96 Bestimmungen / tests

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1 V 20 DAO-Aktivität berechnet V 20 calculated activity of DAO Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung der Aktivität des Histaminabbaus durch DiAminoOxidase (DAO) in EDTA-Plasma Enzyme immunoassay for the quantitative determination of histaminedegradation activity by DiAmineOxidase (DAO) in EDTA-plasma SC Bestimmungen / tests Ziegelfeldstrasse 3 A-3430 Tulln Tel: FAX:

2 Inhalt / contents Einleitung... 3 Klinische Wertigkeit... 4 Testprinzip... 5 Inhalt des Kits... 6 Zusätzlich erforderliche Chemikalien und Geräte... 6 Testdurchführung... 7 Berechnung... 9 Referenzbereiche... 9 Technische Hinweise Vorsichtsmaßnahmen FAQs Notizen Introduction Clinical implication Principle of the assay Contents of the Kit Additional material and equipment required Performance of the assay Calculation Reference values Technical Hints Precautions FAQs: Personal Notes Literatur / References D-HIT_V20 2 /24

3 Einleitung Histamin ist eine einfache chemische Substanz mit einem Molekulargewicht von 111 Da. Histamin ist der wichtigste Mediator bei allergischen Erkrankungen wie Rhinitis allergica (Heuschnupfen) und Asthma bronchiale. Darüber hinaus ist Histamin der klassische Auslöser einer Urticaria (Nesselausschlag) und spielt bei Medikamenten-Allergien bzw. -Unverträglichkeiten eine wichtige Rolle. 1, 2 Ein Überschuss an Histamin, wie er im Rahmen der Histamin-Intoleranz (HIT) auftritt, ist die Ursache der verschiedenen physiologischen Wirkungen wie: Kopfschmerzen, verlegte bzw. rinnende Nase, Atemwegsobstruktionen, Tachykardie sowie Extrasystolen, weiters Magen- 3, 4, 5, 6, 7 Darmbeschwerden, die zu weichem Stuhl bis Durchfällen und Hypotonie führen können. Oft werden auch Schwellungen der Augenlider, gelegentlich auch urticarielle Exantheme beschrieben. Histamin wird vom Menschen selbst produziert und in Blut- und Gewebszellen (basophilen Granulozyten bzw. Mastzellen) gelagert und steht zur sofortigen Freisetzung jederzeit zur Verfügung 8. Darüber hinaus kann Histamin auch von außen in den Körper gelangen, einerseits durch Einatmen (inhalative Histamin-Provokation beim Atemtest) oder aber auf dem oralen Weg (durch Aufnahme von Speisen, die Histamin oder andere biogene Amine enthalten) 9. Enterozyten produzieren ein Enzym, das Histamin abbauen kann. Dieses Enzym heißt Diaminooxidase (DAO), hat ein Molekulargewicht von etwa 180 kda und enthält Kupfer. DAO ist hauptsächlich im Dünndarm, in der Leber, in den Nieren und in den weißen Blutkörperchen zu finden. Von DAO sind verschiedene Iso-Formen beschrieben, über deren Expression und Regulation noch keine Informationen vorliegen. Über die Substratspezifität zu Histamin, Putrescin und anderen Diaminen liegen widersprüchliche Angaben vor. Möglicherweise ist die unterschiedliche Ausprägung verschiedener Isoformen für die unterschiedliche Effizienz des Histaminabbaus im Falle von Histaminintoleranz verantwortlich 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Bei Schwangeren wird DAO zusätzlich in der Plazenta gebildet. Schwangere haben einen etwa 500 bis 1000 mal höheren Blut-DAO-Spiegel als Nicht-Schwangere, daher auch Beschwerdefreiheit bei Rhinitis allergica und Asthma bronchiale zwischen dem 3. und 9. Schwangerschaftsmonat 18. Aus diesem Grund kann das DAO-Messergebnis nicht für die Diagnose einer Histaminintoleranz herangezogen werden. DAO wird kontinuierlich produziert und in das Darmlumen abgeschieden. Bei einem gesunden Menschen wird histaminhältige Nahrung daher bereits im Darm weitgehend von Histamin befreit 19. Das verbleibende Histamin wird beim Durchtritt durch die Darmschleimhaut von der dort produzierten DAO abgebaut. Histamin wird zu Imidazolacetaldehyd und weiters zu Imidazolessigsäure zerlegt. Die Co-Faktoren der Diaminooxidase sind 6-Hydroxydopa und wahrscheinlich Pyridoxalphosphat, das Vitamin B6 20, 21, 22, 23, 24. Diaminooxidase ist ein empfindliches Enzym, das von verschiedenen Substanzen wie anderen biogenen Aminen, Alkohol, seinem Abbauprodukt Acetaldehyd und verschiedenen Medikamenten gehemmt werden kann. 25, 26 D-HIT_V20 3 /24

4 Klinische Wertigkeit Histamin-Intoleranz wird definiert durch ein Ungleichgewicht zwischen Histamin und dem Histamin-abbauenden Enzym Diaminooxidase. Nach bisherigen klinischen Erfahrungen ist Histamin-Intoleranz nicht angeboren - also genetisch bedingt - sondern ein erworbenes Krankheitsbild. Eine Ursache von Histamin-Intoleranz können Medikamente sein, die Hemmer der DAO sind. Hemmend auf die DAO wirken auch Alkohol und sein Abbauprodukt Acetaldehyd. Die Einnahme dieser Substanzen führt zu reduzierten DAO Messwerten. Die typischen Symptome der Histamin-Intoleranz sind Kopfschmerzen und Diarrhoe, aber auch Migräne, rinnende oder verlegte Nase, speziell im Zusammenhang mit Nahrungsmittel-Aufnahme, weiters Asthma bronchiale und Herzrhythmusstörungen, Hypotonie, Urticaria und Dysmenorrhoe (Schmerzen am ersten Tag der Regel) 27,28, 29. Die Diagnose der Histamin-Intoleranz erfolgt durch Anamnese und durch die Bestimmung der Aktivität der Diaminooxidase in Serum oder Plasma 30, 31. Das Einhalten einer histaminfreien Diät führt meist innerhalb weniger Wochen zu einer Reduktion der Symptome bis zur Beschwerdefreiheit. Eine DAO-Substitution mit Hilfe von vor der Mahlzeit eigenommenen Kapseln lindert ebenfalls die Symptome, kann aber aufgrund von einer begrenzten lokalen Wirkung im Darm den Blutwert der DAO nicht verändern. Da histamin-intolerante Patienten ein erhöhtes Operationsrisiko haben und auch typischerweise Röntgenkontrastmittel (Histamin-Liberatoren) aber auch Antirheumatika schlecht vertragen, kommt dem Krankheitsbild, dem eine Prävalenz von etwa 2-3% der Bevölkerung zugesagt wird, besondere Bedeutung zu. Die Diagnose einer Histamin-Intoleranz auf Basis der Aktivität der Diaminooxidase ist daher nur dann zulässig, wenn die DAO-Aktivität niedrig ist. Bei normaler Aktivität kann, bei gleichzeitig erhöhtem Histamin-Spiegel, sehr wohl auch eine Histamin-Intoleranz vorliegen. Speziell bei massiver Histamin-Belastung, wie z.b. im anaphylaktischen Schock werden erhöhte Diaminooxidase-Spiegel bei gleichzeitig massiv erhöhten Histamin-Spiegel gefunden. Daher ist die Interpretation der Diaminooxidase-Aktivität stets im Kontext mit der Klinik und der Anamnese des Patienten durchzuführen. In diesen Fällen könnte an eine gezielte Provokation unter klinischen Bedingungen gedacht werden oder aber an eine Blutabnahme nach einer unfreiwilligen (ungeplanten) Exposition mit Nahrungsmitteln, reich an biogenen Aminen. Bei einer Verlaufsmessung der Aktivität der Diaminooxidase lassen sich gute Schlüsse über die Histaminverträglichkeit des Organismus ziehen. Bei Patienten mit Uritcaria 32, 33, Morbus Crohn und Zöliakie haben erwiesenermaßen eine reduzierte DAO-Aktivität DAO ist als Marker für den Zustand der Darmmucosa beschrieben Patienten mit chronischer Darmentzündung haben daher meistens reduzierte DAO Aktivität 36. D-HIT_V20 4 /24

5 Testprinzip Als Probenmaterial werden 50 µl EDTA-Plasma eingesetzt. Die Aktivität von Diaminooxidase in der Probe wird mit diesem Assay über den Abbau von Histamin bestimmt. Das Ergebnis wird in HDU (Histamin-Degrading Units) pro ml angegeben. 1 HDU entspricht jener DAO-Aktivität, die im Assay 1 pmol/ml (0,11 ng/ml) Histamin abbaut. Alternativ in Diagnose und Forschung eingesetzte Assays zur Aktivitätsbestimmung setzen radioaktiv markiertes Putrescin als Substrat für die Diaminooxidase ein. Bitte beachten Sie, dass der Umsetzungsgrad von Putrescin und Histamin unterschiedlich 37,38 ist. Im ersten Inkubationsschritt werden 50 µl Probe und 50 µl Histaminlösung in ein leeres Well pipettiert. Bei der Inkubation über Nacht baut die in der Probe enthaltene Diaminooxidase das Histamin ab. DAO Das verbliebene Histamin wird im nächsten Schritt acyliert. Acylierung Das Reaktionsgemisch wird in die ELISA-Platte übertragen und Antikörper zugegeben. Im kompetitiven Assay konkurriert das Acylhistamin aus der Probe mit dem beschichteten Acylhistamin um die Bindungsstellen am Antikörper. Im folgenden Waschschritt werden alle ungebundenen Substanzen entfernt. Die Menge an gebundenem Antikörper wird mit einem HRPOmarkierten Zweitantikörper (Konjugat) bestimmt und ist direkt proportional zur Aktivität der DAO in der Probe. Die Aktivität der DAO wird in Histamin-Degrading Units (HDU) pro ml angegeben. D-HIT_V20 5 /24

6 Inhalt des Kits Standard Das Fläschchen enthält Diaminooxidase (DAO, EC ) aus Schweineniere, lyophilisiert. Die Aktivität der DAO ist 350 HDU/ml Kontrollen Die 2 Fläschchen enthalten Diaminooxidase (DAO, EC ) aus Schweineniere, lyophilisiert. Die aktuelle Aktivität ist dem Flaschenetikett und dem QC-Protokoll zu entnehmen. Inkubationsreagens, enthält lyophilisiertes Histamin (rosa) Inkubationsplatte (blau markiert) Antikörper lyophilisiert ELISA-Platte, mit Acyl-Histamin beschichtet Assay Reagent 35 ml, gebrauchsfertig 1 Fläschchen Acylierungsreagens 3 ml, gebrauchsfertig ACHTUNG: das Reagens erstarrt bei Temperaturen unter 18 C, dies führt zu KEINER Beeinträchtigung der Funktionsfähigkeit! Assaypuffer 30 ml, gebrauchsfertig 10x Waschpufferkonzentrat 60 ml Konjugat 13 ml, gebrauchsfertig Substrat 13 ml, gebrauchsfertig Stoplösung 7 ml, gebrauchsfertig Arbeitsanleitung 6 Abdeckfolien Qualitätskontrollblatt der aktuellen Charge 2 Ansatzprotokolle Zusätzlich erforderliche Chemikalien und Geräte Variable Pipetten für 20 µl bis 1000 µl, Mehrkanalpipette Multipette Combitips 10 µl oder 20 µl für die Multipette Inkubator 37 C (vorzugsweise Schüttelinkubator 37 C / 400 rpm) ELISA-Reader mit Filter für 450 nm (optional Referenzfilter 620 / 630 nm) Millimeterpapier oder Software zur Auswertung D-HIT_V20 6 /24

7 Testdurchführung Da die Aktivität der Diaminooxidase stark vom aktuellen pyhsischen Zustand der Patienten abhängig ist, muss die Probe während oder bis spätestens 2 Tage nach dem Auftreten von Symptomen der Histamin Intoleranz abgenommen werden! Frisch abgenommene Proben müssen nach der Abnahme innerhalb von 3 Stunden auf 2 C 8 C gekühlt werden. Für Langzeitlagerung müssen die Proben bei -20 C aufbewahrt werden. Der Versand von Proben muss gekühlt erfolgen! Lipämische und hämolytische Proben können zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Vor dem Einsatz im Test sind die Proben gut zu mischen. Alle Reagenzien sind vor Gebrauch auf Raumtemperatur zu bringen! Wir empfehlen, für alle Werte Doppelbestimmungen durchzuführen. ACHTUNG: Die Inkubationszeiten in Klammer sind anzuwenden, wenn kein Schüttler verwendet wird oder wenn der Assay in einem ELISA-Roboter abgearbeitet wird. Tag 1: 1. Lösen Sie den Inhalt des Fläschchens mit Inkubationsreagens in 6 ml Assay Reagent auf. Lassen sie das Fläschchen 15 min bei Raumtempertaur (18 26 C) stehen, um vollständige Lösung des Histamins zu gewährleisten. Das gelöste Histamin kann bis zu 3 Tage bei 2 C 8 C gelagert werden, längere Lagerung bis zum Ablaufdatum bei -20 C. Lösung darf nicht öfter als 2x wieder aufgetaut werden 2. währenddessen Standard und Kontrollen wie folgt auflösen 2.1. Standard in 0,5 ml Assay Reagent auflösen; 15 min bei RT lösen lassen, gut mischen (Vortex). Der restliche Standard kann bis zu 3 Tage bei 2 C 8 C gelagert werden, längere Lagerung bis zum Ablaufdatum bei -20 C. Lösung darf nicht öfter als 2x wieder aufgetaut werden Kontrollen in 0,5 ml Assay Reagent auflösen; 15 min bei RT lösen lassen, gut mischen (Vortex). Nicht benötigte Kontrolle kann bis zu 3 Tage bei 2 C 8 C gelagert werden, längere Lagerung bis zum Ablaufdatum bei -20 C. Lösung darf nicht öfter als 2x wieder aufgetaut werden. 3. Entnehmen Sie die benötigten Strips der Inkubationsplatte (Incubation Plate, blau markiert) aus dem Beutel. 4. Ansatzprotokoll anfertigen. Hierzu können Sie die im Kit mitgelieferten Protokollzettel verwenden 5. Gelöstes Inkubationsreagens gut mischen und 50 µl in alle Wells pipettieren, 6. Je 50 µl von Standard, Kontrollen und Proben in die jeweiligen Wells der Incubation Plate (blau markiert) pipettieren. 7. Strips mit der Abdeckfolie aus dem Kit abdecken und über Nacht (18-26 h) bei 37 C inkubieren, (wenn möglich mit 400 rpm schütteln). Es darf nur die Abdeckfolie aus dem Kit verwendet werden! Um Austrocknung der Wells zu vermeiden muss die Abdeckfolie dicht abschließen! D-HIT_V20 7 /24

8 Tag 2: 8. Acylation Reagent auf Raumtemperatur (> 18 C) stellen auftauen lassen µl des aufgetauten Acylation Reagent (> 18 C) in jedes Well der Incubation Plate (blau markiert) mit der Multipette pipettieren, auf gute Durchmischung achten! Um Ungleichmäßigkeiten zu vermeiden, muss die ganze Platte innerhalb von max. 5 min pipettiert werden) ACHTUNG das Acylation Reagent kann Beschriftung von Multipetten Spritzen lösen nicht zu tief in die Lösung eintauchen! 10. Strips 30 min bei 37 C inkubieren (wenn möglich bei 400 rpm schütteln), NICHT ABDECKEN! Während der Inkubationszeit Waschlösung und Antikörperlösung herstellen sowie Konjugat und Substrat auf Raumtemperatur stellen x Waschpufferkonzentrat mit aqua deion verdünnen (z.b. 60 ml Waschpufferkonzentrat plus 540 ml aqua deion.). Das verdünnte Waschpufferkonzentrat ist bei 2 C - 8 C bis zum angegebenen Ablaufdatum haltbar 10.2 Antikörper (Antibody) in 20 ml Assay Buffer auflösen. Nicht benötigte Antikörper-Lösung kann bis zu 3 Tage bei 2 C bis 8 C gelagert werden, längere Lagerung bis zum Ablaufdatum bei -20 C µl Assay Reagent in jedes Well pipettieren. 12. Strips 30 min (40 min ohne Schütteln) bei 37 C am Schüttler mit400 rpm inkubieren NICHT abdecken! 13. Entnehmen Sie die benötigten Strips der ELISA Plate aus dem Beutel. Nicht verwendete Strips im Alubeutel mit Trockenmittelbeutel bei 2 C - 8 C lagern (Silikagel im Trockenmittelbeutel sollte blau bleiben, ansonsten müssen die Strips verworfen werden) µl Probe aus der Incubation Plate (blau markiert) in die entsprechenden Wells der ELISA Plate; transferieren (Es wird empfohlen aus Zeitgründen und um bessere Doppelbestimmungen zu erhalten eine Mehrkanalpipette 10 µl bis 300 µl zu verwenden; die Spitzen sollten beim Aufstecken mit der Hand nachgezogen werden um unterschiedliche Volumen in den Spitzen zu vermeiden! Eine Möglichkeit ist hier auch mit Überstand zu pipettieren) Inhalt der Wells vor der Entnahme in der Incubation Plate mit der Mehrkanalpipette mischen µl der aufgelösten Antibody Lösung (siehe Punkt 9.2) in die entsprechenden Wells der ELISA-Plate pipettieren. 16. Strips abdecken und 45 min (60 min ohne Schütteln) bei 37 C am Schüttler mit 400 rpm inkubieren. 17. Inhalt der Wells verwerfen und 4 mal mit 350 µl verdünntem Waschpuffer waschen µl Conjugate in alle Wells pipettieren. 19. Strips abdecken und 30 min (45 min ohne Schütteln) bei 37 C am Schüttler mit 400 rpm inkubieren. 20. Inhalt der Wells verwerfen und 4 mal mit 350 µl verdünntem Waschpuffer waschen µl Substrate in alle Wells pipettieren min bei RT (18-26 C) inkubieren µl Stop Solution in alle Wells pipettieren. 24. Optische Dichte in einem ELISA-Reader bei 450 nm (Referenz: 620 nm) messen. D-HIT_V20 8 /24

9 Berechnung Die Aktivität der Kontrollen und Proben werden im Verhältnis zum Standard berechnet. Der Standard hat eine Aktivität von 350 HDU. Für die Berechnung wird das Verhältnis der OD 450 der Kontrollen und Proben zur OD 450 des Standards herangezogen. Die Enzymaktivität der DAO in diesem System folgt über den gesamten Aktivtitätsbereich einem potentiellen Algorithmus. Die Berechnung der Aktivität von Kontrollen und Proben erfolgt gemäß der Formel: BERECHNUNGSBEISPIEL: OD 450 (Standard) = 1,600; OD 450 (Probe) = 1,100 HDU(Probe) = 350x(1,1/1,6) 3,5 = 350x0,687 3,5 = 350x0,267 = 94,1 Die entsprechende Formel in MS-Excel lautet: 350*POTENZ(OD Probe /OD Std ; 3,5) Die nebenstehende Grafik zeigt beispielhaft das Verhältnis von DAO-Aktivität zu OD x [OD 450 (Probe)/OD 450 (Standard)] hoch 3,5 Referenzbereiche DAO > 80 HDU/ml: DAO HDU/ml: DAO < 40 HDU/ml: DAO-Aktivität normal DAO Aktivität vermindert DAO-Aktivität stark vermindert KEINE DIAGNOSE von Histamin-Intoleranz ist bei anaphylaktischem Schock und Schwangerschaft möglich! Weiters können die Einnahme von bestimmten Medikamenten und Alkohol ebenfalls die Aktivität der DAO beeinflussen (siehe Einleitung). Messbereich: 20 bis 350 HDU/ml Probenvolumen: 50 µl humanes EDTA-Plasma Inkubationszeiten: über Nacht (18-26 Stunden); 150 min (190 min ohne Schüttler) Lagerung des Kits: 2 8C; Lieferung des Kits bei Raumtemperatur Reproduzierbarkeit: DAO mean CV intraassay CV interassay Probe A 76 HDU/ml 10,8% n=10 14,2% n=8 Probe B 100 HDU/ml 14,4% n=10 17,0% n=8 Probe C 149 HDU / ml 14,1% n= 10 14,5% n=8 Wiederfindung: 10 verschiedene Proben wurden mit einer definierten Menge Schwangerenplasma bzw. gereinigter DAO aus Plazenta gespiked. DAO mean Bereich Probe A (Pool von Schwangerenplasma) 36 HDU/ml % n=10 Probe B (gereinigte DAO aus Plazenta) 235 HDU/ml % n=10 D-HIT_V20 9 /24

10 Technische Hinweise Für die Abdeckung der Platten bei der Inkubation darf nur die beigepackte Folie verwendet werden! Bei der Inkubation über Nacht sicherstellen, dass alle Wells gut verschlossen sind, da sonst die Flüssigkeit verdunstet und das Testergebnis nicht verwendet werden kann. Alle Reagenzien müssen vor der Verwendung auf Raumtemperatur (18 C - 24 C) erwärmt werden. Das Acylierungsreagens erstarrt bei Temperaturen unter 18 C, das beeinträchtigt NICHT die Funktionsfähigkeit! Das Acylierungsreagens ist bei Raumtemperatur (18 C - 24 C) bis zum angegebenen Ablaufdatum stabil. Bei der Zugabe des Acylierungsreagens ist auf gute Durchmischung der Probe zu achten! Dieser Schritt ist für ein korrektes Messergebnis sehr wichtig! Beim Transfer der 30 µl von der Inkubation Plate in die ELISA Plate den Sitz der Pipettenspitzen auf der Mehrkanalpipette prüfen! Wir empfehlen die Technik des Überpipettierens für diesen Schritt anzuwenden. Um Kontaminationen zu vermeiden, für jedes Reagenz unterschiedliche Pipettenspitzen und Reservoirs verwenden. Stoppeln und Schraubkappen unterschiedlicher Reagenzien nicht vertauschen Kontaminationsgefahr! Reagenzien nach dem Ablaufdatum nicht mehr verwenden. Reagenzien nicht dem direkten Sonnenlicht aussetzen. Reagenzien unterschiedlicher Lots nicht mischen oder durch fremde Reagenzien ersetzen. Substratlösung muss vor der Verwendung farblos sein. Vorsichtsmaßnahmen Alle flüssigen Reagenzien enthalten 0.01% Proclin 300 als Konservierungsmittel. Proclin 300 ist in der verwendeten Konzentration nicht toxisch Nicht mit dem Mund pipettieren. Während der Verwendung der Reagenzien nicht essen, trinken, rauchen oder Kosmetika auftragen. Kann allergische Hautreaktionen auslösen Haut- und Augenkontakt vermeiden. D-HIT_V20 10 /24

11 FAQs: Kann ich den Test auch ohne Multipette durchführen? Ersatzweise kann man auch eine Mehrkanalpipette mit Reagenzienreservoirs (Wanne) verwenden. Wobei zu beachten ist, dass für jedes einzelne Reagenz ein eigenes Reservoir verwendet werden muss. Wie genau müssen die Inkubationstemperaturen eingehalten werden? Es ist sehr wichtig für die Reproduzierbarkeit der Testergebnisse, dass die Inkubationstemperatur genau eingehalten wird. Schon 3 C Abweichung können das Signal um 50% reduzieren! Kann ich auch andere als die im Kit enthaltenen Abdeckfolien verwenden? Nein. Um einen dichten Verschluss der Platte als Schutz vor Austrocknung zu gewährleisten muss die im Kit mitgepackte Abdeckfolie verwendet werden. Was sind die kritischen Punkte bei der Durchführung? Alle Reagenzien müssen auf Raumtemperatur gebracht werden. Nach dem Acylieren muss der Inhalt des Wells gut durchmischt sein. Bei der Inkubation über Nacht muss die Platte gut mit der Abdeckfolie verschlossen werden um Austrocknung zu vermeiden. Da eine definierte Menge Histamin in der Incubation Plate lyophilisiert ist, darf der Inhalt nur entsprechend den Anweisungen manipuliert werden. Was muss ich bei der Auflösung der Standards beachten? Während der 15 min, aber vor allem kurz vor Verwendung der Standards sollten diese sorgfältig gemischt werden. Was kann ich machen wenn einige Wells nach der Über-Nacht-Inkubation ausgetrocknet sind? Diese Werte können nicht für eine Auswertung herangezogen werden. Ist es normal, dass die Wells nach dem Acylieren trüb erscheinen? Ja. Nach 30 min sollte die Lösung aber wieder aufklaren. Wenn nicht, die Lösung mit der Pipette durchmischen. Was muss ich bei der Lagerung der Reagenzien beachten? Die Antikörperlösung und die Standards müssen aliquotiert eingefroren werden. Öfteres Einfrieren und Auftauen muss vermieden werden. Alle anderen Reagenzien müssen auf 2-8 C gelagert werden. Das Acylierungsreagens kann bei Raumtemperatur gelagert werden. Was muss ich beim Transfer auf die ELISA Platte beachten? Vor dem Transfer sollte der Inhalt der Wells der Incubation Plate mit der Pipette nochmals durchmischt werden. Das Übertragen aller Strips sollte zügig und ohne Unterbrechungen durchgeführt werden. Kann ich einen automatischen Wascher für die Durchführung der Waschschritte verwenden? Ja, die Platte muss nach dem Waschen ausgeklopft werden, um Restfüssigkeit zu vermeiden Was kann man tun, wenn nach dem Stoppen der Substrat Reaktion die Wells nicht homogen gelb gefärbt sind? Die Platte kurz schütteln damit sich Stopplösung und TMB homogen vermischen können. D-HIT_V20 11 /24

12 Notizen D-HIT_V20 12 /24

13 Introduction Histamine is a simple chemical substance with a molecular weight of 111 Da. It is the most important mediator of allergic diseases like rhinitis allergica (hay fever) and asthma bronchiale. Furthermore histamine is the major cause for urticaria and is an important mediator of drug allergy 1,2. In case of histamine-intolerance various physiological reactions as dilatation of blood vessels or contraction of the uterus have been reported. Furthermore, irritating effects like headache, engorged respiration, dripping nose, airway obstruction, tachycardia, extra systoles and gastro intestinal-ailments, this can cause soft stool, diarrhea and hypotension. Often tumescence of eyelids and sometimes urticaria were described as well 3, 4, 5, 6, 7. Histamine is produced within the body and stored in mast cells for immediate release. Additionally histamine is either inhaled (histamine-provocation) or ingested with food containing high levels of histamine or other biogenic amines 8, 9. The main enzyme for metabolism of ingested histamine is diamine oxidase (DAO). The coppercontaining enzyme with a molecular mass of 180 kda is produced predominantly in the enterocytes. Mainly the enzyme is found in the small intestine, the liver, the kidney and in white blood cells. The occurrence of different isoenzymes is reported. Nevertheless, little is known about expression and regulation of these isoforms, also conflicting data regarding substrate specificity towards histamine, putrescine and other diamines are found. Possibly a variation in isoenzyme-population also influences the capability of histamine-degradation in the body and therefore causes histamine-intolerance 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. During pregnancy ample amounts of the enzyme are produced in the placenta, resulting in concentrations of the enzyme up to 500 to 1000 fold higher in the circulation. Because of these high levels of DAO allergic problems are normally not seen in women during 3 rd to 9 th month of pregnancy 18, therefore diagnosis of histamine intolerance via DAO measurement is not possible during pregnancies. DAO is produced continuously and secreted into the intestine. Therefore most of the histamine ingested with food is normally metabolized immediately within the bowel 19. Remaining histamine is removed by DAO present in the mucous membrane. It is degraded to imidazole acetaldehyde and further oxidized to imidazole acetic acid. Postulated cofactors of DAO are 6-hydroxy-dopa and vitamin B6 20, 21, 22, 23, 24. Diamine oxidase is a rather sensitive enzyme; it is inhibited by other biogenic amines, ethanol; it s degradation product acetic aldehyde and by many different drugs 25, 26. D-HIT_V20 13 /24

14 Clinical implication Histamine intolerance is defined by an imbalance of histamine and the histamine degrading enzyme diamine oxidase, which is mainly produced in the small intestine. The current clinical experiences show that histamine intolerance is not congenital, but rather an acquired disease. A cause of histamine intolerance (HIT) may be drugs, which are inhibitors of the diamine oxidase. Alcohol and its degradation product acetaldehyde also are inhibitors. Intake of this substances can result in reduced DAO activity in the blood. The typical symptoms of histamine intolerance are headache, diarrhea, migraine, engorged or dripping nose and especially in connection with food incorporation asthma bronchiale and arrhythmia, hypotension, urticaria and dysmenorrhea 27, 28, 29. The diagnosis of histamine intolerance is achieved by thorough anamnesis and by the determination of the diamine oxidase activity in plasma or serum 30, 31. Following a histamine-free diet normally results in a significant reduction or even disappearance of the symptoms within a few weeks. Alleviation of the symptoms is also possible by DAO substitution via capsules, nevertheless no influence on blood DAO values can be found expermentally, according to its local action in the gut. Because of the increased operation risk of histamine intolerant patients and the typical intolerance to x-ray contrast agent (histamine-liberator) and antirheumatica, histamine intolerance, which has a prevalence of 2-3% of the population, must be of special interest for all physicians. Especially anaphylactic shocks after bites from wasps or bees are often observed in combination with histamine intolerance. The diagnosis of histamine intolerance based on the activity of diamine Oxidase, hence is only admissible when the activity is low. Nevertheless, when normal DAO activity and simultaneously increased histamine-levels are found, symptoms of histamine intolerance may be present. Especially after extreme histamine exposure like an anaphylactic shock increased activity of diamine oxidase and elevated histamine levels were measured. Therefore the interpretation of the diamine oxidase activity always has to be connected with thorough anamnesis of the patients. A systematic provocation with histamine in a clinically controlled environment can give more details on the ability of the organism in degrading histamine. However, a time-course of DAO-activity gives the best data for the diagnosis of histamine intolerance. Patients suffering from diseases like Urticaria, Crohn s Disease or Celiac Disease are reported to show low DAO activity in serum or plasma 32, 33. Furthermore DAO is described as marker for the status of the gut mucosa patients with chronic gut ailments often show reduced DAO values 34. D-HIT_V20 14 /24

15 Principle of the assay 50 µl of human and EDTA-plasma may be used as analyte. With D-HIT activity of diamine oxidase is determined by degradation of histamine. The result is given in HDU (histamine degrading units) per ml. 1 HDU corresponds to the activity of DAO that degrades 1 pmol/ml (0,11 ng/ml) of histamine. Other assays employ radiolabelled putrescine as a substrate for the enzyme. Please be aware that 35, 36. activity towards Histamine and Putrescine are different In the first step 50 µl of sample and 50 µl of histamine-solution are pipetted in a microwell plate. During the incubation over night histamine is degraded by DAO present in the sample. DAO In the next step the remaining histamine is acetylated.. acylation An aliquot of the reaction mixture is transferred into the ELISA plate and Antibody is added. Acylated histamine and coated acyl histamine compete for the binding sites of the antibody. All unbound substances are removed in a washing step. The amount of antibody bound to the plate is detected using a HRPOlabelled secondary antibody (Conjugate). The signal is directly proportional to the activity of DAO in the sample. D-HIT_V20 15 /24

16 Contents of the Kit Standard The vial contains diamine oxidase (DAO, EC ) from porcine kidney, lyophilized. The activity of DAO is 350 HDU/ml Controls The 2 vials contain diamine oxidase (DAO, EC ) from porcine kidney, lyophilized. The actual activity is stated on the label and in the QC-protocol Incubation Reagent, the vial contains lyophilised histamine Incubation Plate (marked blue). Antibody lyophilized ELISA-Plate, the wells are coated with acylated histamine Assay Reagent 35 ml, ready to use 1 vial Acylation reagent 3 ml, ready to use ATTENTION: Acylation Reagent freezes at temperatures < 18 C, this does not affect the activity of the reagent! Assay Buffer 30 ml, ready to use 10x wash buffer concentrate 60 ml Conjugate 13 ml, ready to use Substrate 13 ml, ready to use Stop Solution 7 ml, ready to use Instruction manual 6 sealing tapes Quality Control Protocol of the respective batch Protocol sheet Additional material and equipment required Precision pipettes in the range of 20 µl to 1000 µl, Multichannel pipette Multipette Combitips 10 µl or 20 µl for multipette Incubator 37 C (preferably shaker-incubator 37 C / 400 rpm) ELISA-reader with filter 450 nm (optional reference 620/630 nm) Graph paper or software for calculation of results D-HIT_V20 16 /24

17 Performance of the assay As the activity of DAO strongly depends on the actual physical status of the patient, samples must be drawn during or at latest 2 days after the presence of symptoms of histamine intolerance! Freshly collected samples must be cooled to 2 C - 8 C within 3 hours after sampling, for prolonged storage samples must be frozen at 20 C. For transport samples must be cooled. Lipemic or hemolytic samples may give erroneous results. Samples should be mixed well before assay performance. All reagents must reach room temperature before use! We recommend duplicates for all determinations. ATTENTION: Incubation times in brackets have to be used if no shaker is available or if the test is run in an automatic ELISA roboter Day 1: 1. Dissolve the contents of the vial labeled Incubation Reagent in 6 ml of Assay Reagent. Leave the vial at room temperature (18-26 C) to ensure complete redissolution. Store unused histamine solution up to 3 days at 2 C 8 C, for prolonged storage freeze at -20 C. Do not thaw solution more than 2 times. 2. during this time redissolve standard and controls as follows: 2.1 Dissolve Standard in 0,5 ml Assay Reagent; leave for 15 min at RT (18-26 C), mix well (Vortex). Store unused standard up to 3 days at 2 C 8 C, for prolonged storage freeze at - 20 C. Do not thaw solution more than 2 times. 2.2 Dissolve Controls in 0,5 ml Assay Reagent; leave for 15 min at RT (18-26 C), mix well (Vortex). Store unused control up to 3 days at 2 C 8 C, for prolonged storage freeze at -20 C. Do not thaw solution more than 2 times. 3. Take needed microtiter strips of Incubation Plate (marked blue) out of the foil pouch 4. Prepare assay protocol, you may use the sheet packed with the kit 5. Mix dissolved Incubation reagent and add 50 µl into each well of incubation plate 6. Add each of 50 µl Standard, Controls and Samples into respective wells of Incubation Plate (marked blue). 7. Cover strips and incubate over night (at least 18 hours) at 37 C, if possible shake at 400 rpm. Cover strips thighly with sealing tape. Only use the tape packed in the kit! To avoid desiccation of the wells make sure the tape seals every well perfectly! D-HIT_V20 17 /24

18 Day 2: 8. Bring Acylation Reagent at room temperature (>18 C). 9. Add 20 µl of Acylation Reagent in every well of Incubation Plate (marked blue) with multipette. To avoid drift effects pipette whole plate within 5 minutes! ATTENTION: Acylation Reagent is an organic solvent and should be pooled in glass bottles only. Removes labelling from Multipette tips do not soak tip in solution! 10. Incubate strips for 30 min at 37 C (shake if possible at 400 rpm), DO NOT COVER! Meanwhile bring conjugate and substrate to room temperature and prepare washing buffer and antibody as follows 10.1 Dilute 10 x Wash buffer concentrate with aqua deion (60 ml washing buffer concentrate plus 540 ml aqua deion.) Diluted washing buffer is stable at 2 C 8 C until expiry date stated on the label Reconstitute Antibody in 20 ml of Assay Buffer. Store unused antibody up to 3 days at 2 C - 8 C, for prolonged storage freeze at -20 C. 11. Add 150 µl Assay Reagent to all wells. 12. Incubate strips for 30 min (40 min without shaker) at 37 C on a shaker at 400 rpm DO NOT COVER! 13. Take microtiter strips of ELISA Plate needed out of the foil pouch, store unused strips sealed with plastic in the foil pouch with desiccant at 2 C - 8 C (Silicagel in desiccant bag should stay blue, otherwise plate has to be thrown away). 14. Transfer 30 µl of reaction mixture from Incubation Plate (marked blue) into respective wells of ELISA Plate (use Multi channel pipette). Mix the contents of the Incubation plate well with the pipette before transfer). To ensure correct results we strongly recommend using a multichannel pipette. Make sure all pipetting tips are tightened thoroughly. 15. Add 150µl of dissolved Antibody (as described in 9.2.) into each well 16. Cover strips and incubate for 45 min (60 min without shaker) at 37 C on a shaker at 400 rpm 17. Discard contents of wells and wash 4 times with 350 µl of diluted wash buffer. 18. Pipette 100 µl of Conjugate into all wells. 19. Cover strips and incubate for 30 min (45 min without shaker) at 37 C on a shaker at 400 rpm. 20. Discard contents of wells and wash 4 times with 350 µl of diluted wash buffer. 21. Add 100 µl of Substrate into all wells. 22. Incubate for 20 min at room temperature (18-26 C). 23. Add 50 µl of Stop Solution into all wells. 24. Read absorbance at 450 nm in a ELISA-Reader (user 620 nm as reference). D-HIT_V20 18 /24

19 Calculation Enzyme activity of controls and samples are calculated with reference to the standard. The standard has an activity of 350 HDU/ml. The quotient of OD 450 of controls / samples and OD 450 of standard is used to calculate enzyme activity via a potential algorithm. The equation is: 350 x [OD 450 (Sample)/OD 450 (Standard)] to the power of 3,5 EXAMPLE FOR CALCULATION: OD 450 (standard) = 1,600; OD 450 (sample) = 1,100 HDU(sample) = 350x(1,1/1,6) 3,5 = 350x0,687 3,5 = 350x0,267 = 94,1 The respective formula in MS-Excel is: 350*POWER(OD sample /OD Std ; 3,5) The graph exemplifies the correlation of DAO-activity and OD 450 Reference values DAO > 80 HDU/ml: DAO HDU/ml: DAO < 40 HDU/ml: normal activity of DAO reduced activity of DAO highly reduced activity of DAO It is IMPOSSIBLE to determine histamine intolerance in case of anaphylactic shock and during pregnancy! Intake of ALCOHOL and particular DRUGS may influence DAO value (see introduction)! Standard range: Sample volume: 20 to 350 HDU / ml 50 µl EDTA-plasma Incubation times: over night (18-26 hours), 150 min (190 min without shaker) Storage of the Kit: Reagents should be stored at 2-8C; shipment will be performed at ambient temperature Reproducibility: DAO mean CV intraassay CV interassay Sample A 76 HDU/ml 10,8% n=10 14,2% n=8 Sample B 100 HDU/ml 14,4% n=10 17,0% n=8 Sample C 149 HDU / ml 14,1% n= 10 14,5% n=8 Recovery: 10 samples were spiked with a predefined volume of pooled serum from pregnant females and purified DAO from placenta respectively.. DAO mean Bereich Sample A (pool of pregnant females) 36 HDU/ml % n=10 Sample B (purified DAO from plazenta) 235 HDU/ml % n=10 D-HIT_V20 19 /24

20 Technical Hints Do not use sealing tapes other than those packed with the kit! Make sure all wells are sealed thoroughly during incubation over night, otherwise liquid will evaporate and make the test unusable. All reagents must have room temperature (18 C - 26 C) before use. Acylation Reagent turns solid at temperatures below 18 C, this does not affect the function of the test. Acylation Reagent may be stored at room temperature (18 C 26 C) until expiry date stated on the label. Mix well after adding Acylation Reagent, this step is essential for obtaining correct results. Check and tighten pipette tips of multichannel pipette when transferring 30 µl from Incubation Plate into ELISA Plate. To avoid cross-contamination, change pipette tips between addition of standards, control and samples. Also use separate reservoirs for each reagent! Do not mix up stoppers of different standards and samples Do not use reagents beyond expiration date Do not expose reagents to direct sunlight Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources Substrate solution must be colorless before use Precautions Do not pipette by mouth Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics where reagents are used All liquid reagents contain 0.01% Proclin 300 as preservative. Proclin 300 is not toxic in concentrations used in this kit D-HIT_V20 20 /24

21 FAQs: Is it possible to perform the assay without Multipette? Multichannel pipette and reagent reservoirs can be used alternatively. Avoid cross-contamination by using specific reservoirs for every reagent. How important is accuracy of the incubation temperature? To ensure reproducibility incubation temperature must be precise. 3 C difference can reduce signals already up to 50%! Can I use different sealing tapes than the enclosed ones? No. To assure tight sealing of the plate kit enclosed tape must be used. What are the critical points of the assay performance? All reagents must have room temperature After acylation of samples the solution must be mixed thoroughly Make sure sealing tape fits tightly on all wells durin over night incubation There is a definite amount of histamine lyophilized into the incubation plate, therefore it is not feasible to manipulate well volume in other ways than described What has to be considered at the standard dissolving step? During the 15 minutes, but particularly before use of the standards the vials must be vortexed thoroughly. What can I do if wells were dried up after over night incubation? These wells cannot be used for a reasonable HDU calculation. Is if normal that wells appear turbid after acylation step? Yes. After 30 min the wells should become clear, if not mix solution with pipette. Where should I store the Kit reagents after use? Antibody solution and standards may be frozen twice at -20 C after use. Avoid repeated freeze-thaw cycles. All other kit reagents have to be stored at 2-8 C. Acylation Reagent may be stored at room temperature. What has to be considered at the transfer step? Before transfer content of incubation plate wells should be mixed with a pipette. Transfer the used strips quickly and without interruption. Is it possible to use an automatically washer for the washing steps? Yes. What can I do if wells were not homogen after stopping of substrate reaction? Shake plate shortly to mix Stop solution with TMB. D-HIT_V20 21 /24

22 Personal Notes D-HIT_V20 22 /24

23 Literatur / References 1 M, Raithel, M, Kufner, P, Ulrich, Hahn EG: The involvement of the histamine degradation pathway by diamine oxidase in manifest gastrointestinal allergies. Inflamm Res 48 Suppl 1 : S75, M, Raithel, EG, Hahn, HW, Baenkler: Klinik und Diagnostik von Nahrungsmittelallergien. Deutsches Ärzteblatt : 780, R. Jarisch, M. Götz, W. Hemmer, A. Missbichler, M. Raithel, F. Wantke: Histamin-Intoleranz, Histamin und Seekrankheit Thieme Verlag, ISBN ; Wöhrl S, Hemmer W, Focke M, Rappersberger K, Jarisch R (2004): Histamine intolerance-like symptoms in healthy volunteers after oral provocation with liquid histamine. Allgery Asthma Proc 25 (5); Wantke F, Hemmer W, Haglmüller T, Götz M, Jarisch R. Histamine in wine: bronchoconstriction after a double blind placebo controlled red wine provocation test. A case report. Int Arch Allergy Immunol 1996;110: Wantke F, Götz M, Jarisch R. The red wine provocation test: intolerance to histamine as a model für food intolerance. Allergy Proceedings 1994;15: Jarisch R, Wantke F (1996): Wine and Headache. Int Arch Allergy Immunol. 10(1 ), Review 8 H, Eutamene, V, Theodorou, J, Fioramonti, Bueno L: Acute stress modulates the histamine content of mast cells in the gastrointestinal tract through interleukin-1 and corticotropin-releasing factor release in rats. J Physiol 553 : 959, Thewes M, Rakoski J, Ring J (1999): Histamine Intolerance Imitated a Fish Allergy. Acta Derm Venereol. 79(1), F, Boomsma, J, van Dijk, UM, Bhaggoe, AM, Bouhuizen, van den Meiracker AH: Variation in semicarbazide-sensitive amine oxidase activity in plasma and tissues of mammals. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 126 : 69, E, Dalfo, M, Hernandez, JM, Lizcano, KF, Tipton, Unzeta M: Activation of human lung semicarbazide sensitive amine oxidase by a low molecular weight component present in human plasma. Biochim Biophys Acta 1638 : 278, ML, Di Paolo, M, Scarpa, A, Corazza, R, Stevanato, Rigo A: Binding of cations of group IA and IIA to bovine serum amine oxidase: effect on the activity. Biophys J 83 : 2231, G, Ionescu, Kiehl R: Monoamine- and diamine oxidase activities in psoriasis. Acta Derm Vernerol 69 : 264, HB, Jeon, Y, Lee, C, Qiao, H, Huang, Sayre LM: Inhibition of bovine plasma amine oxidase by 1,4-diamino- 2-butenes and -2-butynes [In Process Citation]. Bioorg Med Chem 11 : 4631, CA, Kehoe, MS, Faughnan, WS, Gilmore, JS, Coulter, AN, Howard, Strain JJ: Plasma diamine oxidase activity is greater in copper-adequate than copper-marginal or copper-deficient rats. J Nutr 130 : 30, EM, Shepard, H, Heggem, GA, Juda, Dooley DM: Inhibition of six copper-containing amine oxidases by the antidepressant drug tranylcypromine. Biochim Biophys Acta 1647 : 252, X, Wang, P, Pietrangeli, MA, Mateescu, Mondovi B: Extended substrate specificity of serum amine oxidase: possible involvement in protein posttranslational modification. Biochem Biophys Res Commun 223 : 91, MC, Wolvekamp, de Bruin RW: Diamine oxidase: an overview of historical, biochemical and functional aspects. Dig Dis 12 : 2, O, Befani, F, Missiroli, Mondovi B: Histaminase (diamine oxidase) activity in human cataract. Inflamm Res 48 Suppl 1 : S77, YH, Choi, R, Matsuzaki, T, Fukui, E, Shimizu, T, Yorifuji, H, Sato, Y, Ozaki, Tanizawa K: Copper/topa quinone-containing histamine oxidase from Arthrobacter globiformis. Molecular cloning and sequencing, overproduction of precursor enzyme, and generation of topa quinone cofactor. J Biol Chem 270 : 4712, 1995 D-HIT_V20 23 /24

24 21 C, Feillet-Coudray, C, Coudray, D, Bayle, E, Rock, Y, Rayssiguier, Mazur A: Response of diamine oxidase and other plasma copper biomarkers to various dietary copper intakes in the rat and evaluation of copper absorption with a stable isotope. Int Clin Psychopharmacol 83 : 561, G, Houen: Mammalian Cu-containing amine oxidases (CAOs): new methods of analysis, structural relationships, and possible functions. APMIS Suppl 96 : 1, G, Ionescu, Kiehl R: Cofactor levels of mono- and diamine oxidase in atopic eczema. Allergy 44 : 298, V, Steinebach, S, de Vries, Duine JA: Intermediates in the catalytic cycle of copper-quinoprotein amine oxidase from Escherichia coli. J Clin Invest 271 : 5580, JY, Hui, Taylor SL: Inhibition of in vivo histamine metabolism in rats by foodborne and pharmacologic inhibitors of diamine oxidase, histamine N-methyltransferase, and monoamine oxidase. Eur J Biochem 81 : 241, AB, Vaidya, TG, Rajagopalan, AG, Kale, Levine RJ: Inhibition of human pregnancy plasma diamine oxidase with alkaloids of Argemone mexicana--berberine and sanguinarine. Neuropsychobiology 26 : 28, MA, Kuefner, HG, Schwelberger, P, Ulrich, EG, Hahn, M, Raithel: Total histamine degradation capacity (THDC) as an important biological marker of histamine metabolism in human colonic mucosa. Inflamm Res 51 Suppl 1 : S87, M, Raithel, P, Ulrich, J, Keymling, Hahn EG: Analysis and topographical distribution of gut diamine oxidase activity in patients with food allergy. Ann N Y Acad Sci 859 : 258, F, Wantke, M, Gotz, Jarisch R: Histamine-free diet: treatment of choice for histamine-induced food intolerance and supporting treatment for chronic headaches. Clin Exp Allergy 23 : 982, Tufvesson G, Tryding N. Determination of DAO-activity in normal human blood serum. Scand J Cli Lab Invest 1969;24: Mayer I, Missbichler A, Wantke F, Focke M, Reichl H, Winter M, Jarisch R (2005): Optimized radioextraction assay for quantitative determination of diamine oxidase (DAO) activity in human serum and blood. Allergologie 28 (1), L, Maintz, N, Novak: Histamine and histamine intolerance. Am J Clin Nutr. 85 : 1185, B, Guida, CD, De Martino, SD, De Martino, G, Tritto, V, Patella, R, Trio, C, D'agostino, P, Pecoraro,, D'agostino L: Histamine plasma levels and elimination diet in chronic idiopathic urticaria. Eur J Clin Nutr. 54 : 155, L, D'agostino, B, Daniele, F, Pallone, S, Pignata, M, Leoni, G, Mazzacca: Postheparin plasma diamine oxidase in patients with small bowel Crohn's disease. Gastroenterology. 95 : 1503, L, D'agostino, B, Daniele, S, Pignata, MV, Barone, C, Ciacci, R, Sollazzo, G, Mazzacca: Postheparin plasma diamine oxidase increases in patients with coeliac disease during gluten free diet. Gut. 28 Suppl : 131, GD, Luk, TM, Bayless, SB, Baylin: Diamine oxidase (histaminase). A circulating marker for rat intestinal mucosal maturation and integrity. J Clin Invest. 66 : 66, Schwelberger HG, Bodner E: Purification and characterization of diamine oxidase from porcine kidney and intestine. Biochim Biophys Acta 1340 : 152, Mayer I, Pittner F, Hermann M, Missbichler A: Highly sensitive determination of DAO-activity by oxidation of a luminescence reagent. Appl Biochem 2007 D-HIT_V20 24 /24