Maximale Lagertemperaturen

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1 Maximale Lagertemperaturen Dauerhafte Kühlung unterhalb der Grenze der Umkristallisierungsvorgänge White Paper erstellt am: White Paper Seite 1 von 6

2 Inhalt ASKION GmbH 1. Hintergrund Grundlagen Gründe für die Temperaturanforderungen Zusammenfassung Quellenangaben Hintergrund Um biologisches Probenmaterial dauerhaft lagern und trotzdem dessen Lebensfähigkeit über Jahrzehnte erhalten zu können, wird die Methode der Kryokonservierung White Paper Seite 2 von 6

3 angewendet. Hierbei werden Proben unter Einsatz spezifischer Gefrierschutzmittel in der Gasphase des flüssigen Stickstoffes eingefroren und gelagert. Es wird in den SOPs von Kliniken/Kunden und den Fließschemen, welche vom Paul- Ehrlich-Institut erstellt wurden, eine Höchstlagertemperatur von -140 C angegeben. Die Schweizer Leitlinien für Nabelschnurblutbanken (2) fordern sogar eine Lagertemperatur von -150 C. Askion GmbH hat sich zur Aufgabe gemacht, ein System zu entwickeln welches die geforderten Temperaturen einhält und somit maßgeblich zur Sicherheit der biologischen Proben beiträgt. 2. Grundlagen Beim Einfrieren von biologischen Probenmaterialien laufen in der Zelle folgende Prozesse ab: Bei einer Temperatur zwischen 10 und 0 C erfolgt in der Zelle nur noch ein reduzierter Stoffwechsel und kein Signaltransfer mehr. Bei 2 bis 15 C entsteht die extrazelluläre Eisbildung und Entwässerung der Zelle. Zwischen 15 und 25 C erfolgt intrazelluläre Eisbildung und die Entmischung des Zytoplasmas. Ab 25 bis 130 C setzt das migratorische Wachstum der Eiskristalle ein. Ab < 130 C besteht die Zelle als Festkörper ohne nennenswerte Veränderung über lange Zeiträume (9). Eine Stabilität von lebenden Zellen über Jahrhunderte oder Jahrtausende erfordert Temperaturen unter -130 C. Viele Zellen, die über -80 C gelagert werden sind nicht mehr stabil, wahrscheinlich, weil noch Spuren von nicht gefrorener Lösung existieren (4). Sie sterben mit Geschwindigkeiten von mehreren Prozent pro Stunde bis zu mehreren Prozent pro Jahr in Abhängigkeit von der Temperatur, der Art und Typ der Zelle, und die Zusammensetzung des Mediums, in dem sie eingefroren wurden (5). Es gibt unter -130 C kein flüssiges Wasser mehr. Die einzigen physikalischen Zustände von Wasser, die bei diesen Temperaturen vorhanden sind, sind kristallin oder glasartig und in beiden Zuständen ist die Viskosität so hoch (>10 13 poise), dass die Diffusion über wenige geologische Zeitspannen unbedeutend ist (6, 7). Oberhalb von -130 C kommt es zu noch messbaren Umkristallisierungsvorgängen. In Wowks et al. (8) Phasendiagramm des Wassers ist sehr gut zu erkennen, bei welchen Temperaturen in Abhängigkeit von der Konzentration der Einfriermedien sich die Aggregatzustände des Wassers ändern. Egal bei welchem Gehalt an Kryoprotektiva sind bei -130 C alle Kristallisationsvorgänge abgeschlossen. White Paper Seite 3 von 6

4 Wowk et al Gründe für die Temperaturanforderungen Das PEI bezieht die Anforderungen an die Lagerungstemperaturen aus dem Europäischen Ärztebuch. Darin wird eine Lagerung bei -140 C gefordert. Werden die Proben bei anderen Temperaturen gelagert, muss die Funktionalität und die Dauer der Lagerung validiert werden (1). Grundsätzlich soll eine Lagerung in der Gasphase des flüssigen Stickstoffes gewährleistet sein (PEI). Um diese sicher einzuhalten, sollen Temperaturen von -140 C und -150 C im Lagertank eingehalten werden. In den Schweizer Leitlinien für Nabelschnurblutbanken wird angegeben, dass eine Lagertemperatur von -150 C nicht überschritten werden darf. Dies wird damit begründet, dass bei -135 C sich die Probe zu nah am Glasphasenübergang befindet (2). Die Gefahr, dass die Proben während der Lagerung speziell im Falle weiterer Ein- und Auslagerungsvorgänge über diese -130 C hinaus gehen, ist zu groß. White Paper Seite 4 von 6

5 Hier muss in Betracht gezogen werden, dass die Lagertonneninhalte (Racks und Proben) beim jetzigen Stand der Technik während der Ein- und Auslagerung anderer Proben einem Temperaturgradienten von rund 130K ausgesetzt sind (bei Lagertemperatur von -150 C im Tank und Raumtemperatur außerhalb). Es wird Wärme in das System eingetragen, wodurch sich die Lagertemperatur kurzzeitig erhöht. 4. Zusammenfassung Aufgrund der vom Paul-Ehrlich Institut angegebenen Temperaturen während der Dauerlagerung von Stammzellprodukten in der Gasphase des flüssigen Stickstoffes bei maximalen Temperaturen von -140 C, hat sich Askion zur Aufgabe gemacht, während der Ein- und Auslagerungsvorgänge nicht über die Temperatur des Glasphasenüberganges von Wasser zu gelangen. Während herkömmliche Systeme im Zeitraum der Ein- und Auslagerungsprozesse im Tank einen Temperaturgradienten von rund 130K ausgleichen müssen da die Lagerracks für kurze Zeit bis auf Raumtemperatur gebracht werden, hat Askion ein System entwickelt, bei der die Racks in einen Arbeitsraum bei Temperaturen von maximal -100 C angehoben werden. Es wird ein maximaler Gradient von 30K erreicht, die Proben selber gelangen demzufolge nicht mehr in Temperaturen oberhalb des Glasphasenüberganges. 5. Quellenangaben [1] European Pharmacopoeia /2007 Human haematopoietic stem cells [2] Cord Blood Accreditation Manual INTERNATIONAL STANDARDS FOR CORD BLOOD COLLECTION, BANKING, AND RELEASE FOR ADMINISTRATION ACCREDITATION MANUAL [3] PEI Fließschema der Herstellung von Stammzellzubereitungen aus Nabelschnurblut Fließschema-NSBSC.doc Fließschema der Herstellung von Stammzellzubereitungen aus peripherem Blut Fließschema-PBSC-autolog+allogen.doc Fließschema der Herstellung von Stammzellzubereitungen aus Knochenmark Fließschema-KMSC.doc [4] Mazur 1970, Cryobiology: the freezing of biological systems, Science [5] Mazur 1984, Freezing of living cells: mechanisms and implications White Paper Seite 5 von 6

6 [6] Mazur 1985, Basic concepts in freezing cells; aus Deep Freezing of Boar Semen, Uppsala, Sweden, Proceedings First International Conference on Deep Freezing of Boar Seemen, 1985 [7] Özkavukcu et al. 2002, Cryopreservation: basic knowledge and biophysical effects [8] Wowk et al. 2000, Vitrification Enhancement by Synthetic Ice Blocking Agents, Cryobiology 40, [9] IBMT Kryobankbroschüre, Februar 2005 White Paper Seite 6 von 6

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