener Pressspanblock mit starker Schimmelpilzentwicklung Bild 3: Mit Schimmelpilzen bewachsener Kalksandsteinblock, bei dem für eine Tiefenuntersuchung eine ca. 2 cm dicke Schicht abgetrennt wurde. Bild 4: Mit Schimmelpilzen bewachsener Gasbetonblock Bild 5: Mit Schimmelpilzen bewachsener Styroporblock Bild 6: Acridinorange-Markierung von Aspergillus versicolor (1000fach) Bild 7: Aspergillus versicolor, Durchlicht (1000fach) Bild 8: Acridinorange-Markierung von Chaetomium sp. und Scopulariopsis sp. (400fach) Bild 9: Chaetomium sp. und Scopulariopsis sp., Durchlicht (400fach) Bild 10: DAPI-Markierung von A. niger (1000 fach) Bild 11: A. niger, Durchlicht (1000fach) Bild 12: DAPI-Markierung von Ulocladium sp. (1000fach) Bild 13: Ulocladium sp., Durchlicht (1000fach) Bild 14: Calcofluorweißmarkierung von Chaetomium sp., Scopulariopsis sp. und Penicillium sp., Durchlicht (400fach) Bild 15: Chaetomium sp, Scopulariopsis sp. und Penicillium sp., Durchlicht (400fach) Bild 16: Markierung von Sporen vom Typ Aspergillus/Penicillium mit Acridinorange (1000fach) Bild. 17: Durchlichtbild zu Bild 16. In den mineralischen Flocken sind Sporen vom Typ Aspergillus/Penicillium enthalten, die im Durchlicht schwierig zu sehen sind 10

11 Verzeichnis der Tabellen Tab. 1: Einfluß der Messgeometrie auf das abgeschiedene Staubgewicht bei der Filtration Tab. 2: Einfluß der Ansaugrichtung auf das physikalische Abscheideverhalten der Sporen bezogen auf die ermittelte Gesamt-Konzentration kultivierbarer Schimmelpilze Tab. 3: Vergleich der Probenahme ohne und mit rotationssymmetrischem Vorabscheider Tab. 4: Vergleich der Wiederfindung auf Polycarbonat- und Gelatinefiltern (ausgestanzte Filter mit 8 cm Durchmesser, die mittels einer MVS-Pumpe mit 2,3m 3 /h beaufschlagt wurden) Tab. 5: Einfluß des Filtermaterials auf die Ab- und Auflösung (Wasserbad 30min) Tab. 6: Einfluß der Probenvorbereitung auf die Ab- und Auflösung Tab. 7: Einfluss des Stützsiebes auf die Untersuchung Tab. 8: Einfluss des Auflösungsvolumens auf die Untersuchung Tab. 9: Einfluß der Kultivierungsbedingungen auf die Gesamt KBE-Zahl Tab. 10: Vergleich der indirekten mit der direkten Probenahme N=17 Tab.11: Tageszeitliche Abhängigkeit der Schimmelpilzkonzentration in der Luft zwischen 8:00 16:00 Uhr Tab. 12: Vergleich der Probenahme Impaktion/Filtration Angegeben ist der Quotient der Konzentration aller nachgewiesenen Schimmelpilze einer Art mit Impaktion (MAS 100) zu Filtration (MD 8) Tab. 13: Vergleich der Ergebnisse der Luftkeimsammlung mit 2 Impaktoren in 13 Wohnungen Tab. 14: Vergleich Gesasmt-KBE bei Impaktion (Kurzzeitmessung) mit Filtration (Langzeitmessung) mit MVS und PVS-Filtergerät bei 7 Messungen Tab. 15: Verhältnis der mittels Gelatine-Filter bzw. der Filterkombination Gelatine/Polycarbonat bestimmten Schimmelpilzkonzentration Tab. 16: Einfluß des Filterhalters auf die Streuung der Ergebnisse bei der Probenahme mit dem Kleinfiltergerät 11

12 Tab. 17: Modelluntersuchungen zum Einfluß der Temperatur und der Zeit auf die Kultivierbarkeit Tab. 18: Untersuchungen zum Einfluß der Zeit auf die Kultivierbarkeit Tab. 19: Sporengesamtzahl und Sporenzahl je mittlerer Sammelfläche und je Kantenflächen einschließlich deren prozentualem Anteil an der Gesamtzahl Tab. 20: Statistische Konzentrationsermittlung von Chaetomium sp. anhand von 5, 10, 20 bzw. 30 Teilauswertungen der mittleren Sammelfläche. Angegeben sind die berechneten Sporenkonzentrationen pro 200 l Luft. Die Auszählung ergab 214 Sporen. Tab. 21: Statistische Konzentrationsermittlung von Stachybotrys chartarum anhand von 5, 10, 20 bzw. 30 Teilauswertungen der mittleren Sammelfläche. Angegeben sind die berechneten Sporenkonzentrationen pro 200 l Luft. Die Auszählung ergab Sporen. Tab. 22:Statistische Konzentrationsermittlung von Sporen vom Typ Aspergillus/Penicillium anhand von 5, 10, 20 bzw. 30 Teilauswertungen der mittleren Sammelfläche. Angegeben sind die berechneten Sporenkonzentrationen pro 200 l Luft. Die Auszählung ergab Sporen. Tab. 23: Statistische Konzentrationsermittlung von Sporen vom Typ Aspergillus Penicillium anhand von 5, 10, 20 bzw. 30 Teilauswertungen der mittleren Sammelfläche. Angegeben sind die berechneten Sporenkonzentrationen pro 200 l Luft. Die Auszählung ergab 144 Sporen. Tab. 24: Ergebnisse von 9 aufeinanderfolgenden Sammlungen Tab. 25: KBE Konzentrationen (100l) der Gattungen Aspergillus/Penicillium und Cladosporium in der Raumluft und auf dem Gelatinefilter nach der Partikelabscheidung. Mittelwerte aus 3 Sammlungen Tab. 26: Sammeleffizienz von Cladosporium-Sporen in Abhängigkeit von der Objektträgerbeschichtung und vom Volumenstrom Tab. 27: Sammeleffizienz von Sporen vom Typ Aspergillus/Penicillium in Abhängigkeit von der Objektträgerbeschichtung und vom Volumenstrom Tab. 28: Abhängigkeit der Standardabweichung von der Sporenbelegungsdichte Tab. 29: Vor- und Nachteile der verschiedenen Verfahren zur Staubprobenahme Tab. 30: Vor und Nachteile der verschiedenen Verfahren zur Staubprobenaufarbeitung 12

13 Tab. 31: Untersuchung der Wiederfindung in Abhängigkeit von der Art des Teppichs Tab. 32: Einfluss des Siebens auf die im Bodenstaub nachweisbaren Schimmelpilze bei 7 Staubproben Tab. 33: Räumliche Verteilung der Bodenstaubbelastungen in einem Büro (siehe Abb. 17) Tab. 34: Ausgangskonzentrationen und Konzentrationserhöhungen nach zweiter Behandlung von Aspergillus versicolor und Engyodontium album im Gasbeton Tab. 35: Mittlere Sporenkonzentration der Ansätze [n = 3] sowie die prozentuale Standardabweichung und das prozentuale Verhältnis der KBE-Konzentrationen der Ansätze im Schikanekolben zu denen im Waring-Blender Tab. 36: Konzentrationen von Aspergillus versicolor in unterschiedlichen Tiefen von Gasbeton, Styropor und Kalksandstein (Angaben in KBE/g) Tab. 37: Konzentrationen von Engyodontium album in unterschiedlichen Tiefen von Gasbeton, Styropor und Kalksandstein (Angaben in KBE/g) Tab. 38: KBE-Bestimmung von 10 mit verschiedenen Pilzen inokulierten Pressspanproben Tab 39: KBE-Vergleich von 10 Materialproben nach Lagerung Tab. 40: Verwendete Fluoreszenzfarbstoffe Tab.41: Anregungs und Emissionsmaxima der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe Tab. 42: Verwendete Fluoreszenzfiltersätze für die Auflichtmikroskopie am Zeiss Axiolab-Mikroskop Tab. 43: Anfärbung verschiedener Pilzarten mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen Tab. 44: Markierung an Conidien von A. niger nach unterschiedlicher Fixierung Tab.: 45: KBE- und Sporenkonzentrationen von Materialsuspensionen Tab. 46: Liste von Schimmelpilzen die häufig im Innenraumbereich anzutreffen sind Tab. 47: Ringversuchskulturen des Ringversuches 13

14 Tab. 48: Statistische Auswertung des 1.Ringversuches (Punktzahl speziesbezogen) Tab. 49: Statistische Auswertung des 2. Ringversuches (Punktzahl speziesbezogen) Tab. 50: Statistische Auswertung des 3. Ringversuches (Punktzahl speziesbezogen) Tab. 51: Statistische Auswertung des 4. Ringversuches (Punktzahl speziesbezogen) Tab. 52: Auswertung aller Ringversuche Innenraumrelevante Schimmelpilze - Reinkulturen Tab. 53: Auswertung einer realen Innenraumluftprobe Tab. 54: Auswertung einer realen Außenluftprobe Tab. 55: Ringversuch Innenraumrelevante Schimmelpilze reale Staubprobe Tab. 56: Ergebnisse der Streuung der 10-fach-Bestimmung einer Probe eines Labors Tab. 57: Anteil der 35 von 65 Laboren, die an dem Ringversuch reale Staubprobe teilgenommen und die Kriterien erfüllt haben Tab. 58: Austausch realer Luftproben, beaufschlagt und untersucht gemäß Vorentwürfe der VDI-Richtlinie 4252/4253 Tab. 59: Austausch realer Luftproben, beaufschlagt und untersucht gemäß Vorentwürfe der VDI-Richtlinie 4252/4253 Tab. 60: Einfluß der Messgeometrie auf das abgeschiedene Staubgewicht bei der Filtration Tab. 61: Einfluß der Ansaugrichtung auf das physikalische Abscheideverhalten der Sporen bezogen auf die ermittelte Gesamt-Konzentration kultivierbarer Schimmelpilze Tab. 62: Vergleich der Probenahme ohne und mit rotationssymmetrischem Vorabscheider Tab. 63: Vergleich der Wiederfindung auf Polycarbonat- und Gelatinefiltern Tab. 64: Einfluß des Filtermaterials auf die Ab- und Auflösung (Wasserbad 30min) 14

15 Tab. 65: Einfluß der Probenvorbereitung auf die Ab- und Auflösung Tab. 66: Vergleich der indirekten mit der direkten Probenahme Tab. 67: Tageszeitliche Abhängigkeit der Schimmelpilzkonzentration in der Luft zwischen 8:00 16:00 Uhr Tab. 68: Einfluß der Kultivierungsbedingungen auf die Gesamt KBE-Zahl Tab. 69: Vergleich der Probenahme Impaktion/Filtration Angegeben ist der Quotient der Konzentration aller nachgewiesenen Schimmelpilze einer Art mit Impaktion (MAS 100) zu Filtration (MD 8) Tab. 70: Konzentration (KBE/100 l) der Gattungen Cladosporium und Aspergillus/Penicillium auf einem Gelatinefilter nach der Partikelabscheidung bei unterschiedlichem Volumenstrom sowie in der Raumluft. Bestimmung der Sammeleffizienz Tab. 71: Konzentration (KBE/100 l) der Gattungen Cladosporium und Aspergillus/Penicillium auf einem Gelatinefilter nach der Partikelabscheidung bei unterschiedlichem Volumenstrom und unterschiedlicher Objektträgerbeschichtung sowie in der Raumluff. Bestimmung der Sammeleffizienz Tab. 72: Konzentration (KBE/100 l) der Gattungen Cladosporium und Aspergillus/Penicillium auf einem Gelatinefilter nach der Partikelabscheidung (30 l/min) sowie in der Raumluft. Statistische Auswertung von neun nacheinander im gleichen Raum gezogenen Luftproben Tab. 73: Einfluss von schonenden und intensiven Schüttelverfahren in Kombination mit Ultraschall auf die Konzentration (KBE/g) von Aspergillus versicolor, Engyodontium album, Penicillium chrysogenum und Chaetomium globosum in unterschiedlichen Materialien Tab. 74: Einfluss der Materialzerkleinerung auf die Konzentration (KBE/g) von Aspergillus versicolor und Engyodontium album in unterschiedlichen Materialien Tab. 75: Einfluss der Materialzerkleinerung und der Behandlung im Schikanekolben auf die Konzentration von Aspergillus versicolor und Penicillium chrysogenum (KBE/g) in unterschiedlichen Materialien im Vergleich zur Behandlung im Waring Blender 15

16 1 Einleitung Im Bereich der Qualität der Innenraumluft kommt der Belastung mit Schimmelpilzen eine immer größere Bedeutung zu, wobei insbesondere im Zusammenhang mit der Frage der Zunahme von unspezifischen Symptomen und Allergien in den Industrieländern die Schimmelpilzproblematik als eine der möglichen Ursachen diskutiert wird. [1-7]. Zu einer Schimmelpilzbelastung in der Wohnung können Veränderungen des Innenraumklimas, u. a. bedingt durch Änderungen der Bauausführung und der Baumaterialien, sowie die Wohnungsausstattung und die Verminderung der Lüftung führen. Das trifft vor allem auf teilsanierte Wohnungen zu, bei denen es durch unsachgemäßen Einbau von Wärmedämmungen und die Reduzierung des Luftaustausches durch den Einbau neuer Fenster und Türen zu erheblichen bauphysikalischen und baubiologischen Problemen kommen kann. Für den Nachweis von Schimmelpilzen im umweltmedizinischen Bereich gibt es bisher keine Standardarbeitsvorschriften. Die entsprechenden Untersuchungen werden u. a. in Anlehnung an entsprechende Vorschriften im arbeitsmedizinischen Bereich (TRBA 405 [8] und TRBA 430 [9]) durchgeführt. Außerdem gibt es z. Z. beim VDI einen Normungsausschuß im Bereich der Kommission Reinhaltung der Luft, der die Problematik des Nachweises und der Bewertung von luftgetragenen Organismen und Viren bearbeitet [10-13]. Die Arbeiten in diesem Bereich beschäftigen sich vor allem mit Fragen des Nachweises der Belastung mit Schimmelpilzen bezüglich der Emission und Immission. Die Messungen von Schimmelpilzen im arbeitsmedizinischen Bereich bzw. im Emissions- und Immissionsbereich beschränken sich aufgrund der spezifischen Fragestellung fast ausschließlich auf den Nachweis in Luft. Allerdings liegen in diesem Bereich die nachzuweisenden Konzentrationen für gewöhnlich in einem deutlich höheren Bereich als in unbelasteten, bewohnten Innenräumen. 16

17 Über viele Jahre erfolgte die Bewertung von Schimmelpilzbelastungen im Innenraum ausschließlich auf der Grundlage des Vergleiches der Gesamtkonzentration kultivierbarer Schimmelpilzsporen in der Innenraumluft im Verhältnis zur Außenluft [14-16]. Diese Form der Beurteilung der Schimmelpilzbelastung in der Raumluft ist aus mehreren Gründen fragwürdig [1,2,4-6]. Wie schon aus der Literaturzusammenstellung von Rao et al [18] deutlich wird, kommt dem Nachweis bestimmter Schimmelpilze bei der Bewertung von Schimmelpilzbelastungen eine besondere Bedeutung zu. In den vom Umweltbundesamt sowie dem Landesgesundheitsamt herausgegebenen Kriterien zur Beurteilung von Schimmelpilzschäden kommt der Identifizierung bestimmter Schimmelpilze und der Gesamtzellzahl eine besondere Bedeutung zu. Aus diesem Grunde weicht die Strategie des Nachweises im umweltmedizinischen Bereich beträchtlich von derjenigen im arbeitsmedizinischen Bereich bzw. im Emissions- und Immissionsbereich ab. Sowohl die im arbeitsmedizinischen Bereich als auch im Bereich der Emissionsund Immissionsmessung durchgeführten Arbeiten zur Normung des Nachweises und der Bewertung von luftgetragenen Organismen und Viren sind nur bedingt auf den Bereich des Nachweises von Schimmelpilzen in Innenräumen anwendbar. Gründe hierfür sind: die im Verhältnis zum arbeitsmedizinischen Bereich sowie zum Emissionsund Immissionsbereich deutlich niedrigeren Konzentrationen der Schimmelpilzkonzentration im Innenraum die Notwendigkeit neben der Bestimmung in der Luft auch den Nachweis der Schimmelpilze in bzw. auf anderen Medien, wie z. B. Staub oder Material durchzuführen die Tatsache, dass der Differenzierung spezifischer Indikatororganismen eine viel größere Bedeutung zukommt Im umweltmedizinischen Bereich werden bisher allgemein folgende Verfahren zur Beurteilung einer Schimmelpilzbelastung in Innenräumen genutzt: Befragung der Bewohner zur Wohnsituation und zum Befinden 17

18 Nachweis der Gesamtzahl der kultivierbaren Schimmelpilze (Gesamt-KBE) in der Innenluft Erfassung der Kurzzeitbelastung Vergleich der Gesamt-KBE Innenraum- zu Außenluft Indikator für eine Belastung Bestimmung der Gesamt-KBE im Staub Erfassung der Langzeitbelastung Bestimmung der Gesamt-KBE auf bzw. in Materialproben Nachweis von Indikatororganismen mittels Kultivierung, die einen spezifischen Schimmelpilzbefall deutlich werden lassen (Luft-, Staub-, Materialproben) Nachweis von Schimmelpilzen an Oberflächen durch Kultivierung mit Abklatschproben und durch direkte Mikroskopie Nachweis der Gesamtzellzahl Erfassung der kultivierbaren und der nicht kultivierbaren Schimmelpilzsporen Dabei liegen die nicht kultivierbaren Sporen z. T. in wesentlich höheren Konzentrationen vor direktmikroskopischer Nachweis von kultivierbaren als auch von nicht kultivierbaren Indikatorsporen Bestimmung der Microbially Volatile Organic Compounds der leichtflüchtigen Stoffwechselprodukte von Schimmelpilzen (MVOC) und anderer Stoffwechselprodukte (Mykotoxine) bzw. Zellbestandteile ( - Glukane) in der Innenraumluft Je nach Fragestellung und Art des Schadens sind ein bzw. mehere der obengenannten Verfahren anzuwenden. Erst die Betrachtung aller Ergebnisse der oben aufgeführten Verfahren im Gesamtzusammenhang mit den entsprechenden bauphysikalischen und baubiologischen Daten sowie den Fragebogenangaben ermöglicht eine Beurteilung hinsichtlich einer Schimmelpilzbelastung. Aufgrund der fehlenden Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen der Konzentration der Schimmelpilze im Innenraum und gesundheitlichen Beschwerden im umweltmedizinischen Bereich, ist eine Ableitung von zulässigen Schimmelpilzkonzentrationen nicht möglich. Eine einfache schematische Bewertung einer Schimmelpilzbelastung 18

19 ist daher nicht möglich. Für eine einheitliche Bewertung ist es unbedingt erforderlich, die Verfahren zum Nachweis einer Schimmelpilzbelastung zu optimieren und zu standardisieren. Ein hoher Sachverstand wird immer die Voraussetzung sein, um entsprechende Beurteilungen vornehmen zu können. Die externe analytische Qualitätssicherung beim Nachweis von Schimmelpilzen ist sowohl im umweltmedizinischen Innenraumbereich als auch im arbeitmedizinischen Bereich bzw. im Emissions- und Immissionsbereich noch unzureichend wurde zwar vom Berufsgenossenschaftlichen Institut für Arbeitssicherheit ein Ringversuch im arbeitsmedizinischen Bereich durchgeführt. Dieser konnte allerdings aufgrund der großen Streuung nicht bewertet werden und sollte nur dazu dienen, die Bestimmung der Gesamt-KBE- Zahl abzusichern. Im Innenraumbereich kommt der Differenzierung der Schimmelpilzspezies eine viel größere Bedeutung zu als der Bestimmung der Gesamt-KBE-Zahl. Aus diesem Grunde bemühte sich das LGA in Zusammenarbeit mit mykologischen und Umweltlabors durch den Austausch realer Proben (Luft- und Staubproben, sowie Reinkulturen) seit 1998 um entsprechende Aktivitäten zur externen analytischen Qualitätssicherung [17-20]. Aus den USA war bekannt, daß dort jährlich Austausche von Schimmelpilzreinkulturen stattfanden [21]. Die Daten, die bei den Austauschen realer Proben durch das LGA erhalten wurden, zeigten, dass diese Form der externen Qualitätssicherung nicht den Anforderungen, die an Ringversuche gestellt werden, gerecht wird. Inzwischen wurde im Innenraumbereich mit den untereinander abgestimmten Leitfäden des Umweltbundesamtes [1] und des Landesgesundheitsamts Baden-Württemberg [2] versucht, in Deutschland einheitliche Beurteilungskriterien festzulegen. Dabei wurden Probleme bei den Verfahren zum Nachweis von Schimmelpilzbelastungen und bei der analytischen Qualitätssicherung deutlich. In dem Forschungsprojekt sollen daher für die zur Beurteilung einer Schimmelpilzbelastung wichtigsten Parameter Luft, Staub und Material 19

20 validierte Nachweismethoden erarbeitet und Ringversuche für die genannten Medien etabliert werden. Die zu erarbeitenden Verfahren sollen einerseits praxisnah (z. B. Gerätegewicht, Batteriebetrieb, Meßzeit, Kosten) sein, zum anderen waren die spezifischen Belange des Nachweises von Schimmelpilzen (z. B. Sammelstreß, Repräsentativität der Probe, Desinfizierbarkeit der Geräte, Möglichkeit der Kultivierung unter unterschiedlichen spezifischen Bedingungen) zu beachten. Das zu etablierende Ringversuchssystem sollte möglichst mit Proben durchgeführt werden, die der praktischen Realität nahe kamen, wobei als Schwerpunkt die Differenzierung der Schimmelpilzspezies anzusehen war. Das Ringversuchsmaterial sollte aber auch den allgemeinen Anforderungen bezüglich der Homogenität der Probe und der Kenntnis des wahren Wertes entsprechen. 20

21 2 Validierung der Luftkeimsammlung 2.1 Problemstellung Der Luftkeimsammlung kommt im Zusammenhang mit dem Nachweis von Schimmelpilzbelastungen in Innenräumen eine besondere Bedeutung zu. Mittels Luftkeimsammlung soll zum einen überprüft werden, ob in Fällen, in denen kein sichtbarer Schimmelpilzbefall vorhanden ist, aber gesundheitliche Beschwerden bei den Nutzern vorliegen bzw. Feuchte- oder andere bauliche Schäden für einen Schimmelpilzbefall sprechen, im Innenraum eine zusätzliche Innenraumquelle wahrscheinlich ist. In Einzelfällen soll durch die Bestimmung der Schimmelpilzkonzentration in der Luft auch abgeschätzt werden, ob auftretende gesundheitliche Beschwerden mit vorhandenen Schimmelpilzbelastungen im Zusammenhang stehen. Letzteres hat vor allem Bedeutung sowohl im Zusammenhang mit Problemen von Allergien und Atemwegserkrankungen [3, 23, 24] als auch Infektionen von immungeschwächten Menschen [25, 26]. Auch in epidemiologischen Studien [3,27] wird die Luftkeimsammlung häufig als Messgröße zur Einschätzung von Schimmelpilzbelastungen genutzt. Mit der Luftkeimsammlung werden die unter den vorgegebenen Kultivierungsbedingungen vermehrungsfähigen Schimmelpilzeinheiten bestimmt. Vermehrungsfähige Einheiten für Schimmelpilze sind u.a. Sporen, Konidien, Mycel- und Hyphenbruchstücke. Im Allgemeinen werden vermehrungsfähige Einheiten bei Schimmelpilzen unter dem Begriff Schimmelpilzsporen zusammengefasst. Wenn von Schimmelpilzsporen gesprochen wird ist zu beachten, dass diese als Einzelspore oder als Aggregat aus mehreren Sporen sowie an andere Partikel gebunden vorkommen können. Einen Einfluss darauf, ob Schimmelpilze durch das angewandte Verfahren vermehrt werden können haben: das Nährmediums hinsichtlich der Art und Konzentration des Nährstoffes und möglicher Zusatzstoffe sowie Spurenelemente, der Wassergehalt, der ph-wert, die Konzentration möglicher Hemmstoffe die Bebrütungstemperatur bei der die Kultivierung erfolgt (z.b. 25 C, 37 C oder 42 C). 21

22 Bei der Luftkeimsammlung ist zu beachten, dass ihr Ergebniss sehr stark durch die Art der Probenahme und aufarbeitung bestimmt wird. Einfluss auf die Anzahl der nachweisbaren Schimmelpilze hat die physikalische und biologische Sammeleffizienz des verwendeten Probenahmesystems. Die physikalische Sammeleffizienz gibt an, wie viele der in der Luft vorhandenen Partikel, die einen aerodynamischen Durchmesser von 2 bis 35 µm (ungefährer Größenordnungsbereich in dem Schimmelpilzsporen in der Luft vorhanden sind) mittels des jeweiligen Probenahmeverfahrens aus der Probe abgeschieden werden. Bei der Probennahme sind die Einflussgrößen teilweise verfahrensabhängig; z.b. von: der Porengröße des benutzten Filters bei der Filtration dem Cut-off-Wert, der durch den Volumenstrom und den Durchmesser der Bohrungen des Lochimpaktors bzw. der Dimensionierung (Spaltbreite und Länge) des Schlitzimpaktors bestimmt wird der Überbeaufschlagung bei der Impaktion Andere Einflussgrößen sind verfahrensunabhängig. So spielt die Art der Anströmung der Partikel auf das Probenahmesystem eine große Rolle. Die Sedimentation und die Ansaugung durch das Probenahmesystem hat einen Einfluss auf die Anzahl der abgeschiedenen Teilchen. Daher hat die Windrichtung und geschwindigkeit sowie die Ausrichtung des Probenahmegerätes bei der zur Innenraummessungen gehörenden notwendigen Außenluftmessung großen Einfluss auf die Partikelabscheidung. Noch komplexer und weniger vorhersehbar ist die biologische Sammeleffizienz. Durch die Abscheidung der Schimmelpilze auf einem Filter bzw. auf einem Nährmedium oder in einer Lösung kann es zu einer Reduzierung des Anteils der nach der Probenahme noch kultivierbaren Schimmelpilze kommen. Folgende Stressfaktoren wirken sich auf die biologische Sammeleffizienz aus: die Länge der Sammelzeit die Temperatur bei der Sammlung die relative Luftfeuchte bei der Sammlung 22

23 die mechanische Belastungen bei der Sammlung Es ist davon auszugehen, dass die biologische Sammeleffizienz je nach Schimmelpilzart unterschiedlich ist. Großen Einfluss auf die biologische Sammeleffizienz haben auch die Kultivierungsbedingungen. Schimmelpilzsporen liegen sowohl als Einzelsporen als auch als Aggregate aus mehreren Sporen vor. Dies wirkt sich in Abhängigkeit von dem gewählten Kultivierungsverfahren auf die Anzahl der kultivierten Schimmelpilzsporen aus. Bei Anwendung der direkten Methode (direkte Beaufschlagung der Nährmedienplatte, bzw. direktes Auflegen des beaufschlagten Filters auf ein Nährmedium) bleiben Aggregate erhalten und werden als eine Kolonie auf der Kulturschale wahrgenommen. Bei Anwendung der indirekten Methode (ausspateln der durch Impingement bzw. Aufarbeitung von beaufschlagten Filtern erhaltenen Suspensionen) werden Aggregate aufgespalten und als Einzelkolonien wahrgenommen. Die Probenaufarbeitung der Filter kann je nach Art der verwendeten Filter entweder durch die Auflösung des Filters (Gelatinefilter) oder durch das Ablösen der Sporen vom Filter (Polycarbonatfilter) erfolgen. Zu einer reduzierten Ausbeute der kultivierten Schimmelpilzsporen kann es aufgrund der Adsorption der Sporen am Filter kommen oder stressbedingt aufgrund der Materialeigenschaften (Feuchteverhalten). Aufgrund der Witterung, z.b. der relativen Luftfeuchte, sind nicht alle Filter (z.b. Gelatinefilter) für alle Messbedingungen geeignet. Für Innenraummessungen wird meist die Einstufen-Impaktion mit kurzen Messzeiten verwendet. Schimmelpilze liegen in der Luft nicht gleichmäßig verteilt vor. Mechanische Aktivitäten während der Probenahme haben einen großen Einfluß auf die Konzentration der Schimmelpilzsporen in der Luft. Außerdem werden Schimmelpilzsporen diskontinuierlich an die Luft abgeben. Daher stellen die heute im Innenraumbereich allgemein angewandten Kurzzeitmessungen durch Impaktion nur nur eine Momentaufnahme dar. Aufgabe war es deshalb zu überprüfen, ob mit einer Langzeitmessung (1 3 Tage) mittels Filtration aussagefähigere Ergebnisse zu erzielen sind. 23

24 Langzeitmessungen bringen möglicherweise das Problem mit sich, dass die Schimmelpilzsporen während der Sammlung stärker gestresst werden als während der Kurzzeitmessung. 2.2 Validierung des physikalischen Abscheideverhaltens von Schimmelpilzsporen aus der Luft auf Filtern Einfluß der Meßgeometrie Material und Methode In der VDI-Richtlinie 2463 Messen von Partikeln Messen der Massenkonzentration (Immission) nach dem Filtrationsverfahren (Kleinfiltergerät GS 50) [28] wurde ein Standardverfahren zur gravimetrischen Feinstaubbestimmung festgelegt. Bei diesem Verfahren, das mit einem hängenden Kopf mit vorgesetztem rotationssymetrischem Vorabscheidekopf durchgeführt wird, werden die Einflüsse sowohl der Sedimentation als auch der Windrichtung und stärke auf die Partikelabscheidung minimiert. Der Meßkopf dieses Verfahrens ist für einen 50 mm Filter ausgerichtet, der aufgrund seines Aufbaus nicht sterilisierbar ist und folglich für mikrobiologisches Arbeiten nicht geeignet ist. Deshalb wurden die Untersuchungen mit dem Filteradapter FA 30 der Firma Holbach mit aufgesetzter Einwegfiltereinheit der Firma Sartorius durchgeführt. Für diesen Filterhalter wurde ein rotationssymmetrischer Vorabscheider konstruiert (Abb. 1), 80 24

25 Abb. 1: Probensammler - Filteradapter mit Einwegfiltereinheit und rotationssymmetrischem Vorabscheider Ursprünglich sollten die Untersuchungen mit Polycarbonat-Filter (Porendurchmesser 0,4 µm) durchgeführt werden. Diese Filter stellten sich als ungeeignet heraus, da einerseits aufgrund des hohen Strömungswiderstandes der Filter sich die Kleinfiltergeräte abschalteten und andererseits die Wägung der Filter aufgrund elektrostatischer Aufladung mit großen Problemen verbunden war. Daher erfolgte eine Überprüfung des Abscheideverhaltens gravimetrisch auf Glasfaser Filter (GF 10, 80 mm) und mikrobiologisch auf Gelatine-Filter. Bei der gravimetrischen Überprüfung des Abscheideverhaltens wurden folgende Varianten jeweils paarweise miteinander verglichen: stehender Filterhalter ohne rotationssymetrischen Abscheidekopf hängender Filterhalter ohne rotationssymetrischen Abscheidekopf hängender Filterhalter mit rotationssymetrischen Abscheidekopf In einem temperierten (25 + 3) C) und auf (50 + 5) % rel. Luftfeuchte eingestellten Raum wurden die GF10-Filter 3 Tage vor der Probenahme äquilibriert und anschließend 10 fach ausgewogen. Danach wurden die Filter in die Filterhalter eingebaut und 24 h mittels der Kleinfiltergeräte GS 50 im Außenbereich bei einem Volumenstrom von 2,3 m 3 beaufschlagt. Nach der Beaufschlagung wurden die Filter wieder 3 Tage äquilibriert und ausgewogen. Aus der Differenz der Einwaagen und dem Volumenstrom wurde die Staubkonzentration ermittelt. Da die Staubkonzentration an den einzelnen Messtagen variierten, wurde die prozentuale Abweichung zwischen den beiden Beaufschlagungstechniken (hängend-stehend) errechnet. Neben der gravimetrischen Überprüfung des Einflusses der Messgeometrie auf das Gewicht der abgeschiedenen Sporen wurde auch der Einfluss auf die Anzahl der nachweisbaren kultivierbaren Schimmelpilze untersucht. Die Probenahme erfolgte unter folgenden Bedingungen: 25

26 stehender Filterhalter ohne rotationssymmetrischen Abscheidekopf stehender Filterhalter mit rotationssymmetrischem Abscheidekopf hängender Filterhalter ohne rotationssymetrischen Abscheidekopf hängender Filterhalter mit rotationssymetrischem Abscheidekopf Abb. 2: Hängender Probenahmekopf nach VDI-Richtlinie 4252 [10] Witterungsschutz O-Ring Übewurffilterhalterung Stützsieb Filter Filter Einwegfiltereinheit (80 mm) der Firma Sartorius Der Filterhalter wurde unter sterilen Bedingungen mit einem Gelatine-Filter bestückt (Abb. 2). Die Probenahme erfolgte mittels eines Kleinfiltergerätes GS 50 mit einem Volumenstrom 2,3 m 3 über 24 h. Der beaufschlagte Filter wurde nach Prüfverfahren des LGA (pv 0228v00) Kulturelle Bestimmung von Schimmelpilzen aus der Luft mittels indirekter Methode (Suspension) aufgearbeitet (s. Anlage). Die Identifizierung der Schimmelpilze erfolgte anschließend nach der Standardarbeitsanweisung des LGA (saa0096v00) Identifizierung von innenraumrelevanten Schimmelpilzen (s. Anlage) Ergebnisse Die Ergebnisse zur Überprüfung des Einflusses der Messgeometrie auf das Abscheideverhalten zeigen deutlich, dass aufgrund der beim stehenden Messkopf hinzukommenden Sedimentation die Abscheidung sowohl gravimetrisch (Tab. 1 und Tab. 60 s. Anhang) als auch bezüglich der nachgewiesenen Konzentration an kultivierbaren Schimmelpilzen (Gesamt-KBE) (Tab. 2 und Tab. 61 s. Anhang) höher ist als beim hängenden Messkopf. 26

27 Die Ergebnisse bezüglich der Messung mit und ohne Vorabscheider unterscheiden sich sowohl gravimetrisch (Tab. 1) als auch bezüglich der nachgewiesenen Konzentration und des Artspektrums der Schimmelpilze (Tab. 2, Tab. 3 und Tab. 62 s. Anlage) nur geringfügig. Tab. 1: Einfluß der Messgeometrie auf das abgeschiedene Staubgewicht bei der Filtration Vergleich der Abscheideverfahren A und B Abscheideverfahren % Mittelwert (N=5) A B A-B/B*100 stehend ohne rotationssymmetrischen hängend mit rotationssymmetrischem 17,59 Vorabscheider Vorabscheider stehend ohne rotationssymmetrischen hängend ohne rotationssymmetrischem 16,54 Vorabscheider Vorabscheider hängend ohne rotationssymmetrischen Vorabscheider hängend mit rotationssymmetrischem Vorabscheider 3,83 Tab. 2: Einfluß der Ansaugrichtung auf das physikalische Abscheideverhalten der Sporen bezogen auf die ermittelte Gesamtkonzentration kultivierbarer Schimmelpilze Abscheideverfahren [N] Mittelwert rel. Standardabw s ma/h oa [2] 1,18 6,09 s oa/h ma [2] 1,33 20,22 s ma/h ma [2] 1,18 8,12 s oa/h oa [3] 1,15 3,29 h oa/h ma [7] 1,02 4,03 h oa/h oa [5] 0,99 8,20 s ma/h oa: Quotient: stehender Meßkopf mit Vorabscheider zu hängendem Meßkopf ohne Vorabscheider s oa/h ma: Quotient: stehender Meßkopf ohne Vorabscheider zu hängendem Meßkopf mit Vorabscheider 27

28 s ma/h ma: Quotient: stehender Meßkopf mit Vorabscheider zu hängendem Meßkopf mit Vorabscheider s oa/h oa: Quotient: stehender Meßkopf ohne Vorabscheider zu hängendem Meßkopf ohne Vorabscheider h oa/h ma: Quotient: hängender Meßkopf ohne Vorabscheider zu hängendem Meßkopf mit Vorabscheider h oa/h oa: Quotient: hängender Meßkopf ohne Vorabscheider zu hängendem Meßkopf ohne Vorabscheider Tab. 3: Vergleich der Probenahme ohne und mit rotationssymmetrischem Vorabscheider (Quotient: Mittelwert der Ergebnisse von 15 Messungen - hängender Meßkopf ohne Vorabscheider zu hängendem Meßkopf mit Vorabscheider) KBE/m 3 Cladosporium Penicillium Aspergillus spp. spp. spp. Mittelwert 1,02 0,94 1,05 1, Einfluss des Filtermaterials Material und Methode Aufgrund der Arbeiten an der VDI-Richtlinie 4252 [10] und der VDI-Richtlinie 4253 [11] wurde die Frage nach einem geeigneten universellen Filtermaterial, das sowohl im Feucht- als auch im Trockenbereich zu verwenden ist, aktuell. Da Gelatinefilter nicht für die Anwendung bei hohen Luftfeuchtigkeitsgehalten geeignet sind, war zu überprüfen, ob Membranfilter eine Alternative zu Gelatinefilter darstellen. Da bei Arbeitsplatzmessungen u.a. die Anwendung von Polycarbonatfiltern vorgesehen ist, war zunächst zu prüfen, wie das Abscheideverhalten dieser Filter im Vergleich zu Gelatinefiltern einzuschätzen ist. Aufgrund der unterschiedlichen Materialeigenschaften war zu überprüfen, ob die Filter sich bezüglich der Abscheiderate und Wiederfindung unterscheiden. Die Überprüfung wurde unter realen Bedingungen vorgenommen. Daher ist zu beachten, dass die ermittelte Konzentration 28

29 kultivierbarer Schimmelpilze von einer Vielzahl von Faktoren beeinflußt wird, u.a. durch die physikalische Sammeleffizienz die biologische Sammeleffizienz die Ablösbarkeit der Schimmelpilzsporen vom Filtermaterial die Art der Pobenaufarbeitung Es ist davon auszugehen, dass die zum Zeitpunkt der Messung herrschende Temperatur und Feuchte sowie die spezifischen Eigenschaften der jeweiligen Schimmelpilzarten einen großen Einfluß auf die Wiederfindung haben. Unter sterilen Bedingungen wurde der Filterhalter mit folgenden Filtern bestückt: Gelatine-Filter MP PC 0,8µ (Polycarbonat-Filter 0,8 µm) S&S ST 68 (Celluloseacetat-Filter 0,8 µm) S&S ME27 (Mischester-Filter 0,8 µm) Gelatine-Filter mit Polycarbonat-Filter 0,8 µm als Stützfilter Die Probenahme erfolgte jeweils parallel mittels eines Kleinfiltergerätes GS 50 mit einem Volumenstrom 2,3 m 3 über 24 h. Der beaufschlagte Filter wurde nach dem Prüfverfahren des LGA pv0228v00 Kulturelle Bestimmung von Schimmelpilzen aus der Luft mittels indirekter Methode (Suspension) aufgearbeitet (s. Anlage) Bezüglich der Ablösung der Sporen von den Membran-Filtern wurden folgende Varianten überprüft: Schüttelwasserbad 30min Schüttelwasserbad 30min anschließend Rüttler 30 min und 30 min Ultraschallbad Ultraschallbad 15min 29

30 Die Identifizierung der Schimmelpilze erfolgte anschließend nach der Standardarbeitsanweisung des LGA saa0096v00 Identifizierung von innenraumrelevanten Schimmelpilzen Außerdem wurde der Einfluß des Auflösevolumens (10 ml und 5 ml) auf die Wiederfindung überprüft. Da von der Firma Sartorius mehrere Stützfiltertypen auf dem Markt waren, wurden zwei Typen mit einander verglichen; alter Filterhalter (mit großer planer Auflagefläche) neuer Filterhalter (mit kleinerer, zu einer Kante zulaufenden Auflagefläche) Ergebnisse Der Vergleich der mittels Filtration mit Gelatine und Polycarbonatfiltern erhaltenen Konzentrationen kultivierbarer Schimmelpilzsporen (Gesamt-KBE) zeigt deutliche Minderbefunde bei der Verwendung von Polycarbonatfiltern (Tab. 4 und Tab. 63. Anhang). Auch die anderen überprüften Membranfilter (S&S ST 68 und S&S ME27) erbrachten deutliche Minderbefunde (Tab. 5 und Tab. 64 s. Anhang). Die Variation der Techniken zur Ablösung der Sporen von den Membranfiltern erbrachte keine entscheidende Verbesserung der Wiederfindung (Tab. 5 und 6 sowie Tab. 65 und Tab. 66 s. Anhang). Die Art des Stützsiebes hatte prinzipiell keinen Einfluß auf die Wiederfindung (Tab. 7). Der Einfluß des Volumens der Supensionslösung auf die Wiederfindung war nur gering (Tab. 8). Aus Tab. 9 wird der Einfluß der Kultivierung (Konzentration der Schimmelpilzsporen pro Fläche Nährmedium) deutlich erkennbar. Wurden anstelle der üblichen Nährmedienplatten mit 9 cm Durchmesser Platten mit 20 cm Durchmesser verwendet, war die Anzahl der Schimmelpilzsporen die kultiviert wurden deutlich höher. Ein ähnliches Ergebnis wurde erzielt, wenn die Schimmelpilzsuspension in einer höheren Verdünnung ausplattiert wurde. 30

31 Tab. 4: Vergleich der Wiederfindung auf Polycarbonat und Gelatinefiltern (ausgestanzte Filter mit 8 cm Durchmesser, die mittels einer MVS-Pumpe mit 2,3m 3 /h beaufschlagt wurden) abgelöst mit Mittelwert Polycarbonat-Filter 0,8 µ Gesamt-KBE/m 3 (N) Mittelwert Gelatine-Filter Gesamt-KBE/m 3 (N) 1ml, WB (4) 178,3 (6) Rüttler ` 40 (4) 240 (4) Ultraschallbad 27(5) 162 (5) Tab. 5: Einfluß des Filtermaterials auf die Ab- und Auflösung (Wasserbad 30min) - angegeben ist der Quotient der Gesamt-KBE der jeweiligen Filter Gelatine/S&S ST 68 (Celluloseacetat, Porenweite 0,8 µ) Mittelwert (N = 9) 1,50 Gelatine/S&S ME27 (Mischester 0,8 µ) Mittelwert (N = 3) 1,86 Gelatine/MP PC 0,8µ (Polycarbonat 0,8 µm) Mittelwert (N = 3) 1,15 Tab. 6: Einfluß der Probenvorbereitung auf die Ab- und Auflösung - angegeben ist der Quotient der Gesamt-KBE der jeweiligen Ab- und Auflösungsverfahren Filtermaterial N Mittelwert des Quotienten Ultraschallbad 15min / Wasserbad 30min Gelatine 5 0,59 MP PC 0,8 2 0,74 S&S ST ,39 S&S ME27 1 0,78 31

32 Tab. 7: Einfluss des Stützsiebes auf die Untersuchung Probe Mittelwert [Gesamt-KBE/m 3 ] Filterhalter alt 86,1 Filterhalter neu 82,3 Tab. 8: Einfluss des Auflösungsvolumens auf die Untersuchung Quotient Gesamt-KBE 5ml Auflösungsvolumen/ Gesamt-KBE 10ml Auflösungsvolumen (N=10) Mittelwert 0,96 Median 0,93 rel. sr % 24,5 Tab. 9: Einfluß der Kultivierungsbedingungen auf die Gesamt KBE-Zahl Quotient der nachgewiesenen KBE in der Ausgangsverdünnung zur weiteren Verdünnung 1:10 Quotient der nachgewiesenen KBE in der Ausgangsverdünnung auf der 9 cm Nährmedien-Platte zur 20 cm Nährmedien-Platte N Mittelwert 0,77 0, Einfluss der Art der Probenahme (Impaktion Filtration) Material und Methode Zur Probenahme von kultivierbaren Schimmelpilzen werden z.z. vor allem die Impaktion und die Filtration genutzt, wobei bei der Filtration bisher meist das direkte und in Sonderfällen das indirekte Verfahren genutzt wird. Diese drei Varianten der Probenahme wurden miteinander verglichen. Bei der Impaktion und der direkten Filtrationsmethode handelt es sich um Kurzzeitmessungen, bei der indirekten Filtrationsmethode um eine Langzeitmessung. Um eine Abschätzung der Vergleichbarkeit der Ergebnisse der Kurzzeitmessung mit 32

33 denen der Langzeitmessung vornehmen zu können, waren Tagesprofile der Schimmelpilzkonzentrationen in der Luft zu erstellen. Die Bestimmung der Luftkeimkonzentration mittels Impaktion erfolgte mit dem MAS 100 der Firma Merck. In 13 Wohnungen wurden Parallelmessungen zwischen diesem Impaktor und dem MBASS30 der Firma Holbach durchgeführt. In der Regel wurden die Messungen mit zwei Probevolumina (meist 50 und 100 L) und zwei Nährmedien (D18-Agar und Malzextraktagar) durchgeführt. Die Probenahme und Kultivierung erfolgte gemäß des Prüfverfahrens des LGA pv0224v00 Kulturelle Bestimmung von Schimmelpilzen aus der Luft mittels direkter Methode (s. Anhang) Bei der Filtration erfolgte die Bestimmung mittels direkter Methode mit dem MD8 der Firma Sartorius. Die steril auf das Stützsieb des Probenahmekopfes aufgelegten Filter wurden nach der Beaufschlagung direkt auf die zwei Nährmedien (D18-Agar und Malzextraktagar) aufgelegt und anschließend kultiviert. Die Filter wurden jeweils mit zwei Probevolumia (meist 50 und 100 L) beaufschlagt. Es wurden soviele Proben gezogen, dass jeweils die beiden Nährmedien in Doppelbestimmung kultiviert wurden. Die Probenahme und Kultivierung erfolgte gemäß des Prüfverfahrens des LGA pv0224v00 Kulturelle Bestimmung von Schimmelpilzen aus der Luft mittels direkter Methode (s. Anhang). Die Langzeitmessungen mit der indirekten Filtrationsmethode wurden mit den Kleinfiltergeräten GS 050 der Firma Purucker, MVS (3 m3/h) der Firma Derenda bzw. LVS 3 (3 m3/h) der Firma Leckel entsprechend dem Entwurf der VDI 4252 Blatt 2 [10] durchgeführt. Die jeweiligen Filter wurden unter sterilen Bedingungen in den Filterhalter des Kleinfiltergerätes eingelegt. Die Probenahmezeit betrug in der Regel 24 h. Die Aufarbeitung der Proben erfolgte, wenn nicht in den Ergebnistabellen konkret anders angegeben, gemäß des Prüfverfahrens des LGA pv0228v00 Kulturelle Bestimmung von Schimmelpilzen aus der Luft mittels indirekter Methode (Suspension) (s. Anhang). 33

34 2.4.2 Ergebnisse Der Vergleich der Probenahme mit der indirekten bzw. der direkten Methode zeigt (Tab. 10), dass beide Varianten der Filtrationsmethode zum Teil weit von einander abweichende Ergebnisse ergaben. Die Spannbreite des Quotienten der nachgewiesenen Gesamt-KBE/m 3 indirekter zur direkter Probenahme reichte von 0,34 bis 2,90 (Tab. 66 s. Anhang). Ähnliche Spannweiten wurden auch bei der Konzentration der Schimmelpilzarten in der Probe nachgewiesen. Ein Grund für die abweichenden Ergebnisse zwischen der direkten (Kurzzeitmessung) und der indirekten (Langzeitmessung) Bestimmung ist, dass die Sporenkonzentration in der Luft über die Messzeit hinweg nicht konstant ist (Tab. 11). Tab. 10: Vergleich der indirekten mit der direkten Probenahme N=17 Cladosporium Penicillium Aspergillus Sonstige Gesamt KBE/m 3 spp spp. spp. i/da % * i/dp % * i/dp % * i/dp % * i/dp Mittelwert 1, , ,32 6,8 1,04 7,5 0,87 rel. % Standardabw. 58 % 45 % 55 % 86 % 62 % i/da: Quotient der nachgewiesenen KBE/m 3 indirekte zu direkter Probenahme i/dp: Quotient des prozentualen Anteils der nachgewiesenen KBE/m 3 einer Art indirekte zu direkter Probenahme * relativer Anteil der Schimmelpilzart an der Gesamtpopulation 34

35 Tab.11: Tageszeitliche Abhängigkeit der Schimmelpilzkonzentration in der Luft zwischen 8:00 16:00 Uhr (an zwei aufeinander folgenden Tagen) Gesamt- KBE/m 3 Cladosporium spp. Penicillium spp. Aspergillus spp. KBE/m 3 % * KBE/m 3 % * KBE/m 3 % * Mittelwert (N=4) rel. % 54,1 64,6 28,8 81,2 91,5 200 Standardabw. Mittelwert (N=5) rel. % Standardabw. 20,9 92,0 81,3 49,8 52,4 135 * relativer Anteil der Schimmelpilzart an der Gesamtpopulation Der Vergleich der direkten Luftkeimuntersuchungen mittels Impaktion bzw. Filtration zeigt (Tab. 12 und Tab. 67 s. Anhang), dass die ermittelten Gesamt- KBE zwar gut übereinstimmzten. Die Spannweite der Konzentration an Gesamt-KBE bei den 19 Messungen war aber groß. Die Streuung bei der Konzentration der einzelnen Spezies lag verständlicherweise höher als bei der Gesamt-KBE. Tab. 12: Vergleich der Probenahme Impaktion/Filtration Angegeben ist der Quotient der Konzentration aller nachgewiesenen Schimmelpilze einer Art mit Impaktion (MAS 100) zu Filtration (MD 8) MAS/MD8 Gesamt- Aspergillus Cladosporium Eurotium Penicillium Sonstige spp. spp. spp. Mittelwert 1,23 2,20 0,93 0,73 0,86 1,15 Median 1,10 2,00 1,00 0,67 0,74 1,00 Min 0,28 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Max 2,75 3,00 2,50 2,00 2,67 2,00 rel. % 46,5 34,0 60,4 79,4 77,8 61,6 Standardabweichung Anzahl