Exposure assessment of moulds in indoor environments in relation to chronic respiratory diseases

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1 Akademische Edition Umweltforschung Publikationsreihe des interdisziplinären Umwelt-Forums der RWTH Aachen Band 4/99 René Ostrowski Exposure assessment of moulds in indoor environments in relation to chronic respiratory diseases Microbiological and biochemical investigations Herausgeber: Univ.-Prof.. Dr. W. Dott Institut für Hygiene und Umweltmedizin D 82 (Diss. RWTH Aachen) Shaker Verlag Aachen 1999

2 Die Deutsche Bibliothek - CIP-Einheitsaufnahme Ostrowski, René: Exposure assessment of moulds in indoor environments in relation to chronic respiratory diseases : Microbiological and biochemical investigations / René Ostrowski. - Als Ms. gedr. - Aachen : Shaker, 1999 (Akademische Edition Umweltforschung ; Bd. 99,4) Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 1999 ISBN Copyright Shaker Verlag 1999 Alle Rechte, auch das des auszugsweisen Nachdruckes, der auszugsweisen oder vollständigen Wiedergabe, der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen und der Übersetzung, vorbehalten. Als Manuskript gedruckt. Printed in Germany. ISBN ISSN X Shaker Verlag GmbH Postfach Aachen Telefon: / Telefax: / Internet: info@shaker.de

3 5. SUMMARY Keywords: Indoor environment, allergy, asthma, respiratory diseases, indoor air, house dust, moulds, house dust mites, gas chromatography, thermal desorption, mass spectrometry, (microbial) volatile organic compounds, species-specific secondary metabolites, Alternaria alternata, Aspergillus candidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor, Cladosporium herbarum, Cladosporium cladosporioides, Eurotium herbariorum, Stachybotrys chartarum, Trichoderma spp., Wallemia sebi, biomarker, health hazards, risk assessment, protein extraction, SDS- PAGE, immunoblotting, ELISA, CAP-RAST, Acarex test. Though it has been demonstrated that mould spore loads and indoor air quality can be involved in the development of childhood asthma, recommendations for biological pollutants like moulds or microbial volatile organic compounds have not yet led to binding standards. Cladosporium cladosporioides, C. herbarum, Epicoccum nigrum, Botrytis cinerea and Alternaria spp. were shown to be dominating indoors, accompanied by Aspergillus and Penicillium spp. in kitchens and bedrooms. The latter seem to belong to the autochthonous flora, as do Aureobasidium pullulans, Chaetomium spp. and Trichoderma spp., which together with Cladosporium cladosporioides, Arthrobotrys spp., Gliocladium spp. and Stachybotrys chartarum may indicate deterioration of basements. Furthermore, xerophilic fungi like Aspergillus versicolor, A. penicillioides, Wallemia sebi, Eurotium herbariorum and xerotolerant Penicillium spp. are known to be often associated with water-damaged interiors. The fungal spectrum of thermotolerant species mainly consisted of Aspergillus fumigatus, A. niger, Paecilomyces variotii, Eurotium spp. and Rhizopus microsporus. A total number of 176 species could be isolated, 143 from dust or damp stains, 92 from outdoor air, 113 from kitchen, 68 from living-room and 96 from bedroom air. Species composition clearly reflects indoor activities (food preparation, etc.). Multivariate analysis indicated that species composition of contaminated indoor environments deviated from the generally observed mycoflora. Species diversity (Shannon-Weaver) in air was higher for kitchens than for outdoor air, living-rooms and bedrooms, and higher in dust than in air. Numbers of cfu/m 3 in indoor air are partly related to outdoor sources, but can also reveal indoor sources or fungal growth in moist buildings. Increased numbers of species cfu in indoor air or dust in many cases reflected the fungal flora colonizing damp stains. Higher levels of these species compared to outdoor air must be due to indoor sources (biowaste, contaminated building material etc.). Although showing some fundamental deficiencies, the microbiological methods used proved suitable to detect indoor fungal contaminations. Frequent species such as Cladosporium spp., Alternaria alternata, Aspergillus spp. and Penicillium spp., but in particular xerotolerant species such as Aspergillus candidus, A. versicolor, Eurotium spp. and Wallemia sebi, could be recognized as important contributors to increased total cfu/m 3 air or cfu/g dust. On the basis of measurements in 219 households, threshold cfu values are suggested for nine groups of fungi in distinct indoor sites (kitchen, living-room, bedroom), outdoor air and dust. The thresholds are strongly linked to the methods used and are not claimed to be valid for all situations in regard to region, season etc. However, quantitative and detailed qualitative species assessment proved to be efficient tools of environmental monitoring in detecting indoor fungal contamination as well as increased outdoor concentrations. 199

4 Sixteen common airborne fungal species isolated from a water-damaged building were screened for the production of microbial volatile organic metabolites (MVOC) in pure culture. VOCs in indoor air of households and air samples taken from dust samples and pure cultures were analyzed qualitatively by thermal desorption and subsequent gas chromatography/mass spectrometry. Hydrocarbons such as alcohols, ketones, sulphur compounds and a wide range of terpenes were most frequently found, but ethers and esters could also be detected. The cultivation medium strongly affected the production of microbial volatile metabolites both qualitatively and quantitatively. Relative humidity and media influenced fungal growth on dust and in pure cultures. MVOC sampling of pure cultures of common mould species contributed to the identification of certain volatiles found in the indoor atmosphere. From cultures of Trichoderma spp. and Stachybotrys chartarum grown on different media and of other moulds isolated from a water-damaged building afflicted with extensive microbial growth, volatile compounds such as 3-methyl-1-butanol, 2- methyl-1-butanol, methylfuran, ethyl-methyl-hexane, 3-octanone, 1-octen-3-ol, 3-octen-1-ol as well as several terpenes of high molecular weight were detected which are regarded as potential biomarkers for indoor mould growth. Other terpenes like limonene are less suitable indicators because they can originate from other indoor sources like plants, solvents or adhesives. Furthermore, characteristic MVOC produced by the biomarker fungal species may serve as biochemical indicators as well. Whether non-volatile metabolites such as sterigmatocystin, which is produced by Aspergillus versicolor and Emericella nidulans (anamorph Aspergillus nidulans) can be detected in indoor air or dust in sufficient concentrations, is questionable. Sera from allergy patients were found to react strongly with antigen extracts produced from moulds cultured from indoor air or dust samples; They had been positively tested on the patients by intracutaneous tests using commercial extracts before. The effect of the period of incubation on the protein composition was tested with cultures of Aspergillus fumigatus, and strong differences between extracts from fresh isolates and the commercially available extract were observed. With cultures of different age in A. fumigatus grown on Czapek and DG18, respectively, only minor differencies in the protein composition were found. By immunoblotting extracts from A. fumigatus, Penicillium chrysogenum and other fungi, distinct protein bands with sizes ranging from kda were differentiated. None were found with the commercial extracts commonly used for intracutaneous- and prick-tests. Concentrations of IgG antibodies blotted against protein extracts of 10 common indoor moulds in immunoblotting and ELISA were compared to frequencies of species in indoor air and house dust. A certain correspondence between fungal frequencies in dust and IgG results could be demonstrated, but less between intracutaneous tests or increased specific IgE (CAP-RAST). Accordance might be better, if cross-reactivity between species belonging to the same or different genera could be taken into account, but knowledge of cross-reactions seems insufficient to do this reliably. Very rarely similar concentrations of IgE and IgG occurred of antibodies specific for the same mould genus. Immunoblotting was compared to an ELISA method developed, underlining the advantage of numerical data in ELISA in contrast to visual evaluation of colour intensities of blotting results. As quality of commercial fungal extracts and standardization of allergen extraction cannot yet be assured, these tests are fraught with several major problems of interpretation, e.g. different methods of allergen extraction, storage of extracts, identity of allergens, definition and characterization of allergenic activity, possible loss of allergenic activity due to extraction, or cross-reactivity between species belonging to the same or different genera. Not withstanding these uncertainties, the immunoblotting technique used was partly shown to reflect environmental monitoring results of microbiological exposure to indoor fungal contamination. It was clearly demonstrated that immunoblot results are much more related to sensitization than to respiratory symptoms. 200

5 The detailed detection of indoor sources of fungal contamination and accurate species identification in combination with quantification of mould propagules allow an estimation of health hazards in the indoor environment. By now, estimating health hazards is still difficult because knowledge about the effects of indoor concentrations of fungal propagules (spores, allergens) and of microbial volatile compounds on human health is poor and insufficient. In addition to the facultative pathogenic and allergological relevance, the fungi may have different toxicological health impacts. Furthermore, knowledge of possible synergistic effects is lacking. The use of a wide variety of devices and methods complicates inter-study comparisons. There is a strong need for standardization of methods. However, both classic measurements and modern biochemical analysis must be thoroughly assessed. The results obtained here may serve as a basis for further studies on effects of the exposure to moulds and to MVOC. 201

6 ZUSAMMENFASSUNG Keywords: Innenraum, Allergie, Asthma, Atemwegserkrankungen, Raumluft, Hausstaub, Schimmelpilze, Hausstaubmilben, Gaschromatographie, Thermo-Desorption, Massenspektrometrie, (mikrobielle) flüchtige organische Verbindungen, artspezifische Sekundärmetabolite, Alternaria alternata, Aspergillus candidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor, Cladosporium herbarum, Cladosporium cladosporioides, Eurotium herbariorum, Stachybotrys chartarum, Trichoderma spp., Wallemia sebi, Bioindikator, Gesundheitsgefärdung, Gefährdungsabschätzung, Proteinextraktion, SDS-PAGE, Immunoblot, ELISA, Acarex Test Obwohl die Befrachtung der Luft mit Pilzsporen und die Beeinträchtigung der Innenraumluftqualität zu einer Ausprägung von Asthma im Kindesalter führen können, haben Empfehlungen für Luftschadstoffkonzentrationen (z.b. Schimmelpilze, mikrobielle flüchtige organische Verbindungen) noch nicht zu allgemeingültigen Richtlinien geführt. Bis heute ist die Vermeidung der Exposition gegenüber Pilzallergenen als Primärprophylaxe ein grundlegender Therapieansatz. Die Arten Cladosporium cladosporioides, C. herbarum, Epicoccum nigrum, Botrytis cinerea und Alternaria spp. dominierten das Artenspektrum im Innenraum, begleitet von Aspergillus und Penicillium spp. in Küche und Schlafzimmer. Letztere scheinen der autochthonen Flora anzugehören, ebenso Aureobasidium pullulans, Chaetomium spp. und Trichoderma spp., die zusammen mit Cladosporium cladosporioides, Arthrobotrys spp., Gliocladium spp. und Stachybotrys chartarum Indikatoren für eine Kontamination in Kellerräumen darstellen. Darüberhinaus ist das Auftreten xerophiler Arten wie Aspergillus versicolor, A. penicillioides, Wallemia sebi, Eurotium herbariorum und xerotoleranter Penicillium spp. oftmals mit Wasserschäden assoziiert. Das Spektrum thermotoleranter Pilzarten stellten hauptsächlich die Arten Aspergillus fumigatus, A. niger, Paecilomyces variotii, Eurotium spp. und Rhizopus microsporus. Insgesamt konnten 176 Arten isoliert werden, 143 aus Staub oder von Stockflecken, 92 Arten aus der Außenluft, 113 aus Küchen-, 68 aus Wohnzimmer- und 96 aus Schlafzimmerluft. Die Zusammensetzung der Arten spiegelt Innenraumaktivitäten deutlich wider (Nahrungsmittelzubereitung usw.). Multivarianzanalysen zeigten, daß die Artenzusammensetzung in kontaminierten Innenräumen von der üblicherweise vorhandenen Pilzflora abweicht. Die Artdiversität (Shannon-Weaver) der Küchenluft lag höher als die der Außen-, Wohnzimmer- und Schlafzimmerluft; sie ist höher für Staub als für Luft. Die KBE-Zahlen/m 3 Innenraumluft waren teilweise durch Quellen im Außenbereich bedingt, wiesen z.t. aber auch auf Innenraumquellen oder Stockflecken hin. Erhöhte KBE-Zahlen einzelner Arten in der Innenraumluft oder im Staub waren in vielen Fällen mit der Schimmelpilzflora assoziiert, die von Stockflecken isoliert wurden. Höhere KBE-Zahlen der Schimmelpilzarten in Raumluft im Vergleich zur Außenluft sind auf Innenraumquellen (Bioabfall, kontaminierte Baumaterialien usw.) zurückzuführen. Die mikrobiologischen Methoden erwiesen sich als geeignet, Kontaminationen durch Schimmelpilze im Innenraum nachzuweisen, obwohl sie teilweise mit grundlegenden Mängeln behaftet sind. Für häufige Arten wie Cladosporium spp., Alternaria alternata, Aspergillus spp. und Penicillium spp., aber insbesondere xerotolerante Arten wie Aspergillus candidus, A. versicolor, Eurotium spp. und Wallemia sebi konnte gezeigt werden, daß sie maßgeblich zu erhöhten KBE- 202

7 Zahlen in Luft oder Staub beitrugen. Auf der Grundlage von Messungen in 219 Wohnungen wurden für bestimmte Innenraumbereiche (Küche, Wohnzimmer, Schlafzimmer), Außenluft und Staub Empfehlungswerte für KBE für neun Schimmelpilzgattungen bzw. -gruppen vorgeschlagen. Die Empfehlungen sind ausschließlich im Zusammenhang mit den hier zugrundeliegenden Methoden zu verwenden und sind generell nicht ohne weiteres übertragbar auf andere Gegebenheiten (Region, Jahreszeit usw.). Um eine Kontamination durch Schimmelpilze im Innenraum und erhöhte Außenluftkonzentrationen zu detektieren, erwiesen sich die quantitative und detaillierte qualitative Erfassung von Schimmelpilzarten als geeignete Mittel eines Umwelt-Monitorings. Reinkulturen von sechzehn häufigen luftgetragenen Schimmelpilzarten isoliert aus einer Wohnung mit einem Wasserschaden wurden auf die Produktion mikrobieller flüchtiger organischer Verbindungen (MVOC) untersucht. VOCs in der Innenraumluft von Wohnungen als auch Luftproben über Staub und Reinkulturen wurden qualitativ mittels Thermodesorption und anschließender Gaschromatographie/ Massenspektrometrie analysiert. Kohlenwasserstoffe (z.b. Alkohole und Ketone), Schwefelverbindungen und eine große Anzahl an Terpenen zählten zu den häufigsten Verbindungen, aber auch Ether und Ester. Die Produktion mikrobieller flüchtiger organischer Verbindungen wurde durch das Kultivierungsmedium sowohl qualitativ als auch quantitativ beeinflußt; Nährmedien und relative Luftfeuchte beeinflußten das Wachstum der Pilze aus Staub und in Reinkultur. Die Analyse der MVOCs aus Reinkulturen häufiger Schimmelpilzarten trug zur Identifizierung bestimmter flüchtiger Verbindungen in der Innenraumluft bei. Auf verschiedenen Medien inkubiert, konnten in Kulturen von Trichoderma spp. und Stachybotrys chartarum und anderen Schimmelpilzen, die aus Wohnungen mit Feuchte- oder Wasserschäden mit z.t. starkem mikrobiellem Befall isoliert worden waren, flüchtige Verbindungen, z.b. 3-Methyl-1-butanol, 2- Methyl-1-butanol, Methylfuran, Ethyl-methyl-hexan, 3-Octanone, 1-Octen-3-ol, 3-Octen-1-ol sowie eine Vielzahl an höhermolekularen Terpenen nachgewiesen und als potentielle Bioindikatoren für Kontaminationen durch Pilze im Innenraum herausgestellt werden. Andere Terpene wie z.b. Limonen sind als Indikatoren weniger geeignet, da für sie auch andere Innenraumquellen (Pflanzen, Lösungsmittel, Kleber usw.) in Frage kommen. Darüberhinaus können charakteristische MVOCs der als Bioindikatoren bezeichneten Schimmelpilze ebenfalls zur Bioindikation dienen. Inwieweit nichtflüchtige Metabolite wie z.b. Sterigmatocystin, das von Aspergillus versicolor und Emericella nidulans (Anamorph Aspergillus nidulans) produziert wird, in der Innenraumluft oder im Staub in ausreichenden Konzentrationen nachgewiesen werden kann, ist fraglich. In Blutseren von Allergikern konnten starke Antikörperreaktionen gegen Antigenextrakte von Schimmelpilzen, die aus Innenraumluft oder Staub isoliert wurden, nachgewiesen werden. Die Probanden wurden zuvor einem Intrakutantest mit kommerziellen Extrakten unterzogen. Einflüsse der Inkubationsdauer Inkubationsdauer der getesteten Kulturen von Aspergillus fumigatus auf die Proteinzusammensetzung wurden untersucht. Deutliche Unterschiede zwischen Extrakten von Frischisolaten und kommerziell erhältlichen Extrakten wurden herausgestellt. Verschieden alte Kulturen von A. fumigatus aus Czapek- und DG18-Flüssigkulturen zeigten nur geringe Unterschiede in der Proteinzusammensetzung. Im Immunoblot der Extrakte von A. fumigatus, Penicillium chrysogenum und anderen Schimmelpilzen konnten deutliche Proteinbanden zwischen 40 und 150 kda differenziert werden. In den kommerziellen Extrakten, die üblicherweise für Intrakutan- und Pricktests verwendet werden, wurden diese Proteine nicht gefunden. Bandenintensitäten von IgG Antikörpern, die gegen Proteinextrakte zehn häufiger Schimmelpilze im Innenraum im Immunoblot und ELISA reagierten, wurden mit den Häufigkeiten der Pilzarten in Hausstaub und Innenraumluft verglichen. Häufigkeiten verschiedener Arten im Hausstaub zeigten eine gute Korrelation 203

8 mit den Ergebnissen der IgG-Antikörperreaktionen, jedoch weniger mit Intrakutantest oder erhöhtem spezifischen IgE (CAP-RAST). Unter Berücksichtigung von Kreuzreaktivitäten innerhalb und zwischen verschiedenen Gattungen kann die Zahl der positiven Korrelationen höher ausfallen, jedoch ist noch zu wenig über Kreuzreaktionen bekannt, um dies gewissenhaft durchzuführen. In wenigen Fällen traten für eine Gattung spezifische erhöhte IgE- und IgG-Konzentrationen gleichzeitig auf. Die im ELISA erhaltenen numerischen Daten haben deutliche Vorteile gegenüber dem Immunoblot, der allein eine visuelle Auswertung der Farbintensitäten zuläßt. Da die Qualität kommerzieller Extrakte und eine Standardisierung der Allergenextraktion noch nicht sichergestellt sind, sind alle beschriebenen Tests mit grundlegenden Problemen der Interpretation der Ergebnisse behaftet (verschiedene Extraktionsmethoden, Lagerung der Extrakte, Identität der Allergene, Definition und Charakterisierung der Allergenaktivität, Verlust der Aktivität bei der Extraktion, Kreuzreaktionen zwischen Arten einer oder verschiedener Gattungen). Trotz der Unsicherheiten zeigten die Ergebnisse des hier verwendeten Immunoblots vergleichbare Trends wie die des Environmental Monitoring der Exposition gegenüber Schimmelpilzen. Die Ergebnisse der Immunoblots stimmten vor allem mit nachgewiesenen Sensibilisierungen gegen Schimmelpilzarten überein und nicht so sehr mit Atemwegserkrankungen. Neben einer fundierten Artidentifizierung und -quantifizierung erlaubt eine detaillierte Untersuchung der Quellen einer Kontamination durch Schimmelpilze eine Abschätzung der Gesundheitsgefährdungen in Wohnräumen und weist Wege zu deren Vermeidung. Bis heute ist eine derartige Abschätzung schwierig, da in vielen Fällen nur wenig über die Einflüsse von Schimmelpilz-Konzentrationen (Sporen, Allergene) und mikrobiellen flüchtigen Verbindungen bekannt ist. Zusätzlich zu ihrer Bedeutung als fakultative Pathogene und Allergene können Schimmelpilze auch verschiedene toxische Wirkungen hevorrufen. Darüberhinaus ist wenig über synergistische Effekte bekannt. Schließlich erschwert die Verwendung einer Vielzahl an Meßgeräten und Meßmethoden die Vergleichbarkeit von Studien. Eine Standardisierung dieser Methoden ist daher unabdingbar. Klassische Meßmethoden wie auch moderne biochemische Analysen müssen sorgfältigst durchgeführt werden. Die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Ergebnisse können als Basis für zukünftige Studien zu Auswirkungen von Schimmelpilzbelastungen und MVOC dienen. 204