ELISA Kit zur Messung von 25-Hydroxyvitamin D2 und D3 in Plasma und Serum

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1 ELISA Kit zur Messung von 25-Hydroxyvitamin D2 und D3 in Plasma und Serum GEBRAUCHSANWEISUNG

2 Nur zur In-vitro-Diagnostik Null-Kalibrator Bestellnummer Kalibratoren 1-5 Chargenbezeichnung Kontrollen Tests Inkubationspuffer Vor Sonneneinstrahlung schützen Verwendbar bis Bei 2 C bis 8 C lagern Nicht wiederverwenden Gebrauchsanweisung beachten Lyophilisat Konjugatpuffer 25OHD-Konjugat- Konzentrat SA-HRP-Konzentrat Waschlösungskonzentrat (200-fach) Substratlösung Stopplösung 2

3 GEBRAUCHSANWEISUNG Hinweis! Weitere Sprachen sind verfügbar auf Deutsch BIOHIT Total 25OH Vitamin D ELISA Kit Best.- Nr INHALT GEBRAUCHSANWEISUNG Deutsch VERWENDUNGSZWECK HINTERGRUNDINFORMATIONEN TESTPRINZIP WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN RÜCKVERFOLGBARKEIT DER WERTE KOMPONENTEN DES KITS Mikrotiterstreifen Null-Kalibrator Kalibratoren Kontrollen Inkubationspuffer Waschpuffer-Konzentrat Konjugatpuffer OHD-Konjugat-Konzentrat SA-HRP-Konzentrat Substratlösung Stopplösung Gebrauchsanweisung ERFORDERLICHE, NICHT MITGELIEFERTE MATERIALIEN LAGERUNG UND HALTBARKEIT PROBENENTNAHME UND -HANDHABUNG DURCHFÜHRUNG DES TESTS Vorbereitungen Testprotokoll Automatisierte Methode ERGEBNISSE Qualitätskontrollwerte Berechnung der Ergebnisse und typischer Werte Interpretation der Ergebnisse und biologische Referenzintervalle GRENZEN DES VERFAHRENS ANALYTISCHE LEISTUNGSDATEN Nachweis- und Quantifizierungsgrenze: Messwertbereich

4 13.3 Präzision Analytische Spezifität Störeinflüsse Wiederfindung und Linearität Vergleich mit anderen Methoden LITERATUR VERÖFFENTLICHUNGSDATUM GARANTIE BESTELLINFORMATIONEN KURZDARSTELLUNG DES VERFAHRENSABLAUFS

5 1. VERWENDUNGSZWECK Das BIOHIT TOTAL 25OH Vitamin-D ELISA Kit ist ein quantitatives immunenzymatisches Testsystem für die In-vitro-Bestimmung von 25-Hydroxyvitamin D2 und D3 (25OH-D2 und 25OH-D3) in Serum und Plasma zur Unterstützung der Diagnose von Vitamin D-Mangel, - Insuffizienz oder -Intoxikation. 2. HINTERGRUNDINFORMATIONEN Vitamin D ist der allgemeine Ausdruck für eine Gruppe fettlöslicher Steroid-Prohormone, die für verschiedene Aspekte der menschlichen Gesundheit große Bedeutung haben. Die für Menschen relevanten Formen von Vitamin D sind Vitamin D2 (Ergocalciferol) und Vitamin D3 (Cholecalciferol). Vitamin D2 und D3 kommen naturgemäß in bestimmten Lebensmitteln vor, werden anderen hinzugefügt und sind auch als Nahrungsergänzungsmittel erhältlich. Vitamin D-Supplementierung durch Nahrungsergänzungsmittel wird in vielen Ländern vor allem während der Schwangerschaft und dann empfohlen, wenn die Sonneneinstrahlung aus klimatischen oder kulturellen Gründen beschränkt ist. (1-3) Die im Körper hauptsächlich zirkulierende Form von Vitamin D3 ist die 25-hydroxylierte Form (25OHD3, auch als Calcidiol bekannt). Die Leber metabolisiert Vitamin D3 zu 25- Hydroxyvitamin-D3, und vor kurzem wurde festgestellt, dass 25OHD3 auch direkt von bestimmten tierischen Lebensmitteln geliefert wird. 25OH D3 selbst hat nur eine begrenzte Aktivität und fungiert als Vorläufer für andere Vitamin D-Metaboliten. Die Niere wandelt 25OHD3 in 1,25-Dihydroxyvitamin-D3 (oder Calcitriol), die aktivste der Vitamin-D3- Formen, um. Vitamin D2 wird im Wesentlichen auf den gleichen Strecken wie Vitamin D3 metabolisiert, und D2 und D3 tragen zum Vitamin-D-Gesamthaushalt bei. Für eine korrekte Diagnose von Vitamin D-Mangel, -Insuffizienz oder -Intoxikation ist es daher sehr wichtig, sowohl die D2- als auch die D3-Form von Vitamin D zu messen. Die zuverlässigste Methode zur Bestimmung des Vitamin-D-Haushalts einer Person ist die Messung des 25OHD-Spiegels im Blut: 25OHD hat eine relativ lange Halbwertszeit von 15 Tagen in der Zirkulation, und der 25OHD-Spiegel ist ein Maß für das durch Einnahme von Nahrung bzw. Nahrungsergänzungsmitteln zugeführte sowie in der Haut produzierte Vitamin D. (1-9) 25OH Vitamin D fördert die intestinale Resorption von Calcium und Phosphor und beeinflusst die Knochenresorption und -mineralisierung. Vitamin D-Mangel kann Knochenschwächungen verursachen und ist ein wichtiger Risikofaktor für Rachitis, Osteomalazie und senile Osteoporose. Die Messung beider Formen von 25OH Vitamin D2 und D3 ist auch zur Bestimmung der Ursachen anormaler Serum-Kalzium- Konzentrationen erforderlich. Zu hohe Vitamin D-Konzentrationen (Vitamin D-Intoxikation) kann zu Nieren- und Gewebeschäden führen. Es ist festgestellt worden, dass Vitamin D verschiedene andere Funktionen im Körper erfüllt, wie z. B. Modulation des Zellwachstums, eine neuromuskuläre und Immunfunktion sowie eine entzündungshemmunge Wirkung besitzt. Ein Zusammenhang zwischen kognitiven Beeinträchtigungen, Demenz und Vitamin D-Mangel wurde ebenfalls bestätigt. Die neuere Literatur präsentiert auch neue Belege der vielen Rollen, die Vitamin D bei Krebs, Diabetes und Schwangerschaften spielen kann. (1-6, 10-16) 5

6 3. TESTPRINZIP Der BIOHIT TOTAL 25OH Vitamin-D ELISA-Test ist ein auf Mikrotiterplatten durchgeführter enzymgekoppelter Konkurrenz-Immunadsorptionstest. Zuerst werden Probe, Kontrollen und Kalibratoren in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben, und unmittelbar darauf erfolgt die Zugabe des Inkubationspuffers. Während des 2-stündigen Inkubationsschritts bei Raumtemperatur wird 25OHD aus Serum-/Plasmaproteinen dissoziiert und an den 25OHD-spezifischen monoklonalen Antikörper, mit dem die Mikrotiterplatten-Vertiefung beschichtet ist, gebunden. Die Vertiefungen werden gewaschen, um ungebundene Komponenten zu entfernen. Anschließend wird eine vorgemischte Lösung eines Biotin-markierten 25OHD-Derivats und einer Streptavidinmarkierten Meerrettich-Peroxidase (HRP) in die Vertiefungen gegeben. Während der darauffolgenden Inkubation konkurrieren die markierte 25OHD und die unmarkierte 25OHD, die an die Antikörper gebunden ist, untereinander um Antikörper-Bindungsstellen. Die Vertiefungen werden dann gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen, und es wird ein chromogenes Substrat (Tetramethylbenzidin, TMB) zugegeben. Nach der 15- minütigen Inkubation wird die Reaktion durch Zugabe von Stopplösung gestoppt, und die Intensität der Farbentwicklung wird gemessen. Die Konzentration von 25OHD ist umgekehrt proportional zur ausgebildeten Färbung und lässt sich durch Dosisinterpolation aus der Kalibrationskurve ermitteln. 4. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN Dieser Test ist ausschließlich zur In-vitro-Diagnose bestimmt. VORSICHT: Plasmaproben stets als potenziell gefährliches biologisches Material behandeln. Alle Proben müssen als potenziell kontaminiert angesehen und wie infektiöses Material behandelt werden. Weitere Informationen können den vom US- Gesundheitsministerium (Bethesda, MD., USA) veröffentlichten Dokument Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (1999, 4. Auflage (CDC/NIH) und Nr. (CDC) ) zu Berichten über Labor-Sicherheitsverfahren für verschiedene Erkrankungen sowie den relevanten lokalen oder nationalen Vorschriften entnommen werden. Dieses Kit enthält aus Humanblutkomponenten hergestellte Reagenzien. Die Quellmaterialien aus diesem Kit wurden auf Antikörper gegen Hepatitis B und C sowie gegen HIV getestet. Alle Tests waren negativ. Da jedoch keine Testmethode mit absoluter Sicherheit nachweisen kann, dass diese Pathogene nicht vorhanden sind, müssen alle empfohlenen Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung von Blutderivaten eingehalten werden. Alle tierischen Produkte und deren Derivate wurden von gesunden Tieren gesammelt. Komponenten von Rindern stammen aus Ländern, in denen BSE nicht nachgewiesen wurde. Trotzdem sollten Komponenten, die tierische Substanzen enthalten, als potenziell infektiös behandelt werden. Beim Umgang mit Patientenproben immer Schutzhandschuhe tragen. Für alle Pipettierungen eine Sicherheits-Pipettiervorrichtung verwenden. Nicht mit dem Mund pipettieren. Vor der Durchführung dieses Tests alle Anweisungen sorgfältig lesen. Bestandteile, die ProClin enthalten, können eine allergische Reaktion hervorrufen (siehe Sicherheitsdatenblatt). ProClin-haltige Lösungen gemäß den lokalen Vorschriften zur Abfallbehandlung entsorgen. Stopplösung enthält HCl (siehe Sicherheitsdatenblatt). Bei 6

7 Kontakt gründlich mit Wasser abwaschen. Inkubationspuffer enthält PFOA, Perfluoroctansäure (siehe Sicherheitsdatenblatt). Bei Kontakt gründlich mit Wasser und Seife abwaschen. 5. RÜCKVERFOLGBARKEIT DER WERTE Der Test wird anhand des ID-LC / MS-MS Referenzmessverfahrens (Ghent-Methode) (17-18) gemäß des vom National Institutes of Health (NIH) Office of Dietary Supplements (ODS) festgelegten Vitamin D Standardization Program (VDSP) kalibriert. 6. KOMPONENTEN DES KITS Die Reagenzien reichen für 96 Vertiefungen. Reagenzien verschiedener Kit-Chargen dürfen nicht vermischt werden. 6.1 Mikrotiterstreifen Inhalt: 12 x 8 Streifen (mit abbrechbaren Vertiefungen) in Trägerplatte, beschichtet mit 25OH Vitamin D2- und D3- spezifischen monoklonalen Antikörpern. Verpackt in einem wiederverschließbaren Beutel mit Trockenmittel. Zubereitung: Gebrauchsfertig. Die Mikrotiterplatte bzw. die einzelnen Streifen erst aus dem Folienbeutel entnehmen, nachdem sie Raumtemperatur (20 25 C) angenommen haben. Haltbarkeit: Bis zum Verfallsdatum haltbar. Streifen nach Gebrauch entsorgen. Unbenutzte Streifen wieder in den Folienbeutel zurücklegen, den Beutel verschließen und bei 2 C bis 8 C lagern. 6.2 Null-Kalibrator Inhalt: 1 Fläschchen mit lyophilisiertem biologischem Material mit Gentamycin und Proclin als Konservierungsmittel. Hinweis: Der Null-Kalibrator dient zum Verdünnen von Proben mit Werten über dem höchsten Kalibrator. Zubereitung: Rekonstituieren Sie den Kalibrator durch Zugabe von 2 ml destilliertem Wasser. Haltbarkeit: Lyophilisat ist bis zum Verfallsdatum haltbar. Nach der Rekonstituierung ist der Null- Kalibrator 8 Wochen lang bei 2 bis 8 C stabil. Für eine längere Aufbewahrung sollten diese Reagenzien aliquotiert und können bei 20 C maximal 4 Monate lang gelagert werden. Vermeiden Sie weitere Einfrier-Auftau-Zyklen. 6.3 Kalibratoren 1-5 Inhalt: 5 Fläschchen mit lyophilisierten Kalibratoren 1-5 (genaue Werte sind auf den Fläschchenetiketten aufgedruckt) in Pferdeserum mit Gentamycin und Proclin als Konservierungsmittel. Die Kalibratoren haben chargenspezifische 25OHD-Werte. Die genaue 25OHD-Konzentration der Kalibratoren ist auf den Fläschchen angegeben. Zubereitung: Rekonstituieren Sie die Kalibratoren durch Zugabe von 1 ml destilliertem Wasser in jedes Fläschchen. Haltbarkeit: Bis zum Verfallsdatum haltbar. Nach der Rekonstituierung sind die Kalibratoren 8 Wochen lang bei 2 bis 8 C stabil. Für eine längere Aufbewahrung sollten diese Reagenzien aliquotiert und können bei 20 C maximal 4 Monate lang gelagert werden. Vermeiden Sie weitere Einfrier-Auftau-Zyklen. 6.4 Kontrollen Inhalt: 2 Fläschchen mit lyophilisierten Kontrollen (n = 2) in Humanplasma mit Proclin als Konservierungsmittel. Zubereitung: Rekonstituieren Sie durch Zugabe von 1 ml destilliertem Wasser in jedes Fläschchen. 7

8 Haltbarkeit: Bis zum Verfallsdatum haltbar. Nach der Rekonstituierung sind die Kontrollen 8 Wochen lang bei 2 bis 8 C stabil. Für eine längere Aufbewahrung sollten diese Reagenzien aliquotiert und können bei 20 C maximal 4 Monate lang gelagert werden. Vermeiden Sie weitere Einfrier-Auftau-Zyklen. 6.5 Inkubationspuffer Inhalt: 1 Flasche (20 ml) Inkubationspuffer mit Kasein und Proclin als Konservierungsmittel. Zubereitung: Gebrauchsfertig. Haltbarkeit: Bis zum Verfallsdatum haltbar. 6.6 Waschpuffer-Konzentrat Inhalt: 1 Flasche (10 ml) Waschpuffer-Konzentrat (200-fach, Tris-HCl). Zubereitung: Mit destilliertem Wasser auf 1:200 verdünnen (z. B. 5 ml Waschpuffer-Konzentrat ml Wasser). Mit einem Magnetrührer mischen. Die Waschlösung stets in einem sauberen Kunststoffbehälter zubereiten. Um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern, wird empfohlen, Waschlösung stets frisch zuzubereiten und am selben Tag aufzubrauchen. Haltbarkeit: Bis zum Verfallsdatum haltbar. 6.7 Konjugatpuffer Inhalt: 1 Flasche (30 ml) Konjugatpuffer mit Kasein und Proclin als Konservierungsmittel. Zubereitung: Gebrauchsfertig. Zum Zubereiten von Konjugat-Arbeitslösung 25OHD- Konjugatkonzentrat und SA-HRP-Konzentrat zum Konjugatpuffer zugeben (siehe nachstehende Verdünnungstabelle). Haltbarkeit: Bis zum Verfallsdatum haltbar OHD-Konjugat-Konzentrat Inhalt: 1 Fläschchen (0,3 ml) konzentriertes 25OH Vitamin D-Konjugat. Zubereitung: Zum Zubereiten von Konjugat-Arbeitslösung 100-fach mit Konjugatpuffer verdünnen (siehe nachfolgende Verdünnungstabelle). Haltbarkeit: Das Konzentrat ist bis zum Verfallsdatum haltbar. 6.9 SA-HRP-Konzentrat Inhalt: 1 Fläschchen (0,2 ml) konzentriertes HRP-Streptavidin. Zubereitung: Zum Zubereiten von Konjugat-Arbeitslösung 200-fach mit Konjugatpuffer verdünnen (siehe nachfolgende Verdünnungstabelle). Haltbarkeit: Das Konzentrat ist bis zum Verfallsdatum haltbar. Zubereitung von Konjugat-Arbeitslösung: Die Lösung muss mindestens 1 h 45 Min. vor ihrer Verwendung zubereitet werden! Es wird empfohlen, die Konjugat-Arbeitslösung während des ersten Inkubationschrittes zuzubereiten. Stellen Sie ein angemessenes Volumen HRP-Konjugat-Arbeitslösung durch Mischen der 3 Reagenzien in folgender Reihenfolge her: (1) Konjugatpuffer, (2) 25OHD-Konjugat-Konzentrat, (3) Vortex, (4) SA-HRP-Konzentrat, (5) Vortex. Die Reihenfolge der Hinzufügung dieser 3 Reagenzien ist kritisch und muss strikt eingehalten werden, um reproduzierbare optische Dichten zu erhalten. Die Konjugat-Arbeitslösung bis zum Gebrauch bei Raumtemperatur lagern. Direkte Sonneneinstrahlung vermeiden. Die Arbeitslösung ist nicht über längere Zeit stabil und muss bei Nichtgebrauch am gleichen Arbeitstag entsorgt werden. 8

9 Verdünnungstabelle Streife Konjugat n Puffer (ml) 25 OHD-Konjugatkonzentrat (µl) SA-HRP- Konzentrat (µl) Gesamtvolumen (ml) , , , , , , , , , , , , µl pro Vertiefung 6.10 Substratlösung Inhalt: 1 Flasche (13 ml) Tetramethylbenzidin (TMB) in wässriger Lösung. Zubereitung: Gebrauchsfertig. Haltbarkeit: Bis zum Verfallsdatum haltbar. Nicht direktem Licht aussetzen Stopplösung Inhalt: 1 Flasche (13 ml) HCl 1M. Zubereitung: Gebrauchsfertig. Stopplösung enthält HCl (siehe Sicherheitsdatenblatt). Bei Kontakt gründlich mit Wasser abwaschen. Haltbarkeit: Bis zum Verfallsdatum haltbar Gebrauchsanweisung Gebrauchsanweisung in englischer Sprache liegt jedem Kit bei. Weitere Sprachen sind auf verfügbar. 7. ERFORDERLICHE, NICHT MITGELIEFERTE MATERIALIEN Destilliertes oder demineralisiertes Wasser, Mikropipetten und Einwegspitzen zur genauen Abgabe von 50 bis µl, Pipetten zur genauen Abgabe von 1 bis 10 ml, 8-Kanal- Pipette zur Abgabe von 100 µl und 200 µl, Messzylinder (z. B ml), Magnetrührer, Vortexmischer, Plattenschüttler, Mikrotiterplatten-Waschgerät, Zeitmesser, Mikrotiterplattenleser für die vertikale Messung, der bei 450 nm und 630 oder 650 nm (bichromatische Ablesung, empfohlen) abliest, Blutentnahmeröhrchen aus Kunststoff für Serum oder EDTA-Plasma, Behälter für Eiswasserbad. 8. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Das BIOHIT 25OH Vitamin D-Kit gekühlt bei 2 C bis 8 C lagern. Das Kit ist bei diesen Temperaturen bis zu dem auf dem Etikett der Schachtel oder den einzelnen Kitbestandteilen angegebenen Verfallsdatum haltbar. Unbenutzte Kits nicht einfrieren, keinen hohen Temperaturen aussetzen und nicht bei Temperaturen über 8 C lagern. Reagenzien nach dem auf dem Produktetikett aufgedruckten Verfallsdatum nicht mehr verwenden. Keine Reagenzien aus Kits mit unterschiedlichen Chargennummern 9

10 verwenden und keine Reagenzien durch Produkte anderer Hersteller ersetzen. Nur destilliertes oder demineralisiertes Wasser verwenden. Die Bestandteile des Kits werden mit genauen Konzentrationen geliefert. Eine weitere Verdünnung oder sonstige Veränderungen der Reagenzien können zu falschen Ergebnissen führen. Informationen zur Stabilität einzelner Komponenten nach der Rekonstitution siehe Abschnitt 6. Veränderungen im Aussehen der Kitkomponenten können auf Instabilität bzw. Zerfall hinweisen. Die Substratlösung sollte farblos oder blassblau sein. Jede andere Farbe deutet auf eine Zersetzung der Substratlösung hin. 9. PROBENENTNAHME UND -HANDHABUNG Die Probenmatrix für das BIOHIT Total 25OH Vitamin D-Kit ist Serum oder EDTA-Plasma. Plasmazubereitung: Nach der Entnahme der Blutprobe in ein EDTA-Röhrchen ohne Zusätze werden die Röhrchen sofort durch 5- bis 6-maliges Überkopfdrehen gemischt. Das Plasma wird spätestens 2 Stunden nach der Entnahme durch Zentrifugation getrennt (z. B. StatSpin Express 2, Zentrifugation 2 Minuten bei 4440 x g; Anweisungen des Zentrifugenherstellers für die Plasmapherese beachten). Das Plasma in ein sauberes Kunststoffröhrchen geben. Serumzubereitung: Nach der Entnahme der Blutprobe in ein Serumröhrchen ohne Zusätze die Probe durch 30-minütiges vertikales Stehenlassen in einem Röhrchengestell bei Raumtemperatur vollständig gerinnen lassen. Gerinnungsprodukt durch Zentrifugation trennen (z. B. Stat Spin 180s, Zentrifugation 10 Min. bei 2000 g, Anweisungen des Zentrifugenherstellers für die Serumtrennung beachten). Die Zentrifugation muss innerhalb einer Stunde nach Probenentnahme erfolgen. Das Serum in ein sauberes Kunststoffröhrchen geben. Probenlagerung: Nach dem Trennen von Serum/Plasma kann die Probe 4 Tage lang in einem Kühlschrank bei 2 bis 8 C und zeitweilig (<24 h) bei Raumtemperatur gelagert werden. Bei Nichtgebrauch innerhalb von 4 Tagen wird eine Lagerung bei 20 C empfohlen. Für längere Zeiträume wird eine Lagerung bei -70 C empfohlen. Proben nach dem Auftauen gründlich mischen. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben vermeiden. Stark hämolysierte, lipämische oder trübe Proben sollten entsorgt werden. Proben, bei denen Konzentrationen oberhalb des höchsten Kalibrators erwartet werden, sollten für den Test in Null-Kalibrator verdünnt werden. 10. DURCHFÜHRUNG DES TESTS 10.1 Vorbereitungen Alle Reagenzien und die Mikrotiterplatte Raumtemperatur annehmen lassen (20 25 C). Die lyophilisierten Kalibratoren und Kontrollen mit destilliertem Wasser wie in Kapitel 6 beschrieben rekonstituieren. Das Waschpufferkonzentrat mit destilliertem Wasser oder demineralisiertem Wasser auf 1:200 verdünnen (z. B. 5 ml ml). Die benötigte Anzahl Streifen für den testdurchlauf selektieren. Unbenutzte Streifen sollten im Beutel 10

11 mit Trockenmittel versiegelt und bei 2 bis 8 C aufbewahrt werden. Die Streifen im Halterahmen sichern. Gefrorene Proben sollten im Wasserbad mit Raumtemperatur schnell unter gelegentlichem Rühren aufgetaut werden. Sobald sie fast aufgetaut sind, die Proben in ein Bad mit zerstoßenem Eis stellen. Vor Beginn die gesamte Anleitung aufmerksam lesen. Es wird empfohlen, alle Kalibratoren und die Kontrolle doppelt auf die Platte aufzutragen. Für jeden Testdurchlauf müssen Kalibratoren und die Kontrolle verwendet werden. Alle Reagenzien und Proben vor Gebrauch durch vorsichtiges Schütteln oder Wirbeln mischen. Hinweis! Alle Inkubationen können bei 20 bis 30 C (=Raumtemperatur) ausgeführt werden. Diese Temperatur nicht überschreiten Testprotokoll SCHRITT 1: PROBE Pipettieren Sie 50 µl von jedem Kalibrator, jeder Kontrolle und Probe in die entsprechenden Mikrotiterplatten-Vertiefungen. Hinweis 1: Proben, die erwartungsgemäß 25OHD über der Konzentration des höchsten Kalibrators enthalten, sollten mit Null-Kalibrator verdünnt werden. Hinweis 2: Zur Vermeidung von Drift zwischen Ergebnisniveaus aufgrund längerer Pipettierzeiten dürfen zwischen dem Pipettieren des ersten Kalibrators und der letzten Probe nicht mehr als 20 Min. vergehen. SCHRITT 2: INKUBATIONSPUFFER Pipettieren Sie 150 µl Inkubationspuffer in die Vertiefungen. Inkubieren Sie 2 Stunden lang auf einem Plattenschüttler (300 bis 700 U/min) bei Raumtemperatur. Hinweis! Die Konjugat-Arbeitslösung während der Inkubation und mindestens 1 Std. 45 Min. vor ihrer Verwendung zubereiten. SCHRITT 3: WASCHEN Waschen Sie die Mikrotiterstreifen 3-mal, indem Sie 350 µl Waschlösung in jede Vertiefung pipettieren und den Inhalt aus jeder Vertiefung absaugen. SCHRITT 4: ZUBEREITUNG DER ARBEITSLÖSUNG: Pipettieren Sie 200 µl der Konjugat-Arbeitslösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte bei Raumtemperatur 30 Minuten lang auf einem Plattenschüttler (300 bis 700 U/min). SCHRITT 5: WASCHEN Waschen Sie die Mikrotiterstreifen 3-mal, indem Sie 350 µl Waschlösung in jede Vertiefung pipettieren und den Inhalt aus jeder Vertiefung absaugen. SCHRITT 6: SUBSTRAT Pipettieren Sie 100 µl der Substratlösung (TMB) in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte bei Raumtemperatur 15 Minuten lang auf einem Plattenschüttler (300 bis 11

12 700 U/min). Achten Sie darauf, direkte Sonneneinstrahlung zu vermeiden. Pipettieren Sie die Substratlösung innerhalb von 15 Minuten nach dem Waschen der Mikrotiterplatte. SCHRITT 7: REAKTIONSSTOPP Pipettieren Sie 100 µl der Stopplösung mit einer 8-Kanal-Pipette in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte. SCHRITT 8: MESSEN DER ERGEBNISSE DURCH VERTIKALE MESSUNG Messen Sie die Absorption der Mikrotiterplatten-Vertiefungen bei 450 nm (Referenzfilter 630 nm oder 650 nm) innerhalb einer Stunde und berechnen Sie das Ergebnis wie in Abschnitt 11 beschrieben Automatisierte Methode BIOHIT Total 25OH Vitamin D ELISA wurde für die Automatisierung konzipiert. Sobald testspezifische Protokolle erstellt und für die Verwendung validiert wurden, können durch Ausführung des BIOHIT Total 25OHD-Tests mit einem unbeaufsichtigt arbeitenden ELISA- Automaten Ressourcen eingespart werden. Dies ist einfach und anwenderfreundlich und vermeidet zudem Beschwerden wie das RSI-Syndrom, die durch wiederholte einseitige Belastung beim Pipettieren entstehen können. 11. ERGEBNISSE 11.1 Qualitätskontrollwerte Die gute Laborpraxis schreibt die Verwendung geeigneter Kontrollen vor, um nachzuweisen, dass alle Reagenzien und Protokolle ordnungsgemäß funktionieren. Das Biohit Total 25 OH Vitamin D wird mit zwei chargenspezifischen Kontrolllösungen geliefert. Für jede Charge sollten Qualitätskontrolldiagramme erstellt werden, um die Leistung der Kontrolle nachzuverfolgen. Alternativ können geeignete statistische Methoden zur Analyse interner Laborkontrollwerte verwendet werden, die innerhalb der vom Labor verwendeten Konfidenzintervalle liegen sollten. Wenn die erwarteten Kontrollergebnisse vorliegen, können die Ergebnisse akzeptiert werden. Eine visuelle Erfolgskontrolle der vom Computer selektierten Kurvenpassform wird empfohlen Berechnung der Ergebnisse und typischer Werte TYPISCHE WERTE: Die folgenden Werte stellen typische erfasste Werte für die Kalibratoren dar. Diese Werte dienen nur zur Veranschaulichung und sind kein Ersatz für in jedem Durchlauf erfasste Echtzeitdaten. 25OH Vitamin D-ELISA OD (450 nm) 0 ng/ml 2,96 6,0 ng/ml 2,56 Kalibratorkonzentration 13,0 ng/ml 2,03 33,0 ng/ml 1,29 69,0 ng/ml 0, ng/ml 0,23 Hinweis: 1 ng/ml = 2,5 pmol/ml 12

13 BERECHNUNG DER ERGEBNISSE: Erstellen Sie für jeden Durchlauf eine separate Kalibrationskurve. Nicht die Daten früherer Läufe verwenden. Berechnen Sie die OD-Mittelwerte der Doppelbestimmungen. Berechnen Sie für jeden Kalibrator sowie für jede Kontrolle und Probe das relative Signal (%) durch dividieren des Signals (A) durch das vom Null-Kalibrator erhaltene Signal (A0) und anschließendes Multiplizieren mit 100., % Stellen Sie den Mittelwert des relativen Signals (A/A0, %) der Kalibratoren im Vergleich zu ihrer jeweiligen (auf dem Fläschchen angegebenen) Konzentration in der Grafik dar. Die Extinktionswerte werden durch Interpolation von Unbekannten aus der Best-Fit-Kurve der Kalibratoren in 25OHD-Konzentrationen umgewandelt. Es wird die Verwendung computergestützter Verfahren empfohlen, in diesem Fall einer 4-Parameter- Kurvenanpassungsfunktion. Abbildung 1 zeigt eine typische Kalibrierungskurve. Abbildung 1: Beispiel einer typischen Kalibrierungskurve Interpretation der Ergebnisse und biologische Referenzintervalle Die Clinical Practice-Richtlinie (Clinical Practice Guideline) der Endocrine Society definiert Vitamin D-Mangel als 25OH D-Spiegel unter 20 ng/ml und Vitamin-D-Insuffizienz als 25OHD ng/ml (2). Konstante Serumkonzentrationen über 150 oder 200 ng/ml gelten als potenziell toxisch (1, 10, 20), weshalb eine breitere Sicherheitsgrenze von 100 ng/ml ist vorgeschlagen wworden (20). Allerdings sind gesundheitliche Beeinträchtigungen möglicherweise schon mit viel geringeren Konzentrationen von 25OHD assoziiert, und es ist vorgeschlagen worden, dass Konzentrationen von über 50 bis 60 ng/ml vermieden werden sollten (2). Es ist bekannt, dass Faktoren wie die Ernährung, demografische Merkmale und die Jahreszeit Einfluss auf den normalen Spiegel von 25OH Vitamin D haben (1, 6, 21). Jedes Labor sollte ausgehend von der lokalen Bevölkerung und 13

14 eventuellen Empfehlungen der nationalen Gesundheitsbehörden seinen eigenen Bereich definieren. Der optimale Vitamin D-Spiegel in Serum wird nach wie vor diskutiert (1-2, 4, 6, 21). Ein Vorschlag auf Grundlage der Endocrine Society-Richtlinie (2) und der neueren Literatur (21-23) für die Definition des 25OH Vitamin D-Spiegels im Serum ist nachfolgend dargestellt. Spiegel Mangel Insuffizienz Suffizienz ng/ml <20 ng/ml ng/ml >30 ng/l Potenzielle Toxizität >100 ng/ml Hinweis: 1 ng/ml = 2,5 nmol/l 12. GRENZEN DES VERFAHRENS Die Ergebnisse des Biohit 25OH Vitamin D-Tests müssen wie bei allen Diagnosetests im Zusammenhang mit den klinischen Symptomen des Patienten und weiteren, dem Arzt vorliegenden Daten interpretiert werden. 13. ANALYTISCHE LEISTUNGSDATEN Alle Leistungstests wurden bei Raumtemperatur (20 25 C) durchgeführt. Alle Proben wurden mit doppelten Mikrotiterplatte-Vertiefungen analysiert Nachweis- und Quantifizierungsgrenze: Leerwertgrenze (Limit of Blank, LoB), Nachweisgrenze (Limit of Detection, LoD) und Bestimmungsgrenze (Limit of Quantitation, LoQ) für wurden gemäß der CLSI-Richtlinie EP17-A bestimmt. Anteile falsch Positiver (α) lagen unter 5 % und falsch Negativer (β) unter 5 % (14). Die LoB wurde mit 1,7 ng/ml und die LoD mit 2,8 ng/ml bemessen. Die LoQ wurde durch Testen von 5 Proben mit niedrigem Wert in verschiedenen Tests 14- mal bemessen. Die LoQ wurde mit 4,4 ng/ml bei einem VK% zwischen Messungenvon 20,0 bestimmt. Die LoD wurde auch durch ein zweites Verfahren unter Verwendung von zwanzig Null- Kalibratoren zusammen mit einem anderen Kalibratorsatz getestet. Die Nachweisgrenze, definiert als die scheinbare Konzentration bei zwei Standardabweichungen über dem gemessenen Durchschnittswert bei Nullbindung, betrug 1,5 ng/ml Messwertbereich Der Messwertbereich für den BIOHIT 25OH Vitamin D-Test beträgt 4,4-123 ng/ml Präzision Die Präzision des Tests wurde ermittelt, indem Proben aus 3 verschiedenen Kit-Chargen in 20 Durchläufen (mindestens 20 Tage lang) getestet wurden. 14

15 Bei der (Intra-Assay-)Wiederholbarkeitsgenauigkeit reichte der Bereich für Mittelwerte von 5,5 µg/l bis 81,2 ng/ml, die Standardabweichungen von 0,4 bis 2 ng/ml und der VK% von 2,5 % bis 7,8 %. Bei der (Intra-Assay-)Intra-Labor-Genauigkeit reichte der Bereich für Standardabweichungen von 1,2 ng/ml bis 7,8 ng/ml und der VK% von 4,7 % bis 9,2 %. Wiederholbarkeitsgenauigkeit Intra-Labor-Genauigkeit Probe N [X] ± SA (ng/ml) VK (%) Probe N [X] ± SA (ng/ml) VK (%) S1 24 5,5 ± 0,4 7,8 S ,7 ± 1,3 7,4 S ,4 ± 1,6 5,7 S ,3 ± 1,2 4,7 S ,2 ± 2,0 2,5 S ,4 ± 7,8 9,2 SA: Standardabweichung, VK: Variationskoeffizient 13.4 Analytische Spezifität Der 25OH Vitamin D-Test wurde für Kreuzreaktionen mit anderen Vitamin D-Formen ausgewertet. Die Kreuzreaktivität des BIOHIT TOTAL 25OH Vitamin-D ELISA- Testsystems wurde durch Austestung von Seren mit versetzten Kreuzreaktanden bestimmt. Die Prozentsätze der Kreuzreaktionen wurden durch Vergleich der Konzentration geschätzt, die 50% Hemmung ergeben, und sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst: Komponente und Konzentration % Kreuzreaktion 25OH-Vitamin D OH-Vitamin D2 84 Vitamin D3 < 0,2 Vitamin D2 < 0,2 1,25(OH) 2 -Vitamin D3 50 1,25(OH) 2 -Vitamin D2 < 0,2 24,25(OH) 2 -Vitamin D3 > ,26(OH) 2 -Vitamin D3 > epi-25OH-Vitamin D3 < 0, Störeinflüsse Der Biohit 25 OH Vitamin D-Test wurde auf Störeinflüsse bei drei verschiedenen 25OHD- Serumspiegeln (25 OHD bei 6-43 ng/ml) bewertet. Die durch Hämoglobin, nicht konjugiertes Bilirubin oder Triglyceride in Störkonzentrationen von jeweils 5 mg/ml, 0,5 mg/ml bzw. 5 mg/ml hervorgerufene Verzerrung lag bei unter 10 %. Diese Störeinflüsse wurden als nicht signifikant eingestuft. Stark hämolysierte, lipämische oder trübe Proben sollten vermieden werden. Die Interferenz mit Ascorbinsäure (Vitamin C, getestet bei 1 mg/ml), Bilirubin-Konjugat (getestet bei 1 mg/ml) und Biotin (getestet bei 40 µg/ml) wurde in ähnlicher Weise getestet und lag unter 10 %. Die Hemmung durch Zemplar (50 ng/ml) wurde bei 25OHD- 15

16 Konzentrationen von 18 ng/ml und 34 ng/ml getestet und in ähnlicher Weise bei < 10 % ermittelt, was als nicht signifikante Störung betrachtet wurde Wiederfindung und Linearität Die Wiederfindung wurde durch Versetzen einer niedrigen 25OHD-Konzentration (8,2 ng/ml) mit verschiedenen Mengen an 25OH-Vitamin D2 bzw. D3 ermittelt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst: WIEDERFINDUNGSTEST Zugabe von 25OH-Vitamin D3 (ng/ml) Wiedergefunden (%) , ,9 92 Zugabe von 25OH-Vitamin D2 (ng/ml) Wiedergefunden (%) , ,4 95 Zur Analyse der Linearität von Verdünnungen wurden drei Proben mit über den gesamten Messbereich verteilten Konzentrationen in äquidistanten Verdünnungen getestet. Die Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen zusammengefasst: Probe S1 Probenverdünnung Gemessene Konzentration (ng/ml) keine 66, /2 34, /4 15,5 94 1/8 8,2 99 1/16 4,4 106 Probe S2 Probenverdünnung Wiedergefunden (%) Gemessene Konzentration (ng/ml) keine 99, /2 53, /4 24,6 99 1/8 11,8 95 1/16 6,5 105 Probe S3 Probenverdünnung Wiedergefunden (%) Gemessene Konzentration (ng/ml) keine /2 64, /4 31, /8 15,0 98 1/16 7,6 99 Wiedergefunden (%) 16

17 Der Test zeigt, dass die Verdünnungsserie von 7,6-123 ng/ml (16-fache Verdünnung) linear ist. Der Messwertbereich (definiert von LoQ bis zur höchsten gemessenen linearen Konzentration) wurde von 4,4 bis 123 ng/ml bestimmt Vergleich mit anderen Methoden Die Leistung des BIOHIT Total 25OH Vitamin-D ELISA-Testsystems wurde in einer Korrelationsstudie mit insgesamt 127 Proben ermittelt. Die Proben wurden sowohl mit dem BIOHIT TOTAL 25OH Vitamin D ELISA-Testsystem als auch mit einem kommerziell erhältlichen 25OH Vitamin D CLIA-Testsystem (CLIA = chemoluminiszenter Immunassay) getestet. Der Korrelationskoeffizient zwischen den beiden Methoden betrug 0,94, bei einer Steigung von 0,976 und einem y-interzept von 1,94. Die Ergebnisse sind in der folgenden Abbildung 2 zusammengefasst: Abbildung 2: Korrelation des Biohit 25OH Vitamin D-Tests zu einer handelsüblichen CLIA-basierten Methode. 17

18 14. LITERATUR 1. HOLICK MF. Vitamin D deficiency. N Engl J Med 2007; 357: HOLICK MF, BINKLEY NC, BISCHOFF-FERRARI HA, GORDON CM, HANLEY DA, HEANEY RP, MURAD MH, WEAVER CM. Evaluation, treatment, and prevention of vitamin D deficiency: an Endocrine Society clinical practice guideline. J Clin Endocrinol Metab 2011; 6(7): WHO. Guideline: Vitamin D supplementation in pregnant women. Geneva, World Health Organization, ROSS AC, TAYLOR CL, YAKTINE AL, DEL VALLE HB, eds. Committee to Review Dietary Reference Intakes for Vitamin D and Calcium, Institute of Medicine, Food and Nutrition Board. Dietary Reference Intakes for Calcium and Vitamin D. Washington, DC: National Academy Press (2010). 5. HOLICK MF Vitamin D Status: Measurement, Interpretation, and Clinical Application. Ann Epidemiol 2009; 19: GRÖBER U, SPITZ J, REICHRATH J, KISTERS K, HOLICK MF. Vitamin D Update 2013: From rickets prophylaxis to general preventive healthcare. Dermatoendocrinol 2013; 5(3): ZERWEKH JE. Blood biomarkers of Vitamin D status. Am J Clin Nutr 2008; 87(suppl):1087S-91S. 8. TAYLOR CL, PATTERSON KY, ROSELAND JM, WISE SA, MERKEL JM, PEHRSSON PR, YETLEY EA. Including food 25-hydroxyvitamin D in intake estimates may reduce the discrepancy between dietary and serum measures of vitamin D status. J Nutr 2014; 144: HEANEY RP, ARMAS LA, FRENCH C. All-source basal vitamin D inputs are greater than previously thought and cutaneous inputs are smaller. J Nutr 2013; 143: HOLICK MF. Resurrection of Vitamin D deficiency and rickets. J Clin Invest 2006; 116: CHRISTAKOS S, HEWISON M, GARDNER DG, WAGNER CL, SERGEEV IN, RUTTEN E, PITTAS AG, BOLAND R, FERRUCCI L, BIKLE DD. Vitamin D: beyond bone. Ann NY Acad Sci 2013; 1287: SCHLÖGL M, HOLICK MF. Vitamin D and neurocognitive function. Clin Interv Aging 2014; 9: JACOBS ET, KOHLER LN, KUNIHIRO AG, JURUTKA PW. Vitamin D and Colorectal, Breast, and Prostate Cancers: A Review of the Epidemiological Evidence. J. Cancer 2016; 7(3): NAKASHIMA A, YOKOYAMA K, YOKOO T, URASHIMA M. Role of vitamin D in diabetes mellitus and chronic kidney disease. World J Diabetes 2016; 7(5): ANIC GM, ALBANES D, ROHRMANN S, KANAREK N, NELSON WG, BRADWIN G, RIFAI N, MCGLYNN KA, PLATZ EA, MONDUL AM. Association between serum 25-hydroxyvitamin D and serum sex steroid hormones among men in NHANES. Clin Endocrinol (Oxf) 2016; Epub ahead of print: doi: /cen DE-REGIL LM, PALACIOS C, LOMBARDO LK, PEÑA-ROSAS JP. Vitamin D supplementation for women during pregnancy. Cochrane Database Syst. Rev ;1 17. STEPMAN HC, VANDERROOST A, VAN UYTFANGHE K, THIENPONT LM. Candidate Reference Measurement Procedures for Serum 25-Hydroxyvitamin D3 and 25-Hydroxyvita- min D2 by Using Isotope-Dilution Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (ID-LC/ MS-MS). Clin Chem 2011; 57(3): THIENPONT LM, STEPMAN HCM, VESPER HW. Standardization of measurements of 25- Hydroxyvitamin D3 and D2. Scand. J Clin Lab Inves 2012; 72(Suppl. 243): DANIEL W, THOLEN MS. Clinical and laboratory standards Institute (CLSI) (2004). Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline. CLSI document EP17-A. 20. JONES G. Pharmacokinetics of vitamin D toxicity. Am J Clin Nutr 2008; 88:582S-6S. 21. HEANEY RP. Health is better at serum 25(OH) D above 30ng/mL. J Steroid Biochem Mol Biol 2013; 136: VIETH R. Why the minimum desirable serum 25-hydroxyvitamin D level should be 75 nmol/l (30 ng/ml). Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2011; 25(4): DAWSON-HUGHES B, HEANEY RP, HOLICK MF, LIPS P, MEUNIER PJ, VIETH R. Estimates of optimal vitamin D status. Osteoporos Int 2005; 16(7):

19 15. VERÖFFENTLICHUNGSDATUM BIOHIT Total 25OH Vitamin D -Packungsbeilage. Version 4.0, Mai GARANTIE Der Hersteller ist verpflichtet, alle Mängel an einem Produkt (dem mangelhaften Produkt ) zu beseitigen, die auf ungeeignete Materialien oder nachlässige Verarbeitung zurückzuführen sind und die mechanische Funktionsweise oder den Verwendungszweck des Produkts beeinträchtigen, unter anderem die in den Herstellerspezifikationen für das Produkt angegebenen Funktionen. JEDER GARANTIEANSPRUCH ERLISCHT JEDOCH, WENN DER MANGEL DURCH UNSACHGEMÄSSE HANDHABUNG/VERWENDUNG, VERSEHENTLICHE BESCHÄDIGUNG, FALSCHE LAGERUNG ODER VERWENDUNG DES PRODUKTS FÜR NICHT BESTIMMUNGSGEMÄSSE ODER NICHT ANGEGEBENE ZWECKE ENTGEGEN DEN ANWEISUNGEN IN DIESER DOKUMENTATION VERURSACHT WURDE. Die Garantiezeit für den Händler ist in der Gebrauchsanweisung des jeweiligen Produkts angegeben und beginnt mit dem Datum der Lieferung durch den Hersteller. Bei Streitigkeiten bezüglich der Auslegung gilt die englische Fassung dieses Texts. Dieses Diagnose-Kit von Biohit wurde gemäß den Qualitätsmanagementnormen ISO 9001/ISO hergestellt und hat alle für dieses Produkt relevanten Qualitätssicherungsverfahren durchlaufen. 17. BESTELLINFORMATIONEN BIOHIT Total 25OH Vitamin D ELISA Kit Best.- Nr Hauptsitz Biohit Oyj Laippatie Helsinki, Finnland Tel.: Fax: info@biohit.fi 19

20 18. KURZDARSTELLUNG DES VERFAHRENSABLAUFS Alle Reagenzien Raumtemperatur annehmen lassen Alle Reagenzien und Proben direkt vor dem Pipettieren gründlich mischen Nach dem Mischen 50 µl der Patientenproben, Kalibratoren und Kontrollen in die Vertiefungen pipettieren. 150 µl Inkubationspuffer zugeben. 2 h lang bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubieren Während der Inkubation die Konjugat-Arbeitslösung zubereiten (mindestens 1 h 45 Min. vor Gebrauch) Die Vertiefungen 3-mal mit 350 µl verdünnter Waschlösung waschen 200 µl der Konjugat-Arbeitslösung in die Vertiefungen pipettieren 30 Min. bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubieren Die Vertiefungen 3-mal mit 350 µl verdünnter Waschlösung waschen 100 µl der gemischten Substratlösung in die Vertiefungen pipettieren 15 Min. bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubieren 100 µl der gemischten Stopplösung in die Vertiefungen pipettieren Messung der Absorption bei 450 nm (oder 630 bzw. 650 nm) DE