mikrornas regulieren essenzielle Funktionen im kardiovaskulären mirnas control essential functions of the cardiovascular system

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1 mikrornas regulieren essenzielle Funktionen im kardiovaskulären mirnas control essential functions of the cardiovascular system Böttger, Thomas Max-Planck-Institut für Herz- und Lungenforschung, Bad Nauheim Korrespondierender Autor Zusammenfassung Die primäre Funktion von mikrornas (mirnas) besteht darin, die Genexpression von spezifischen Zielproteinen posttranskriptionell zu unterdrücken. Die funktionelle Analyse von mirna-funktionen in vivo ermöglicht faszinierende Einblicke in komplexe Regulationsvorgänge. Eine Arbeitsgruppe am MPI für Herz- und Lungenforschung untersucht, wie mirnas molekulare Regulationsvorgänge in den kontraktilen Zellen des kardiovaskulären s vermitteln. Die Arbeiten geben auch Aufschluss über die Entwicklung und Physiologie des Herz-Kreislauf-s. Summary The primary function of mirnas is the posttranscriptional regulation of gene expression. The functional analysis of mirna-mediated regulation allows fascinating insights into complex regulatory interactions. A group at the MPI of Heart and Lung Research investigates mirna-dependent molecular mechanisms in contractile tissues of the cardiovascular system. The work reveals basic principles of mirna regulation and answers fundamental questions related to development and physiology of the cardiovascular system. MikroRNAs (mirnas) sind kurze, nicht kodierende RNAs, welche regulierend in viele biologische Prozesse eingreifen. Ein Ziel der Arbeitsgruppe von Thomas Böttger ist es, die Funktionen von mirnas im kardiovaskulären genauer zu bestimmen. mirnas sind im Genom kodierte RNA-Moleküle, die zunächst als längere Precursor-RNA-Moleküle transkribiert werden. Durch Prozessierung dieses Precursors über den bereits sehr gut untersuchten Drosha/DGCR8-Dicer-Mechanismus entstehen reife, zirka zwanzig Nukleotide lange mirna-moleküle, welche posttranskriptionell die Expression von Proteinen unterdrücken (reprimieren) können. Die Spezifität dieser Regulation ist durch die Komplementarität zwischen mirna und Sequenzbereichen der Protein-kodierenden messengerrnas (mrnas) bestimmt. Darunter versteht man, dass die Nukleotide der RNA- Stränge in bestimmten Bereichen über die komplementären Basenpaare zusammenpassen. Dabei ist jedoch keine komplette Komplementarität zwischen mirna und mrna erforderlich, vielmehr ist für eine regulatorische Interaktion zwischen mirna und mrna nur eine partielle Komplementarität notwendig. Die Interaktion von mirna und mrna wird durch weitere Bedingungen wie beispielsweise die Konzentration und Konformation der 2016 Max-Planck-Gesellschaft 1/7

2 Zielmoleküle, RNA-bindende Proteine oder auch durch andere, im Einzelfall weniger gut untersuchte Faktoren festgelegt. Während sich aufgrund der partiellen Komplementarität zwischen mirna und mrna potenzielle Zielgene relativ einfach ermitteln lassen, ist die tatsächliche Interaktion aufgrund der Komplexität des zellulären Kontexts nur im jeweiligen physiologisch relevanten zellulären bestimmbar. Außerdem hat nicht jede regulatorische Interaktion in einem spezifischen physiologischen Kontext eine fassbare Auswirkung auf das Gesamtsystem. Daher ist die Untersuchung der mirna-funktion im physiologisch relevanten Kontext unumgänglich. Ein wichtiges Mittel für die Untersuchung physiologisch relevanter Regulationsvorgänge sind somit in vivo durchgeführte loss-of-function-studien. Die Arbeitsgruppe am MPI für Herz- und Lungenforschung konzentriert sich mit ihren funktionellen Analysen auf mirnas, die spezifisch und in großer Menge in den kontraktilen Zellen des kardiovaskulären s exprimiert werden. Das mir-143/145-cluster bestimmt den Phänotyp vaskulärer glatter Muskelzellen A bb. 1: Die m irnas m ir-143 und m ir-145 sind notwendig für die Aufrechterhaltung der Kontraktilität und des kontraktilen Phänotyps der glatten Muskelzellen der Blutgefäße (oben). Bei Verlust der m irna-expression (unten) kom m t es zur Vergrößerung des Blutgefäßdurchm essers und zur Bildung von arteriosklerotischen Plaques, welche durch wandernde synthetische glatte Muskelzellen (Pfeile) initiiert werden. Glatte Muskelzellen (grün; anti-sm ooth m uscle actin); Endothelzellen (rot; BF1-Lectin), Zellkerne (blau; DAPI). MPI für Herz- und Lungenforschung/Böttger Die mirnas mir-143 und mir-145 werden in hoher Konzentration und Spezifität in den glatten Muskelzellen der Blutgefäße exprimiert. Die beiden mirnas sind im Genom der Säugetiere eng benachbart lokalisiert und werden als Bestandteil einer gemeinsamen Precursor-RNA transkribiert. Nach Prozessierung der Precursor-RNA entstehen zwei separate, reife mirna-moleküle, die teilweise überlappende Funktionen ausüben. Die Generierung von mir-143 und mir-145 aus einer Precursor-RNA legt nahe, beide Moleküle als eine regulatorische Einheit zu betrachten. Die Deletion der beiden mirnas im Genom der Maus ermöglichte den 2016 Max-Planck-Gesellschaft 2/7

3 Wissenschaftlern einen Einblick in die Bedeutung der mirnas für die Funktion der glatten Muskelzellen der Blutgefäße und die zugrundeliegenden regulatorischen Prozesse. So führt die Deletion des mirna-clusters zu vermindertem Blutdruck, welchen die Forscher auf verminderte basale und Agonist-induzierte Kontraktilität der Blutgefäße zurückführen konnten. Betroffen sind dabei sowohl die durch adrenerge Stimulation induzierte Kontraktilität, als auch die durch Angiotensin-II-induzierte Kontraktion der Blutgefäße. Weiterhin beobachteten die Forscher die Ausbildung arteriosklerotischer Veränderungen in den Blutgefäßen der Tiere, die mir-143/145 nicht mehr exprimierten (Knockout-Mäuse). Im Gegensatz zu sonst üblichen Modellen von Arteriosklerose in der Maus wurden diese Veränderungen nicht durch erhöhte Blutfettwerte ausgelöst, sondern sie beruhten offensichtlich primär auf der Migration von glatten Muskelzellen in eine sich dann bildende krankhaft verdickte innere Blutgefäßwand (Neointima) (Abb. 1). Basierend auf Analysen des Proteoms und des Transkriptoms identifizierten Böttger und sein Team ein Set von direkt durch mir-143/145 regulierten Proteinen, wobei die durch mir-145 vermittelte Repression des angiotensin converting enzyme (ACE) von besonderer Bedeutung für die Funktion der vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) ist. Die Arbeit der Max-Planck-Forscher belegt, dass die Repression von ACE durch mir- 145 in vivo essenziell für die Sensitivität von VSMCs gegenüber den Kontraktion-induzierenden und Blutdruckregulierenden Agonisten ist. Vermehrte Aktivität von ACE in glatten Muskelzellen ist auch ein Auslöser für ihre phänotypische Veränderung und die beobachtete Arteriosklerose (Abb. 2). Die bisherigen Arbeiten identifizierten weitere interessante Zielmoleküle von mir-143/145, deren Regulation bedeutsam für die Funktion der vaskulären glatten Muskelzellen ist und deren Funktion die Wissenschaftler gegenwärtig untersuchen Max-Planck-Gesellschaft 3/7

4 A bb. 2: Die m irnas m ir-143/145 sind im Zellkern kodiert und reprim ieren posttranskriptionell die Expression des Proteins angiotensin converting enzyme (ACE; grün). Diese Repression ist notwendig, um in glatten Muskelzellen die Expression von m em brangebundenem ACE zu unterdrücken. Nur durch diese Repression wird verhindert, dass der Agonist Angiotensin II direkt an den glatten Muskelzellen freigesetzt wird und so wird eine Dauerstim ulation der glatten Muskelzellen durch den Kontraktion-induzierenden Agonisten Angiotensin II verm ieden. Der Verlust dieser Repression durch Deletion von m ir-143/145 führt zur direkten Freisetzung von Angiotensin II an den glatten Muskelzellen der Blutgefäße. Die dauerhafte Autostim ulation der glatten Muskelzellen durch den Agonisten Angiotensin II führt einerseits zu Desensitivierung der die Kontraktion regulierenden Signalwege, beispielsweise durch Reduktion der Abundanz der Angiotensinrezeptoren (AT1R). Weiterhin führt die dauerhafte Stim ulation der glatten Muskelzellen durch Angiotensin II auch zu einer Modulation des Phänotyps der glatten Muskelzellen vom kontraktilen zum synthetischen Phänotyp, welcher auch eine verm ehrte Migration der glatten Muskelzellen beinhaltet. Physiologisch ist dieser Wechsel bedeutsam für die Anpassung des Blutgefäßsystem s an physiologische Erfordernisse, pathophysiologisch ist dieser Prozess jedoch unter anderem an der Ausbildung von arteriosklerotischen Plaques beteiligt. MPI für Herz- und Lungenforschung/Böttger Die mir-1/133-cluster sind essenziell für die Entwicklung des embryonalen Herzens Die mirnas mir-1 und mir-133 gehörten zu den ersten in Säugetieren identifizierten mirna-molekülen; dennoch ist ihre physiologische Bedeutung bisher nur unvollständig verstanden. Die beiden mirnas sind im Genom in zwei mir-1/133-clustern kodiert und beide Cluster sind spezifisch in Herzmuskelzellen (Kardiomyozyten) und Skelettmuskelzellen exprimiert. Dabei ist die mirna mir-1 die in diesen beiden Zelltypen häufigste mirna, ca. 80 Prozent der gefundenen mirnas sind mir-1-moleküle Max-Planck-Gesellschaft 4/7

5 Die Deletion nur eines der beiden mir-1/133-cluster aus dem Genom der Maus zeigt, dass die mirna-cluster im erwachsenen Herzen an der Modulation der elektrophysiologischen Eigenschaften der Kardiomyozyten beteiligt sind. Die Verringerung der Menge an mir-1/133 führt zur Ausbildung eines sog. Long-QT-Syndroms, welches beim Menschen Ursache des plötzlichen Herztodes sein kann. Die Deletion beider mir-1/133-cluster führt zum Komplettverlust von mir-1/133 und zeigt, dass diese beiden mirnas unerlässlich für definierte Differenzierungsschritte bei der embryonalen Herzentwicklung sind. Es ist seit langem bekannt, dass das Herz in frühen Embryonalstadien durch eine ausgeprägte Expression von Proteinen charakterisiert ist, die eigentlich für glatte Muskelzellen spezifisch ist. Die Expression dieser Proteine wird in der weiteren embryonalen Entwicklung massiv zugunsten von Kardiomyozyten-spezifischen Proteinen reduziert. Die MPI-Wissenschaftler konnten zeigen, dass die mirnas mir-1/133 im embryonalen Herzen wesentlich für die Repression der sonst für glatte Muskelzellen spezifischen Proteine verantwortlich sind. Durch direkte Interaktion zwischen mirna und Protein-kodierender mrna reprimiert mir-1 die Expression des Transkriptionsfaktors Myocardin und begrenzt so die durch Myocardin vermittelte transkriptionelle Aktivierung einer Vielzahl von für glatte Muskelzellen spezifischen Genen. Eines dieser von Myocardin transkriptionell aktivierten Gene ist der für glatte Muskelzellen spezifische Kaliumkanal KcnmbI. Die Forscher konnten zeigen, dass KcnmbI nicht nur durch mir-1-vermittelte Regulation von Myocardin, sondern zusätzlich auch direkt durch mir-133 reguliert wird (Abb. 3) Max-Planck-Gesellschaft 5/7

6 A bb. 3: Die m irnas m ir-1 und m ir-133 sind spezifisch in Herz- und Skelettm uskelzellen exprim iert. Die beiden m irnas sind im Genom geclustert und werden von zwei genom ischen Clustern in vergleichbarem Maß exprim iert. Die physiologische Funktion der m irnas ist in hohem Maße vom Zelltyp und dem Entwicklungsstand des Zelltyps abhängig. In em bryonalen Kardiom yozyten ist das Protein Myocardin ein entwicklungsbiologisch relevantes direktes Ziel der posttranskriptionellen Repression durch m ir-1. Der Transkriptionsfaktor Myocardin aktiviert insbesondere die Transkription von sonst für glatte Muskelzellen (SM) charakteristischen Proteinen. Eines dieser Gene codiert für den Kalium kanal KCNMBI. Die inhibitorische Modulation der Expression von Myocardin durch m ir-1 ist wesentlich für die entwicklungsbiologisch bedeutsam e Eingrenzung der Expression von für glatte Muskelzellen spezifischen Genen in em bryonalen Kardiom yozyten. Als weitere Kom ponente m oduliert m ir-133 die Expression von Proteinen; insbesondere wird auch die Expression des Kalium kanals KCNMBI reprim iert. Som it wirken m ir-1 und m ir-133 synergistisch. Myocardin aktiviert auch die Transkription der m ir-1/133-cluster und dam it seinen eigenen Repressor m ir- 1, aber auch den synergistisch wirkenden Korepressor m ir MPI für Herz- und Lungenforschung/Böttger Andererseits aktiviert Myocardin auch die Transkription seines Repressors mir-1/133, was zu einem komplexen Rückkopplungsmechanismus führt. Die durch die mirna mir-1 vermittelte Repression balanciert die Expression des Transkriptionsfaktors Myocardin und kontrolliert somit die Expression von Genen, welche üblicherweise für glatte Muskelzellen spezifisch sind, deren Expression aber im Verlauf der embryonalen Entwicklung von Kardiomyozyten zunehmend begrenzt werden muss. Aufgrund der Clusterung und gemeinsamen transkriptionellen Kontrolle von mir-1 und mir-133 gelangt mir-133 ebenfalls unter die Kontrolle dieses Regelkreises und kontrolliert koordiniert die Expression weiterer Proteine wie KcnmbI, welche von Myocardin 2016 Max-Planck-Gesellschaft 6/7

7 aktiviert werden können und deren Expression spezifisch in Kardiomyozyten begrenzt werden muss. Zusammengefasst ermöglichen mirnas, welche hier durch Clusterung zu funktionellen Einheiten zusammengefasst sind, eine weitere Ebene der Regulation, welche die Komplexität der Regulationsereignisse in eukaryotischen Zellen auf posttranskriptioneller Ebene massiv erhöht. Die Arbeitsgruppe um Böttger identifizierte mir-1/133 als einen essenziellen Bestandteil für einen lange bekannten, für die Entwicklung des Herzens bedeutsamen Prozess. Im Fokus der weiteren Untersuchungen stehen die molekularen Mechanismen der Funktion von mir-1/133 im adulten Herzen, sowohl im Zusammenhang mit der Steuerung physiologischer Prozesse, als auch bei pathophysiologischen Veränderungen. Literaturhinweise [1] Dahan, D.; Ekman, M.; Larsson-Callerfelt, A. K.; Turczynska, K.; Boettger, T.; Braun, T.; Sward, K.; Albinsson, S. Induction of angiotensin-converting enzyme after mir-143/145 deletion is critical for impaired smooth muscle contractility American Journal of Physiology Cell Physiology 307, C (2014) DOI: /ajpcell [2] Boettger, T.; Wust, S.; Nolte, H.; Braun, T. The mir-206/133b cluster is dispensable for development, survival and regeneration of skeletal muscle Skeletal Muscle 4, 23 (2014) DOI: /s [3] Besser, J.; Malan, D.; Wystub, K.; Bachmann, A.; Wietelmann, A.; Sasse, P.; Fleischmann, B. K.; Braun, T.; Boettger, T. MiRNA-1/133a Clusters Regulate Adrenergic Control of Cardiac Repolarization PLoS One 9, e (2014) [4] Wystub, K.; Besser, J.; Bachmann, A.; Boettger, T.; Braun, T. mir-1/133a Clusters Cooperatively Specify the Cardiomyogenic Lineage by Adjustment of Myocardin Levels during Embryonic Heart Development PLoS Genetics 9, e (2013) DOI: /journal.pgen [5] Hergenreider, E.; Heydt, S.; Treguer, K.; Boettger, T.; Horrevoets, A. J.; Zeiher, A. M.; Scheffer, M. P.; Frangakis, A. S.; Yin, X.; Mayr, M.; Braun, T.; Urbich, C.; Boon, R. A.; Dimmeler, S. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through mirnas Nature Cell Biology 14, (2012) DOI: /ncb2441 [6] Boettger, T.; Braun, T. A new level of complexity: the role of micrornas in cardiovascular development Circlation Research 110, (2012) DOI: /CIRCRESAHA [7] Boettger, T.; Beetz, N.; Kostin, S.; Schneider, J.; Krüger, M.; Hein, L.; Braun, T. Acquisition of the contractile phenotype by murine arterial smooth muscle cells depends on the Mir143/145 gene cluster Journal of Clinical Investigation 119, (2009) DOI: /JCI Max-Planck-Gesellschaft 7/7