Springer-Lehrbuch. Das Erste - kompakt. Biochemie - GK1. von Sven Krantz, Jesko Priewe, Daniel Tümmers. 1. Auflage

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1 Springer-Lehrbuch Das Erste - kompakt Biochemie - GK1 von Sven Krantz, Jesko Priewe, Daniel Tümmers 1. Auflage Das Erste - kompakt Krantz / Priewe / Tümmers schnell und portofrei erhältlich bei beck-shop.de DIE FACHBUCHHANDLUNG Thematische Gliederung: Biochemie Springer 2007 Verlag C.H. Beck im Internet: ISBN Inhaltsverzeichnis: Das Erste - kompakt Krantz / Priewe / Tümmers

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3 79 Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information Mind Map Der Bauplan des Menschen ist in jeder Körperzelle als DNA gespeichert. Jeder Zelltyp hat aber sein spezifisches Expressionsmuster für RNAs und Proteine, welches durch Hormone, Zytokine oder Umweltbedingungen beeinflusst werden kann. Das Dogma der Molekularbiologie bedeutet: DNA besitzt die Fähigkeit zur identischen Selbsterneuerung (Replikation). Die in der DNA gespeicherte genetische Information wird auf RNA übertragen (Transkription). Die in der RNA enthaltene genetische Information wird in eine Aminosäuresequenz übersetzt (Translation). Die in einer Aminosäuresequenz enthaltene Information kann nicht auf Nucleinsäuren rückübertragen werden. Jedoch kann an RNA (z. B. Viren) eine DNA synthetisiert werden (reverse Transkription). Replikation, Transkription und Translation bestehen aus den Schritten Initiation, Elongation und Termination. Für die Expression spezifischer Gene durch Transkription und Translation besteht die Möglichkeit einer Steigerung oder Drosselung der Genaktivität. Solche Regulationen sind die Induktion und Repression. Induktoren führen über eine Steigerung der Genaktivität zu einer vermehrten Synthese eines oder mehrerer Proteine (Enzyme). Repressoren unterdrücken die Genaktivität und verursachen dadurch eine Hemmung der Proteinsynthese.

4 80 Kapitel Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information.1 Nucleotide Purin- und Pyrimidinnucleotide sind Bausteine der Nucleinsäuren und von Coenzymen. Ihre Biosynthese geht von einfachen Molekülen aus. Freie Purinbasen können im Stoffwechsel wiederverwertet werden, Pyrimidinbasen nicht. Ein Abbau des Purinskeletts ist nicht möglich. Es erfolgt lediglich ein Umbau zu Harnsäure. Pyrimidine werden vollständig abgebaut..1.1 Synthese Synthese der Purinnucleotide Die Synthese der Purinnucleotide startet mit der Bereitstellung einer besonders aktivierten Ribose Phosphoribosylpyrophosphat (PRPP), bei der die glycosidische OH-Gruppe durch Pyrophosphat aktiviert wird: Ribose--Phosphat+ATP -Phosphoribosyl-1-pyrophosphat+AMP Im nächsten Reaktionsschritt wird auf die aktivierte Ribose die Säureamidgruppe des Glutamins unter Bildung von Phosphoribosylamin und Pyrophosphat übertragen. Das Schlüsselenzym der Purinsynthese ist die Phosphoribosylamidotransferase: PRPP+Glutamin Phosphoribosylamin+Glutamat+PP a Die weiteren Schritte vollziehen sich wie in. Abbildung.1 angegeben. Die Anlagerung des N 1 aus der α-aminogruppe des Aspartats ähnelt der Einführung des zweiten N-Atoms bei der Harnstoffsynthese. Das C-Skelett des Aspartats wird als Fumarat zurückgewonnen. 6 7 N 1 C 2 C 6 C C 4 2 N 7 2 C 8 N 3 2 N Ribose Phosphat. Abb..1. Syntheseschritte bei der Bildung von Purinnucleotiden 3 Das erste Purinnucleotid ist die Inosinsäure (IMP; Purinbase Hypoxanthin). Durch Anlagerung der Aminogruppe des Aspartats an das C 6 entsteht Adenosinmonophosphat (AMP). Dabei geht das C-Skelett des Aspartats wiederum als Fumarat aus der Reaktion hervor. Für diese Reaktion wird GTP als Energiedonator benötigt. Zur Bildung von Guanosinmonophosphat wird die Inosinmonophosphat am C 2 unter Bildung von Xanthosinmonophosphat oxidiert (XMP, Base Xanthin), ehe die Anlagerung einer Aminogruppe aus dem Glutamin unter Verbrauch von ATP erfolgen kann. Die gebildeten Monophosphate werden unter Verbrauch von ATP zu den Triphosphaten phosphoryliert. ATP entsteht aus ADP und P a in der Atmungskettenphosphorylierung. Die Synthese der Purinnucleotide ist energieaufwändig: 4 Synthese von IMP = 4 ATP; 4 Synthese von AMP = 4 ATP und 1 GTP zur Aktivierung von Aspartat; 4 Synthese von GMP = ATP. Die Synthese der Purinnucleotide erfolgt in 3 Multienzymkomplexen. Lediglich die Synthese des Phosphoribosylamins und von Adenylsuccinat (Anlagerung von Aspartat an IMP) werden durch Einzelenzyme katalysiert. Die Regulation der Phosphoribosyl-Amidotransferase-Aktivität ist ein Beispiel für die Steuerung von Stoffwechselprozessen nach dem Prinzip der negativen Rückkopplung. Inhibitoren der Transferase sind die Endprodukte der Reaktionskette IMP, AMP, GMP; Aktivator ist PRPP. Weitere Regulationen bestehen in der Hemmung der Oxidation von IMP zu XMP durch GMP und der Hemmung der AMP-Bildung durch IMP. Eine hohe intrazelluläre GTP-Konzentration begünstigt die Bildung von AMP, eine hohe ATP-Konzentration fördert die Bildung von GMP. Synthese der Pyrimidinnucleotide Im Gegensatz zur Synthese der Purinnucleotide wird bei den Pyrimidinnucleotiden zunächst der Ring synthe tisiert, der dann auf PRPP übertragen wird (. Abb..2). Die Biosynthese beginnt mit der Bereitstellung von Carbamoylphosphat im Zytoplasma durch die Carbamoylphosphatsynthetase II. Die Unterschiede zur mitochondrialen Carbamoylsynthetase I zeigt die. Tabelle.1. Carbamoylphosphat wird durch die Aspartattranscarbamoylase auf Aspartat unter Bildung von Carbamoylaspartat übertragen. Unter Wasserabspaltung

5 81.1 Nucleotide. Tab..1. Unterschiede zwischen Carbamoylsynthetase I und Carbamoylsynthetase II Carbamoylsynthetase I Carbamoylsynthetase II Stoffwechselweg Harnstoffzyklus Pyrimidinnucleotidsynthese Stickstoffdonator NH + 4 -Ionen Säureamidgruppe des Glutamins Aktivator N-Acetylglutamat keiner N 1 C 6 C C 2 C 4 N 3 Ribose Phosphat. Abb..2. Syntheseschritte bei der Bildung von Pyrimidinnucleotiden kommt es zum Ringschluss unter Bildung von Dihydroorotsäure. Diese wird zu Orotsäure dehydriert und auf PRPP unter Bildung von Orotidinmonophosphat übertragen. Durch Decarboxylierung entsteht Uridinmonophosphat (UMP). Dieses wird unter ATP-Verbrauch zum UTP phosphoryliert. UTP wird durch die Säureamidgruppe des Glutamins zu Cytidintriphosphat (CTP) aminiert. Lediglich die Dihydroorotatdehydrogenase ist ein Einzelenzym. Die übrigen bilden 2 Multienzymkomplexe. Der Energieaufwand beträgt für die Synthese von UMP 3 ATP und für CTP ohne Berücksichtigung der UTP-Bildung 4 ATP. Die Regulation ist ein Beispiel für negative Rückkopplung. UTP inhibiert die Carbamoylphosphatsynthetase II. Die Orotidinmonophosphatdecarboxylase wird durch UMP und CMP allosterisch gehemmt. Phosphoribosylpyrophosphat ist ein allosterischer Aktivator der Carbamoylphosphatsynthetase II. Synthese von Desoxyribonuleotiden Die Umwandlung der Ribonucleotide in Desoxyribonucleotide für die DNA-Replikation wird durch die Ribonucleotidreduktase katalysiert. Substrate des Enzyms sind die Ribonucleotiddiphosphate, in denen unter Verbrauch von NADPH 2 Ribose zu Desoxyribose reduziert wird (. Abb..3): Ribonucleotid-Diphosphat+NADPH 2 Desoxyribonucleotiddiphosphat+NADP + +H 2 O. Abb..3. Die Bildung von Desoxyribonucleotiden (aus Löffler 200) Die aktive Reduktase enthält 2 SH-Gruppen, welche für die Umwandlung der Ribo- in Desoxyribonucleotide verantwortlich sind. Dabei entsteht eine Disulfidbrücke. Das Enzym ist inaktiv. NADPH 2 wird zur Reduktion des Disulfids und Reaktivierung des Enzyms verwendet. Die Reaktion läuft wie folgt ab: 4 NADPH 2 reduziert FAD zu FADH 2, 4 FADH 2 reduziert eine Disulfidbrücke in dem kleinen Protein Thioredoxin, 4 reduziertes Thioredoxin reduziert das Disulfid in der Reduktase und geht dabei in den oxidierten Zustand über (Disulfid). Die Desoxyribonucleotiddiphosphate werden unter ATP-Verbrauch zu den Triphosphaten phosphoryliert. Die Bildung von Thyminnucleotiden DNA enthält anstelle von Uracil Thymin. Uracil wird durch die Thymidylatsynthase in Thymin überführt.

6 82 Kapitel Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information. Abb..4. Biosynthese des Desoxythymidylats (dtmp) (aus Löffler 200) Ausgangsverbindung ist dump, das mittels Methylen-FH 4 zu dtmp methyliert wird. Die Methylengruppe CH 2 muss zur Methylgruppe CH 3 reduziert werden. Das geschieht durch die Tetrahydrofolsäure, die dabei in Dihydrofolsäure übergeht. Der fehlende Wasserstoff wird dem Tetrahydrofolat entnommen (. Abb..4): dump+n,n 10 -Methylen-Tetrahydrofolat dtmp+7,8-dihydrofolat Merke Diese Methylierung ist unabhängig von S-Adenosyl-Methionin! Aminopterin, Amethopterin: Hemmer der Dihydrofolatreduktase, Deazauridin: Hemmer der Orotidinphosphatdecarboxylase, Fluor-dUridin, Fluoruracil: Hemmer der Thymidylatsynthase und Ribovirin, Mycophenolsäure: Hemmer der IMP- Dehydrogenase. Hemmer der Dihydrofolatreduktase werden auch zur Therapie von Autoimmunerkrankungen eingesetzt (Immunsuppressiva), da sie die Proliferation von immunkompetenten Zellen unterdrücken. Die Dihydrofolatreduktase überführt unter NADPH 2 - Verbrauch Dihydrofolat wieder in Tetrahydrofolat. Hemmstoffe der Purin- und Pyrimidinnucleotidsynthese Die folgenden Verbindungen finden als Arzneimittel infolge ihrer antiproliferativen Wirkungen Anwendungen in der Krebstherapie (Kanzerostatika): Funktion Nucleotide üben vielfältige metabolische Funktionen aus: 4 Energiestoffwechsel: Adenylsäuresystem, insbesondere ATP; GTP für spezielle Reaktionen, 4 Monomere der Nucleinsäuren, 4 physiologische Mediatoren: camp und cgmp als»second messenger«; GTP für die cap-bildung am -Ende von mrna oder die Signaltransduktion durch Bindung an G-Proteine,

7 83.1 Nucleotide 4 Bestandteile von Coenzymen wie NAD(P), FAD und CoA, 4 aktivierte Intermediate: UDP-Glucose, UDP-Galactose; GDP-Mannose, GDP-Fucose; CDP-Cholin, CDP-Ethanolamin, CDP-Diacylglycerol, CMP- Neuraminsäure..1.3 Abbau der Nucleotide Nucleotidasen spalten die Phosphorsäure-Esterbindung zwischen Pentose und Phosphat hydrolytisch. Sie sind Phosphatasen. Es entsteht ein Nucleosid und anorganisches Phosphat: B R P+H 2 O B R+P a. Nucleosidasen spalten die N-glycosidische Bindung zwischen Base und Pentose hydrolytisch. Sie sind Glycosidasen. Es entstehen die freien Basen und der Zucker: B R+H 2 O B+R (bzw. dr). Nucleosid-Phosphorylasen spalten Nucleoside phosphorolytisch unter Bildung von Ribose- bzw. Desoxyribose-1-Phosphat: B R+H 2 PO 4 B+R 1 P (bzw. dr 1 P). Ribose-1-Phosphat kann durch eine Mutase in Ribose- -Phosphat überführt und im Stoffwechsel wiederverwertet werden. Desoxyribose-1-Phosphat wird abgebaut. Prüfungsfallstricke Das Purinskelett kann synthetisiert, aber nicht abgebaut werden! Adenin wird zu Hypoxanthin desaminiert, Guanin zu Xanthin. Hypoxanthin wird über Xanthin zur Harnsäure oxidiert. Das erforderliche Enzym ist die Xanthinoxidase mit FAD als Coenzym. Das gebildete FADH 2 überträgt den Wasserstoff auf molekularen Sauerstoff unter Bildung von H 2 O 2. Die Xanthinoxidase ist in den Peroxisomen der Leber lokalisiert. Das Pyrimidinringsystem kann im Organismus vollständig zu CO 2, H 2 O und NH 3 abgebaut werden. Nach Spaltung des Pyrimidinrings entstehen intermediär β-aminosäuren, wie z. B. aus Uracil β-alanin. Bergungsstoffwechsel Die Purinsynthese ist energetisch aufwändig. Deshalb werden die Basen Adenin, Guanin und Hypoxanthin wiederverwertet. Folgende Enzyme sind von Bedeutung: 4 Die Adenosindesaminase überführt Adenosin bzw. Desoxyadenosin durch Abspaltung von NH 3 in Inosin/Desoxyinosin (Base Hypoxanthin), 4 Die Purinnucleosidphosphorylase spaltet Inosin/ Desoxyinosin in Hypoxanthin und Pentose-1- Phosphate. Die eigentlich wiederverwertenden Enzyme sind: 4 die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HGPT), die auf Hypoxanthin bzw. Guanin Ribose-1-Phosphat aus dem PRPP überträgt: Hypoxanthin/Guanin+PRPP IMP/GMP+PP a. 4 die Adenin-Phosphoribosyl-Transferase (ARRT), die auf Adenin Ribose-1-Phosphat überträgt: Adenin+PRPP AMP+PP a. Ein Adenosindesaminase-Mangel führt zu schweren Immundefekten (SCID: severe combined immunodeficiency). Ursache ist eine Akkumulation von Adenosin/Desoxyadenosin, die durch Nucleosid- und Nucleotidkinasen zu ATP/dATP phosphoryliert werden. datp ist ein allosterischer Inhibitor der Ribonucleotidreduktase. Daraus entsteht ein Mangel an Desoxyribonucleotiden, eine Hemmung der DNA-Replikation und der Lymphozytenproliferation, die zu einem Antikörpermangel führt. Das Lesh-Nyhan-Syndrom beruht auf einem genetischen Defekt der HGPT. Eine Wiederverwertung von Pyrimidinbasen ist nur auf der Stufe der Nucleoside möglich, die unter ATP- Verbrauch zu den Nucleotiden phosphoryliert werden. Die dafür erforderlichen Enzyme sind die Uridin-Cytidin-Kinase und die Thymidinkinase..1.4 Pathobiochemie Die Hyperurikämie, als Krankheitsbild Gicht, spielt unter Wohlhabenden der Gesellschaft eine vorrangigere Rolle, da sie sowohl genetische als auch ernährungsbedingte Ursachen hat.

8 84 Kapitel Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information Die Gicht ist durch eine Erhöhung des Blutspiegels an Harnsäure (Hyperurikämie) und ihrer Ablagerung in den Bindegeweben, insbesondere in kleineren Gelenken, gekennzeichnet. Die primäre Hyperurikämie beruht auf genetischen Störungen im Purinstoffwechsel. Die sekundäre Hyperurikämie ist die Folge erworbener Erkrankungen, die einen vermehrten Zellabbau oder eine verminderte Ausscheidung über die Niere verursachen. Allopurinol ist ein therapeutisch genutzter Inhibitor der Xanthinoxidase. Weiterhin ist eine Verabfolgung von Urikosurika angebracht, z. B. Probenecid, die die Ausscheidung von Harnsäure begünstigen. Neben einer medikamentösen Therapie spielt die Einhaltung von Diäten eine wichtige Rolle: Reduktion von Alkohol und purinreichen Nahrungsmitteln wie Kaviar und Fleischprodukten, dafür Kohlenhydrate und Milchprodukte. Eine Erhöhung des Harnsäurespiegels wird auch bei Typ I Glycogenose (v. Gierke) beobachtet. Infolge des Fehlens der Glucose-6-Phosphatase wird Glucose-6-Phosphat vermehrt im Pentosphosphatweg in Ribose--Phosphat überführt, aus welchem Phosphoribosylpyrophosphat (PRPP) entsteht. Dieses stimuliert die Purinsynthese und es kommt zu einer gesteigerten Bildung von Uraten. Auch beim Lesh-Nyhan-Syndrom ist die Gicht eine Begleiterkrankung. Sulfonamide wirken antibakteriell als Strukturanaloga der p-aminobenzoesäure bei der Synthese der Tetrahydrofolsäure, die in Bakterien, aber nicht beim Menschen möglich ist (GK Chemie, 7 Kap. 8: Vitamine, Folsäure) (Chemotherapeutika) und hemmen dadurch alle FH 4 -abhängigen Prozesse im Nucleotid- und Aminosäurestoffwechsel. Weiterhin finden Sulfonamide Anwendung als Antidiabetika und Diuretika..2 Nucleinsäuren.2.1 Grundbegriffe Die informationsspeichernden Elemente in der DNA sind die Gene für Ribonucleinsäuren und Proteine. Das Genom beinhaltet die gesamte genetische Information einer Zelle. Ihr Proteom ist die Gesamtheit realisierter Information durch Proteine (GK Chemie 7 Kap. 7.2). Veränderungen im Genom können ausgelöst werden durch: 4 Rekombination genetischen Materials zwischen meist homologen Chromosomen (z. B. in der Meiose), 4 Verlagerung von Genen innerhalb des Genoms durch Transposition und 4 stabile Mutationen. Punktmutationen betreffen den Austausch einer Base. Nucleotidsubstitutionen sind die Transition und Transversion. Die Transition ersetzt eine Purin- eine andere Purinbase bzw. eine Pyrimidinbase eine andere Pyrimidinbase. Bei der Transversion wird eine Purin- durch eine Pyrimidinbase ersetzt und umgekehrt. Daraus können sich folgende Konsequenzen ergeben: 4 Missense-Mutation: es entsteht ein Triplett, welches eine andere Aminosäure codiert, 4 neutrale Mutation: das veränderte Triplett codiert die gleiche Aminosäure oder 4 Nonsense-Mutation: die Nucleotidsubstitution führt zu einem Stopp-Codon, wodurch eine verkürzte Aminosäuresequenz entsteht. Deletionen (Verlust von Nucleotidsequenzen) und Insertionen (Einfügen neuer Nucleotidsequenzen) bewirken immer Veränderungen des Leserahmens und damit Veränderungen der Aminosäuresequenz. Chromosomenmutationen führen zu Verän derungen der gesamten Chromosomenstruktur, ihrer Entfernung oder Verdopplung, z. B. XO oder XXY bei den Geschlechtschromosomen. Chromosomenbrüche induzieren eine Translokation der Fragmente, wobei fusionierte Gene entstehen können. Mutationen können zum Auftreten von Erkrankungen führen. Wenn sie sich in der Keimbahn manifestieren, sind sie vererbbar. Beispiele für Mutationen sind: die Sichelzellanämie: Ursache Punktmutation im β-globingen, Austausch A/T führt zum Ersatz von Glu6 gegen Val in der β-kette. Folge ist eine Klebrigkeit des Hb im desoxygenierten Zustand. Hb aggregiert, bindet weniger O 2 und führt zu einer sichelförmigen Verformung der Erythrozyten. Phenylketonurie: Mutationen im Phenylalaninhydroxylase-Gen bewirken, dass Phe nicht mehr in Tyr umgewandelt werden kann (Folgen 7 Aminosäurestoffwechsel). 6

9 .2 Nucleinsäuren 8 Cystische Fibrose (Mucoviszidose): Deletion im Gen für den Cl -Transporter in Epithelzellmembranen (Folge: u. a. zäher muköser Schleim in den Bronchien). Monogenetisch bedingte Erkrankungen sind Ziele einer Gentherapie, die einen Ersatz des mutierten Gens anstrebt..2.2 DNA-Replikation Jeder Zellteilung geht eine Verdopplung des Chromosomenbestandes voraus. Das setzt die identische Verdopplung (Replikation) der DNA voraus, die in der S-Phase des Zellzyklus erfolgt. Die Replikation von 3,2 Milliarden Basenpaaren der menschlichen Zellen erfordert etwa 8 h. Die Replikation ist semikonservativ, d. h. an jedem Elternstrang wird ein Tochterstrang synthetisiert, sodass bei der Zellteilung die Tochterzellen je einen Elternstrang und einen neu synthetisierten Strang enthalten (. Tab..2). Mit der Replikation werden auch die Histone und Nichthistonproteine verdoppelt. Die Verteilung der elterlichen Chromatinproteine auf die Filial-DNA erfolgt zufällig. Die frei bleibenden Plätze werden durch Neusynthese in der G 1 -Phase besetzt. An der DNA-Replikation sind folgende Enzyme beteiligt: 4 DNA-Polymerasen mit den Desoxyribonucleosid- Triphosphaten (datp, dgtp, dtpp, dctp), 4 Helicasen, Topoisomerasen, 4 Primase, 4 Ligasen sowie 4 Telomerasen. Die Replikation beginnt an spezifischen Startstellen, den ORs (origins of replication). Eukaryontische DNA enthält mehrere ORs (. Abb..). Die Initiation der Replikation erfordert eine Entwindung der DNA-Doppelhelix in den ORs. Daran sind beteiligt: Helicasen, Topoisomerasen, die die entstehende Superspiralisierung der DNA bei der Entwindung aufheben, sowie Einzelstrang-stabilisierende Proteine. Im Ergebnis entsteht eine Replikationsblase mit 2 Replikationsgabeln. Die Replikation der DNA läuft in beiden Richtungen ab. Sie ist bidirektional vom Ursprung weg. Die Topoisomerase-Hemmer Topotecan und Irino tecan sind hochpotente Kanzerostatika, die sich vom Camptothecin, einem natürlich vorkommen den Chinolin-Alkaloid ableiten, welches selbst aber zu toxisch ist. Sie hemmen die DNA- Replikation. Die Elongation erfordert verschiedene DNA-Polymerasen, die den elterlichen Strang (Matrize) in Richtung lesen und den Tochterstrang in -3 -Richtung synthetisieren. Daraus ergibt sich, dass ein Strang kontinuierlich repliziert werden kann (Führungsstrang), während der andere»im Rückwärtsgang«der Polymerase (entgegen der Wanderungsrichtung der Replicationsgabel) diskontinuierlich unter Bildung kurzer Okazaki-Fragmente von ca Nucleotiden aufgebaut wird (Verzögerungsstrang). DNA-Polymerasen verknüpfen die Desoxyribonucleosid-Triphosphate datp, dgt, dctp, dttp unter Abspaltung von Pyrophosphat zu einem neuen DNA- Polymer. Alle DNA-Polymerasen benötigen eine freie 3 -OH-Gruppe, um die Desoxyribonucleotide anzuknüpfen. Dies Problem wird am Start durch die Bildung von Primern gelöst. Diese sind kurze RNA-Stücke aus 3 10 Nucleotiden, die durch Primasen (RNA-Polymerasen) gebildet werden. An der Replikation der DNA bei Säugetieren sind folgende Polymerasen beteiligt:. Tab..2. Die Replikation der eukaryontischen DNA Schritt Mechanismus Produkt 1 Initiation Erkennung des OR (origin of replication), Entwindung der DNA, Bildung der Replikationsblase mit 2 Replikationsgabeln, Bildung der Primer 2 Elongation Synthese der kontinuierlichen und diskontinuierlichen Tochterstränge unter Verbrauch von Desoxyribonucleosid-Triphosphaten 3 Termination Verschmelzung der Replikationsblasen, Entfernung der Primer, Auffüllung der Lücken und Ligierung der Fragmente

10 86 Kapitel Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information. Abb... Schema der Replikation von DNA (aus Löffler 200) 4 α-polymerase: Synthese von Primern (Primase-Aktivität) und Okazaki-Fragmenten am Verzögerungsstrang, 4 δ-polymerase: kontinuierliche Synthese am Führungsstrang, 4 β- und ε-polymerasen: Reparaturenzyme sowie 4 γ-polymerase: Replikation mitochondrialer DNA. Die α-, β-, δ- und ε-polymerasen kommen im Zellkern vor. Die γ-polymerase befindet sich im Mitochondrium. Die Polymerasen katalysieren eine nucleophile Reaktion zwischen der 3 -OH-Gruppe und der α,β-phosphorsäure-anhydridbindung des zu bindenden Desoxynucleosidtriphosphats: (DNA) n +dntp (DNA) n+1 +PP a ; dntp=datp, dgtp, dctp, dttp Durch Abbau des Pyrophosphats wird die Reaktion irreversibel. Um den Verzögerungsstrang zu komplettieren, müssen die RNA-Primer abgebaut, die entstehenden Lücken durch die β-polymerase aufgefüllt und die Stücke durch Ligasen miteinander verbunden werden. Die Replikation ist beendet (Termination), wenn sich alle Replikationsblasen vereinigt haben. Die Replikation linearer DNA birgt eine Komplikation: die am elterlichen Verzögerungsstrang synthetisierte DNA kann an ihrem 3 -Ende nicht zu Ende synthetisiert werden. Der hier liegende Primer kann nach seinem Abbau nicht durch DNA ersetzt werden, sodass sich die DNA bei jeder Replikation weiter verkürzt. Um einem Verlust von Genen vorzubeugen, enthalten diese als Telomeren bezeichneten DNA-Abschnitte hochrepetitive G-reiche Basensequenzen. Nach etwa 0 Replikationen ist in somatischen Zellen jedoch der Vorrat aufgebraucht. Es kommt zu Genverlusten und damit zum Zelltod (biologische Uhr). In den Keimbahnzellen, den Stammzellen der Hämatopoese und der Haut sowie in Tumorzellen befindet sich eine Telomerase, die eine Wiederverlängerung der Telomere bewirkt. Die Telomerase enthält eine RNA, die zur Kettenverlängerung genutzt wird. Das Enzym wirkt wie eine reverse Transkriptase (7 Viren). Dadurch sind sehr viel mehr Zellteilungen möglich. Merke Replikation ist die Verdopplung der DNA vor einer Zellteilung in der S-Phase an den Replikationsgabeln, die an»den origins of replication«(or) entstehen. Die DNA-Polymerasen lesen in 3 - -Rich- 6

11 .2 Nucleinsäuren 87 tung den zu replizierenden Strang ab und synthetisieren in -3 -Richtung. Der Führungsstrang wird kontinuierlich (δ-polymerase), der Folgestrang diskontinuierlich unter Bildung der Okazaki-Fragmente gebildet (α-polymerase). Die Okazaki-Fragmente haben eine Länge von ca. 140 Nucleotiden. Die DNA-Polymerasen benötigen einen RNA-Primer zur Anknüpfung an das freie 3 -OH-Ende von Desoxyribonucleotiden. Die nach Abbau der Primer entstandenen Lücken werden durch die β-polymerase gefüllt. Ligasen katalysieren die Verknüpfung der DNA-Stücke. Telomerasen katalysieren nur in wenigen Geweben, z. B. Keimbahn, Haut, hämopoetische Stammzellen, Tumore, die Wiederverlängerung von Telomeren..2.3 DNA-Schädigung und -Reparatur Die hohe Stabilität der DNA wird durch effektive Reparaturprozesse gewährleistet. Ursachen für notwendige Reparaturen sind: 4 Die thermische Spaltung N-glycosidischer Bindungen von Purinbasen, 4 die Desaminierung von Cytosin zu Uracil, 4 die Bildung von Thymindimeren durch UV-Licht. Dabei sind zwei Mechanismen bedeutungsvoll: die Basen exzisionsreparatur und die Nucleotidexzision. Bei der Basenexzision wird das fehlerhafte Desoxyribonucleotid entfernt und die Lücke mit einer Polymerase und Ligase geschlossen. Bei der Nucleotidexcisionsreparatur wird ein aus etwa 20 Nucleotiden bestehendes Stück in der Umgebung der fehlerhaften Base herausgeschnitten und die Lücke durch Polymerasen und Ligasen geschlossen. Voraussetzung ist die Intaktheit des komplementären DNA-Strangs..2.4 Transkription Die Umschreibung von DNA-Genen in einsträngige RNA-Sequenzen bezeichnet man als Transkription (. Tab..3). Die Transkription findet im Zellkern/Nucleolus statt und liefert noch nicht funktionstüchtige RNA-Transkripte (Vorläufermoleküle), die zu den funktionsfähigen RNAs»prozessiert«werden müssen und in der Lage sind, die Kernporen zu passieren. Es wird nur ein DNA-Strang abgelesen und transkribiert: 4 Matrizen- oder nichtcodierender Strang ist der DNA-Strang, an dem die RNA-Synthese erfolgt ( Strang), 4 der komplementäre DNA-, Nichtmatrizen- oder codierende Plus-Strang, der nicht transkribiert wird, entspricht der Basensequenz der transkribierten RNA, wobei T statt U steht (+Strang). Die erforderlichen Enzyme sind die DNA-abhängigen RNA-Polymerasen. Im Gegensatz zu den Prokaryonten gibt es bei Eukaryonten 3 Polymerasen: 4 RNA-Polymerase I transkribiert r-rna-gene im Nucleolus, 4 RNA-Polymerase II transkribiert m-rna-gene im Kern, sie ist durch α-amanitin, das Gift des Knollenblätterpilzes (bizyklisches Polypeptid) in sehr niedrigen Konzentrationen hemmbar; und die 4 RNA-Polymerase III transkribiert im Zellkern t-rna-gene, die S-r-RNA der Ribosomen sowie die sn-rnas. Sie wird durch hohe α-amanitin- Konzentrationen gehemmt. Die RNA-Polymerasen brauchen keine Primer, um mit der Synthese zu beginnen. Gelesen wird in Richtung 3 -, synthetisiert wird in Richtung -3. Das -Ende ist demzufolge ein Nucleotid-Triphosphat. Substrate sind Ribonucleosid-Triphosphosphate der Purinbasen A und G und der Pyrimidinbasen C und U. Die freie OH-Gruppe am C 3 des ersten Nucleotids wird mit der α-phosphatgruppe am C des zweiten Nucleotids verbunden. Dabei wird Pyrophosphat frei, welches sofort in 2 anorganische Phosphate hydrolysiert wird. Das Gleichgewicht der Reaktion liegt demzufolge auf Seiten. Tab..3. Die Transkription Schritt Mechanismus Produkt 1 Initiation Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor unter Mitwirkung von Transkriptionsfaktoren. 2 Elongation Aufbau der RNA unter Verbrauch von Nucleosid-Triphosphaten. 3 Termination Prä-RNAs, Abbruch der Kettenverlängerung nach Erkennung von Stopp-Signalen auf der DNA.

12 88 Kapitel Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information des Produkts Phosphodiesterbindung. Der Reaktionsmechanismus der Anlagerung eines Nucleotids an die 3 -OH-Gruppe entspricht dem der DNA-Polymerasen. Die Initiation der Transkription beginnt mit der Bindung der Polymerase an den Promotor. Die Promotorregion, oberhalb des 3 -Endes der Startnucleotidsequenz der DNA gelegen, ist eine regulatorische Erkennungssequenz zur Bindung der Polymerase zusammen mit Transkriptionsfaktoren, die für die Polymeraseaktivität beim Start essenziell sind (Erkennung und Bindung) und einen Initiationskomplex bilden. Promotoren enthalten AT-reiche Sequenzen (TATA-Boxen) sowie eine variable Anzahl von CCAAT- bzw. GC-Boxen, die für die Aufspaltung der DNA in Einzelstränge und die Bindung von Transkriptionsfaktoren erforderlich sind, um der Polymerase das Ablesen der Basenfolgen zu ermöglichen. Merke Basensequenzen, wie die AT- und GC-reichen Regionen in den Promotoren, werden, da sie in vielen Genen auftreten, Consensus-Sequenzen genannt. Jede Polymerase hat ihre eigenen Transkriptionsfaktoren (TF I III). Neben den klassischen Transkriptionsfaktoren gibt es auch spezifische Transkriptionsfaktoren, die aktivierend oder hemmend (Aktivatoren, Repressoren) in die Transkription eingreifen. Dazu gehören die intrazellulären Rezeptorproteine z. B. für Steroidhormone. Weiterhin gibt es auf der DNA Enhancer- und Silencer-Sequenzen, die weiter von der Promotorregion entfernt liegen, aber durch Schleifenbildungen der DNA zusammen mit an diese DNA-Regionen bindenden Proteinen den Start einer RNA-Synthese verstärken oder hemmen können. Die Initiationsfaktoren werden mit Beginn der RNA-Synthese (Elongation) abgelöst. Der Prozess der eigentlichen Synthese ist nicht genau bekannt. Die DNA liegt als 10 nm-fibrille vor. Ob die Nucleosomenstruktur aufgelöst wird, ist nicht geklärt. Es muss jedoch zu einer reversiblen Entwindung der DNA kommen, damit die Polymerasen den Matrizenstrang ablesen können. Ebenfalls nicht bekannt sind die Terminationssequenzen auf der eukaryonten DNA. Von einem Gen können verschieden lange Transkripte erhalten werden. Die RNA-Polymerasen besitzen keine Korrekturmöglichkeiten für falsch eingebaute Nucleotide. Die Fehlerquote liegt bei ~10, d. h. pro Nucleotide wird ein falsches Nucleotid eingebaut. Merke An DNA-Genen werden auch RNAs transkribiert, deren Funktion unbekannt ist. Alle Primärtranskripte werden mit einem erheblichen Basenüberschuss synthetisiert. Gut bekannt ist die Überführung der hn-rna = prä-m-rna in die funktionsfähige m-rna. Die posttranskriptionalen Modifikationen der hn-rna bestehen aus: 4 der Anheftung der cap-gruppe ( 7 Methyl-GTP) an das -Ende der m-rna. Diese ermöglicht den Transport der m-rna vom Kern ins Zytoplasma, schützt die m-rna vor dem Abbau durch Exonucleasen und dient der Orientierung bei der Bindung der m-rna an die kleine Ribosomenuntereinheit bei der Initiation der Proteinbiosynthese, 4 der Synthese einer Poly-A-Sequenz am 3 -Ende der mrna aus bis zu 200 AMP-Resten, die die Lebensdauer der m-rna im Zytoplasma bestimmen und 4 der Entfernung der Introns (Spleißen). Introns haben eine durchschnittliche Größe von 00 Nucleotiden. Die Exon-Intron-Grenze wird durch spezifische Consensus-Sequenzen markiert. Das Spleißen wird von sn-rna-protein-komplexen (sn-rnps) katalysiert. Die sn-rnps binden an die hn-rna, die ebenfalls als RNP vorliegt, markieren die Spleißstellen und schneiden zuerst an der -Exon-Intron-Grenze und verbinden das Ende des Introns mit einer OH-Gruppe innerhalb des Introns, wobei sich eine»lasso-ähnliche«struktur des Introns ausbildet (Lariat-Struktur), die das 3 -Ende an den Spaltungskomplex (Spleißosom) heranführt. Nun wird das 3 -Ende an der Exon-Intron- Grenze geschnitten und die Enden zwischen den Exons werden ligiert. Eine freie OH-Gruppe innerhalb des Introns greift die Phosphodiesterbindung am Exon- Intron-Übergang an. Das entstehende freie 3 OH-Ende des Exons I greift dann am Übergang zu Exon II an, wodurch das Intron eliminiert und die beiden Exons verbunden werden. Das Intron in der Lariat-Struktur wird freigesetzt. Einige intronische RNAs können sich selbst spleißen (Ribozyme). Prüfungsfallstricke Histon-RNAs enthalten keine Introns und keinen Poly-A-Schwanz. Das Spleißosom ist ein komplexer Apparat aus hn-rna, sn-rnas und Proteinen, der eine zwei- 6

13 .2 Nucleinsäuren 89 fache Umesterung von Phosphodiesterbindungen zur Entfernung der Introns katalysiert. Die Lariatstruktur wird auf dem stromabwärts ( -3 ) gelegenen Intron (nicht Exon) gebildet. Alternatives Spleißen bedeutet, dass aus einer hn-rna verschiedene m-rnas entstehen können. Dabei werden neben den Introns auch Exons entfernt. RNA-Editing ist ein posttranskriptionaler Basenaustausch auf der m-rna. Dieser führt dazu, dass z. B. in der m-rna für Apolipoprotein B in der Mukosa zelle frühzeitig ein Stopp-Codon entsteht (Umwandlung von Cytosin in Uracil durch Desaminierung), wodurch das ApoB 48 als Bestandteil der Chylomikronen gebildet wird, in der Leber, wo das Editing unterbleibt, hingegen Apo B 100 als Komponente der VLDL entsteht. Das Editing besteht in Veränderungen der Basensequenz. Merke Variable RNA-Termination beim Transkriptionsvorgang, alternatives Spleißen und RNA-Editing sind für das Entstehen unterschiedlicher Kopien eines Gens verantwortlich und eine Erklärung dafür, dass mittels Protein-Genen über verschiedene Proteine synthetisiert werden können. Das»Processing«von prä-r-rnas und prä-t-rnas ist einfacher, da Nucleasen bestimmte Konformationsmerkmale erkennen. Die prä-r-rna ist ein 4 S-Komplex, aus dem die 28 S-, 18 S- und,8 S-r-RNAs heraus geschnitten werden. Die S-r-RNA wird von einem anderen Gen geliefert und durch Polymerase III transkribiert. Die Assemblierung mit Proteinen erfolgt ebenfalls im Nucleolus, wird aber erst im Zytoplasma komplettiert. Die prä-t-rnas werden sowohl vom - als auch vom 3 -Ende verkürzt und erst dann die CCA- Sequenz an das 3 -Ende angebunden. Weiterhin finden posttranskriptional zahlreiche Basenmodifikationen statt. Merke Transkription ist die Überschreibung einer DNAin eine RNA-Sequenz durch DNA-abhängige RNA- Polymerasen. Die Polymerasen erkennen und binden mit Hilfe von Transkriptionsfaktoren an ihre Promotoren, von denen aus die Transkription beginnt. RNA-Polymerase I transkribiert r-rna-gene 6 im Nucleolus; RNA-Polymerase II transcribiert m-rna-gene im Kern, sie ist durch α-amanitin, das Gift des Knollenblätterpilzes hemmbar; RNA-Polymerase III transkribiert im Zellkern t-rna- und andere S-RNA-Gene, sie ist durch hohe α-amanitin-konzentrationen hemmbar. RNA-Polymerasen benötigen keine Primer. Die Transkriptionsprodukte müssen durch ein Processing in die reifen RNA-Formen überführt werden, um den Zellkern verlassen zu können. Die verschiedenen pro-rna-formen unterliegen einem unterschiedlichen Zurechtschneiden..2. Translation Translation bedeutet die Übersetzung des in der m-rna enthaltenen genetischen Codes in eine Aminosäuresequenz. Der Code besteht aus 64 Codons, davon sind 3 Stopp-Codons. Der genetische Code ist ein Triplett-Code, d. h. 3 Basen in Sequenz bestimmen die Aminosäure. Er ist degeneriert, da mit Ausnahme von Met und Trp alle Aminosäuren mehrere Basentripletts haben. 61 Codons codieren 20 Aminosäuren. Er ist universell, da alle Lebewesen für die Translation fast den gleichen Code benutzen (in Mitochondrien gibt es z. B. Abweichungen). Für die Spezifität des Codes sind die ersten beiden Basen im Triplett verantwortlich. In der dritten Position wird lediglich zwischen Purin- und Pyrimidinbase unterschieden. Diese dritte Base paart mit der ersten Base im Anticodon-Bereich der t-rna, die meist Hypoxanthin ist und sowohl mit Pyrimidinen als auch Purinen paaren kann (wobble- oder Wackelsitz-Paarung). Daraus ergeben sich folgende Konsequenzen: 4 Eine Punktmutation der dritten Base des Codons wirkt sich biologisch nur dann aus, wenn ein Stopp- Codon entsteht. 4 Die Bindung zwischen Codon- und Anticodon-Bereich ist nicht so stabil, wie wenn 3 Basen über Wasserstoffbrücken verbunden wären. Es muss also im Translationsprozess weniger Energie zur Auflösung der Basenpaarungen zwischen dem Codon auf der m-rna und dem Anticodon auf der t-rna aufgewendet werden. 4 Die zweite Base entscheidet, ob die Aminosäure hydrophile oder hydrophobe Reste besitzt. Bei Mutationen der zweiten Base werden hydrophobe gegen hydrophile Reste ausgetauscht. Der genetische Code ist konservativ.

14 90 Kapitel Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information Prüfungsfallstricke Die codogene Basensequenz einer m-rna besteht aus 3000 Basen, die die Aminosäuresequenz eines Proteins aus 1000 Aminosäuren bestimmt. Bei einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 100 für eine Aminosäure hätte das Protein ein Molekulargewicht von Ribosomen sind die Organellen, an denen sich im Zytoplasma und in den Mitochondrien die Proteinbiosynthese vollzieht. Die kleine Untereinheit des Ribosoms ist primärer Datenempfänger und Datenleser über die Bindung von m-rna und Start-Aminosäure. Die große Untereinheit ist die eigentliche Fabrik der Proteinsynthese. Bei Eukaryonten codiert eine m-rna eine Polypeptidkette. Sie ist monocistronisch. Die Proteinsynthese verläuft vom N- zum C-terminalen Ende. Dabei wird die m-rna in -3 -Richtung abgelesen. Eine m-rna wird nicht nur durch ein, sondern durch mehrere Ribosomen unter Polysomenbildung translatiert. Ähnlich wie bei der Replikation und Transkription kann auch bei der Proteinbiosynthese zwischen Initiation, Elongation und Termination unterschieden werden (. Tab..4). Der erste Schritt der Proteinbiosynthese besteht in einer Aktivierung der Aminosäuren und ihrer Bindung an die CCA-Sequenz der t-rnas. Für jede Aminosäure gibt es mindestens eine t-rna entsprechend der Degeneriertheit des Codes. Die dafür notwendigen Enzyme sind die Aminoacyl-t-RNA-Synthetasen. Die Reaktion besteht aus 2 Einzelschritten: 4 Aktivierung der Aminosäure mit ATP unter Bildung eines Aminoacyladenylats (Aminoacyl- AMP) unter Freisetzung von Pyrophosphat und Hydro lyse des Pyrophosphats (Analogie zur Aktivierung von Fettsäuren); 4 Übertragung des Aminoacyladenylats auf die Ribose des 3 -terminalen Adenosinrests der t-rna unter Bildung einer Aminoacyl-t-RNA. Diese Reaktionen sind hochspezifisch und manche Synthetasen besitzen Korrekturfähigkeit. So kann z. B. bei der Aktivierung von Leucin ein falsch gebundenes Valin aus dem Aminoacyl-t-RNA-Komplex wieder abgespalten werden. Die Startaminosäure ist Methionin. Für die Ini tiation, Elongation und Termination werden Initiations(eIF)-, Elongations(eEF)- und Freisetzungsfak toren (erf) benötigt, die Proteine mit sehr speziellen Funktionen sind. Die für die Knüpfung von Peptidbindungen notwendige Energie wird durch GTP bereitgestellt. Die Initiation der Proteinbiosynthese beginnt mit der Bindung von Methioninyl-t-RNA an den eif2 unter Beteiligung von GTP und die Übertragung auf die kleine Untereinheit des Ribosoms (40S). Für die Initiation muss das Ribosom in seine kleine und große Untereinheit dissoziiert sein. Danach erfolgen die Bindung der m-rna und die Zuordnung der Methioninyl-t-RNA an das Startcodon AUG der m-rna unter Mitwirkung von eif1 und Verbrauch von ATP. Der nächste Schritt ist die Anlagerung der großen ribosomalen Untereinheit (60 S). Unter Spaltung des GTP dissoziieren alle eif aus dem Initiationskomplex ab. Im Initiationskomplex sind mehrere Bindungsstellen entstanden (. Abb..6): 4 die Peptidyl- oder P-Stelle, an die die Startaminosäure-t-RNA gebunden ist und 4 die Akzeptor- oder A-Stelle, an die die nächste Aminoacyl-t-RNA gebunden wird. In die E-Position (exit) gelangen die freien t-rnas nach Ausbildung einer Peptidbindung. Die Elongation erfolgt durch Bindung einer Aminoacyl-t-RNA mittels eef1 und GTP an der A-Stelle (. Abb..7). Die nächsten Schritte bestehen in 4 der Übertragung der in P-Stellung stehenden Aminosäure auf die in A-Stellung befindliche Aminosäure durch die aus dem Ribosom stammende Peptidyltransferase-Aktivität unter Bildung einer Peptidbindung und. Tab..4. Die Proteinbiosynthese Schritt Mechanismus Produkt und Reaktion 1 Präinitiation Bildung des aktivierten Aminoacyl-t-RNA-Komplexes 2 Initiation Bildung des Startkomplexes aus Startaminosäure-t-RNA, kleiner ribosomaler Untereinheit, m-rna, Assemblierung mit der großen Untereinheit, GTP-Verbrauch 3 Elongation Polypeptid-t-RNA, Aminosäure-t-RNA, Verbrauch von GTP, Ausbildung der Peptidbindungen 4 Termination Freisetzung der Polypeptidkette und der letzten t-rna, GTP-Verbrauch

15 .2 Nucleinsäuren 91. Abb..6. Initiation der Proteinbiosynthese (aus Löffler 200) 4 der Abspaltung der nicht mehr nötigen t-rna, ihre Verlagerung in den E-Ort und die Translokation des entstandenen Peptids in den P-Ort unter Spaltung von GTP unter Mitwirkung von eef2. Die Termination findet statt, wenn ein Stopp-Codon in den A-Ort einrückt. Dann binden erf und GTP an das Ribosom. Dadurch werden die Peptidkette und die letzte t-rna unter GTP-Spaltung freigesetzt. Die Proteinsynthese kann durch Phosphorylierung von eif2 reguliert werden. Der phosphorylierte eif2 bindet an einen Guaninnucleotid-Austauscherfaktor und wird dadurch inaktiv. Nach Dephosphorylierung spaltet der Komplex wieder auf. Häm hemmt die Phosphorylierung von eif2 und fördert dadurch die Globinsynthese in den Retikulozyten. Die Stabilität der m-rna im Zytosol ist ebenfalls eine Möglichkeit zur Regulation der Proteinsynthese. Die Proteinbiosynthese ist sehr energieaufwändig. ATP wird für die Aktivierung der Aminosäuren, für die Sortierung der m-rna an der kleinen Untereinheit des Ribosoms sowie für die Funktionen der Chaperone verbraucht. GTP

16 92 Kapitel Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information. Abb..7. Elongationsprozesse bei der Proteinbiosynthese (aus Löffler 200) ist für die Initiation, Elongation und Termination erforderlich. Die im Zytoplasma verbleibenden Proteine sowie die für den Import in Kern, Mitochondrien oder Peroxisomen vorgesehenen Proteine werden an freien Polysomen im Zytoplasma synthetisiert. Die Bildung von Proteinen, die in das endoplasmatische Retikulum, in die Lysosomen oder in die Zellmembran gelangen sollen oder zum Export aus der Zelle durch Exozytose vorgesehen sind, werden am endoplasmatischen Retikulum (raues ER) synthetisiert, zum Golgi-Komplex befördert und in Vesikel verpackt. Die Synthese dieser Proteine beginnt zunächst im Zytoplasma mit der Bildung einer N-terminalen Signal sequenz aus etwa 20 Aminosäuren. Diese wird an ein im Zytoplasma befindliches Ribonucleoprotein (SRP= signal recognition particle, kleine zytoplasmatische RNA, sc-rna) gebunden, wodurch der Fortgang der Proteinsynthese unterbunden wird. Über einen SRP-Rezeptor auf der Membran des endoplasmatischen Retikulums wird der SRP-markierte Peptid-Ribosomenkomplex gebunden und auf einen spezifischen Ribosomenrezeptor (Translocon) umgelagert. Dadurch geht die Proteinsynthese im Lumen

17 .2 Nucleinsäuren 93 des endoplasmatischen Retikulums weiter. Durch eine Signalpeptidase wird das Signalpeptid abgespalten. Prüfungsfallstricke Das Signalpeptid enthält einen hohen Anteil von Aminosäuren mit hydrophoben Resten und wird nicht im endoplasmatischen Retikulum glycosyliert. Proteine, die mit einer Signalsequenz synthetisiert werden, heißen Prä-Proteine. Ist eine limitierte Proteolyse notwendig, um sie in ihre biologisch aktive Form zu überführen, handelt es sich um Pro-Proteine. Ein Prä- Pro-Protein ist demzufolge ein Translationsprodukt, welches am endoplasmatischen Retikulum synthetisiert und posttranslational durch die Signalase und weitere Proteasen in das aktive Protein umgewandelt werden muss. Prüfungsfallstricke Glycoproteine werden nicht an den zytosolischen freien Polysomen gebildet. Hemmstoffe der Proteinbiosynthese haben therapeutische Bedeutung (. Tab..). Das Diphtherietoxin hemmt durch Poly-ADP- Ribosylierung eines Diphthamidrests den Elongationsfaktor eef-2 (= Translokase) und damit die Translation. Diphthamid ist eine posttranslationale Histidinmodifikation. Merke In der Präinitiation werden Aminoacyl-t-RNA- Kompexe gebildet. Die Met-t-RNA als Startaminosäure, m-rna, die kleine Ribosomenuntereinheit, Initiations- 6 faktoren und GTP bilden einen Startkomplex, der durch die große ribosomale Untereinheit komplettiert wird. Die Met-RNA befindet sich am P-Ort des Ribosoms. Am A-Ort wird die nächste Aminoacyl-t-RNA mit GTP gebunden. Es erfolgt die Übertragung der am P-Ort gebundenen Aminosäure auf die am A-Ort befindliche Aminosäure unter Ausbildung einer Peptidbindung und die GTP-abhängige Translokation in den P-Ort. Der Vorgang wiederholt sich, bis ein Stopp-Codon auf der m-rna erscheint. Zytoplasmatische Proteine, nucleare, mitochondriale und peroxisomale Proteine werden durch freie Polysomen synthetisiert. Proteine für das endoplasmatische Retikulum, den Golgi-Komplex, Lysosomen und Zellmembranen sowie extrazelluläre Proteine werden mit einer Signalsequenz synthetisiert (Prä-Proteine), die das Anbinden der Polysomen an das endoplasmatische Retikulum gewährleistet. Die Proteine werden im endoplasmatischen Retikulum und im Golgi-Komplex posttranslational modifiziert und in Vesikel verpackt. Die Einnahme der nativen Konformation der neu synthetisierten Proteine wird durch Chaperone und Enzyme beschleunigt. Pro-Proteine müssen durch limitierte Proteolyse in die funktionsfähigen Proteine überführt werden..2.6 Regulation der Genexpression Die Regulation der Genexpression beinhaltet nicht nur die Beeinflussung der Ablesbarkeit der DNA bei der Transkription, der Aktivität insbesondere der RNA- Poly merase II, sondern auch die Regulation des Transports durch die Kernporen und die Abbauprozesse von RNA im Zytoplasma. Einige Möglichkeiten der Regulation sind: 4 Methylierung von Cytosin führt zu Inaktivierung, Demethylierung zu Aktivierung von Genen,. Tab... Hemmstoffe der Proteinbiosynthese Hemmer Gehemmte Reaktion Therapeutische Anwendung Tetrazykline Bindung der Aminoacyl-tRNA an die Akzeptorstelle von 70S-Ribosomen von Bakterien Breitbandantibiotikum Streptomycin Bindung an 30S-Untereinheit von Tuberkulose-Bakterien Tuberculose Chloramphenicol Hemmung der Peptidyltransferase von 70S-Ribosomen Antibiotikum zweiter Wahl Diphtherietoxin Hemmung der Translocase in 80S-Ribosomen

18 94 Kapitel Speicherung, Übertragung und Expression genetischer Information 4 Methylierungen/Demethylierungen von Histonen u. a. postranslationale Modifikationen am Chromatin beeinflussen die Genaktivität. Durch Modifikation basischer Aminosäuren in den Histonen werden die Wechselwirkungen mit der sauren DNA abgeschwächt, 4 durch Ligandenbindung aktivierte Transkriptionsfaktoren fördern die Bildung spezifischer Initiationskomplexe der RNA-Polymerase, Beispiel: DNA- Bindung von durch Steroidhormone aktivierten Rezeptoren, 4 Hemmung des Transports von Transkriptionsfaktoren vom Zytoplasma in den Kern, z. B. Bindung von NF-κB an IκB, 4 Bindung der m-rna im Zytoplasma an Proteine verhindert ihren Abbau, z. B. Stabilisierung der Transferrinrezeptor m-rna. Hormonrezeptoren im Zytoplasma (z. B. für Steroidhormone, Retinsäure, T 3 ) werden durch Bindung ihrer Liganden aktiviert, dimerisieren, wandern in den Zellkern und binden in der großen Furche an die DNA. Sie enthalten folgende Domänen: 4 für die Bindung des Hormons 4 trans-elemente für die DNA-Bindung (cis-ele mente auf der DNA, die Palindrome darstellen können), 4 für die Aktivierung des Initiationskomplexes der Transkription. Für die Bindung an die DNA ist eine Dimerisierung der durch Liganden aktivierten Transkriptionsfaktoren notwendig. In der DNA-Bindungsdomäne dieser Proteine finden sich folgende Strukturen: 4 Zink-Finger (Komplexierung eines Zn-Atoms durch Cys- oder His-Reste führt zu einer Proteinschleife): zu den Zn-Finger-Proteinen gehören die Rezeptorproteine für Steroidhormone, T 3, Calcitriol und Retinoide, 4 Leucin-Zipper; eine leucinreiche Helix bewirkt die Dimerisierung über hydrophobe Wechselwirkungen; CREB (camp-responsives Element-bindendes Protein) ist ein solcher Ligand, 4 Helix-Loop-Helix-Elemente; Schleifenstrukturen, die durch die Wechselwirkungen von 2 Helices gebildet werden. Prüfungsfallstricke Über die Erhöhung des zellulären camp-spiegels können Gene aktiviert werden, die ein camp-responsives Element (CRE) in ihrer Regulatorregion enthalten. camp-bindende Proteine (CREB) aktivieren diese Gene. Merke NF-κB aktiviert im Genom eine Vielzahl von Genen, die im Zusammenhang mit oxidativem Stress und akuten Entzündungsreaktionen stehen. Er liegt im Zytoplasma im Komplex mit IκB vor und ist inaktiv. Durch Phosphorylierung von IκB durch verschiedene Kinasen wird der Komplex gelöst. NF-κB wandert in den Zellkern. IκB wird in Proteasomen abgebaut. Die Proteinsynthese wird in der Initiationsphase durch Phosphorylierung des eif-2 reguliert, der dadurch inaktiviert wird. Die eif-2-kinase wird durch Interferone, Hitzeschock, Mangel an Wachstumsfaktoren und Aminosäuren aktiviert und durch Häm gehemmt. Häm stimuliert dadurch die Globinsynthese in den erythrozytären Vorstufen. Hemmstoffe der Genexpression finden unter verschie denen Gesichtspunkten in Forschung und Praxis Anwendung. Solche Pharmaka sollten bakterielles Wachstum und damit Infektionen bekämpfen oder proliferatives und metastasierendes Wachstum von Tumoren verhindern. Die erste Gruppe von Substanzen sollte selektiv für prokaryontische Prozesse, die zweite Gruppe gut verträglich für den Menschen sein, d. h. Tumorselektivität besitzen.. Tab..6. Substanzen mit antiproliferativen Wirkungen Antibiotikum Wirkungsmechanismus Organismus Rifamycin und Rifampicin Actinomycin Erythromycin binden an die bakterielle RNA-Polymerase und hemmen den Start der Transkription, Hemmung der RNA-Polymerase (Therapeutikum) interkaliert in der DNA-Doppelhelix und hemmt dadurch die RNA-Polymerase (Einsatz in der Forschung) hemmt die Translokation des Codons an der großen Untereinheit des Ribosoms (Therapeutikum) Prokaryont Pro- und Eukaryont Prokaryont

19 .2 Nucleinsäuren DNA- und RNA-Viren Viren sind Zellparasiten, die sich nicht selbst replizieren können. Sie infizieren Zellen und verwenden die zelleigenen Replikations-, Transkriptions- und Translationsmechanismen sowie die vorhandenen Energiequellen und Bausteine für ihre Vermehrung. Viren sind infektiöse Partikel aber keine Lebewesen die beim Menschen schwere Infektionen verursachen können. Sie zeigen einen sehr ähnlichen Aufbau. Im Inneren der Viren ist einzel- oder doppelsträngige DNA (DNA-Viren) oder einzel- oder doppelsträngige RNA (RNA-Viren) lokalisiert. An die Nucleinsäuren sind Proteine gebunden. Der Nucleinsäure-Protein-Komplex ist das Nucleocapsid. Als Bestandteile kommen virale Proteine, aber auch zelleigene Proteine, wie Histone, vor. Das Nucleocapsid ist von einer Proteinhülle umgeben, dem Capsid, welches aus Untereinheiten, den Capsomeren, besteht. Weiterhin können Viren eine Hüllmembran besitzen, deren Lipidkomponenten von den Viren selbst gebildet werden oder den Membranlipiden der infizierten Zelle entstammen. Viren haben keinen eigenen Stoffwechsel. Zur Synthese ihrer Nucleinsäuren und Proteine nutzen sie den genetischen Apparat der Wirtszelle. Prüfungsfallstricke Viren sind keine Lebewesen und demzufolge nicht den Prokaryonten zuzuordnen. Viren sind unabhängige genetische Elemente. Die Infektion beginnt mit der Adsorption der Viren an die Zellmembran der Wirtszelle. Dabei binden sie an spezifische Strukturen der Zellmembran, wie Rezeptoren, Cadherine oder Integrine, die als Virus-Rezeptoren wirken. Penetration bedeutet das Eindringen in die Wirtszelle mittels Endozytose. Danach findet die Freisetzung der Nucleinsäuren statt. Die DNA der DNA-Viren wird in das Genom der Wirtszelle aufgenommen. Produktive Virusinfektionen bestehen in einer massiven Neubildung von Viren, die die Zellen durch Zelllyse (lytischer Weg) oder Knospung unter Mitnahme von Zellmembranbestandteilen verlassen. Latenz bedeutet, dass das Virus in die Zelle integriert ist. Das Virusgenom wird dann, wenn überhaupt, nur in geringem Maße repliziert (lysogene Viren). Das Genom der für den Menschen pathogenen RNA-Viren ist klein und überwiegend einsträngig. RNA-Viren können sich nach unterschiedlichen Mechanismen vermehren: 4 Zeigt die Virus-RNA eine so genannte (+)-Polarität, so kann sie direkt als m-rna in der Zelle dienen. Für ihre Replikation wird sie durch eine virale RNA-abhängige RNA-Polymerase in einen ( )-Strang umgeschrieben, der als Matrize für die Replikation neuer (+)-RNA dient. 4 Virus-RNA mit primärer ( )-Polarität muss durch die RNA-abhängige RNA-Polymerase in einen (+)-Strang umgeschrieben werden, der dann als m-rna verwendet wird. 4 Retroviren wie HIV-I bilden ein diploides RNA-Genom aus, welches durch die viruseigene reverse Transkriptase in DNA umgeschrieben und als Provirus-DNA in das Wirtsgenom aufgenommen wird. Die reverse Transkriptase katalysiert die Synthese eines DNA-Strangs, der zur Virus-RNA komplementär ist. Anschließend baut sie den RNA-Strang im DNA-RNA-Hybrid ab und ersetzt ihn durch DNA. Die virale RNA sowie Proteine werden vom Wirtsgenom aus transkribiert und translatiert. Die neuen Viren verlassen die Zelle durch Knospung. HIV-Viren befallen v. a. T-Lymphozyten und Makrophagen. Diese sterben nach Wochen bis Monaten ab. Merke Das besonders Gefährliche am HIV ist seine hohe Mutationsrate. Beispiele für RNA-Viren neben HIV sind: 4 Picornaviren: Einzelstrang-RNA mit Capsid; Polio- Virus verursacht Kinderlähmung, 4 Arboviren: Einzelstrang-RNA mit Capsid und Hülle; Tollwut-Virus, 4 Myxoviren: Einzelstrang-RNA mit Capsid und Hülle; Influenza-Virus. DNA-Viren translozieren ihre meist doppelsträngige DNA in den Zellkern. Durch die zellulären Transkriptionsmechanismen entstehen virale m-rnas, die virale Proteine translatieren. Für die Replikation der viralen Genome gibt es unterschiedliche Mechanismen, wobei die zelleigene Replikationsmaschinerie, aber auch die reverse Transkription (z. B. Hepatitis B-Virus) verwendet wird. DNA-Viren sind: 4 Poxviridae: Doppelstrang-DNA mit Capsid und Hülle, Pocken-Virus, 4 Herpes-Viren: Doppelstrang-DNA mit Capsid und Hülle, Herpes-simplex-Virus, 4 Papova-Viren: Doppelstrang-DNA mit Capsid und ohne Hülle, Papilloma-Virus, welches Hautwarzen (einige Typen auch Genitalwarzen) verursacht.