Activity and diversity of sulfate-reducing and methanogenic microorganisms in a petroleum-contaminated aquifer

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1 Research Collection Doctoral Thesis Activity and diversity of sulfate-reducing and methanogenic microorganisms in a petroleum-contaminated aquifer Author(s): Kleikemper, Jutta Publication Date: 2003 Permanent Link: Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library

2 Dissertation ETH Nr Activity and Diversity of Sulfate-Reducing and Methanogenic Microorganisms in a Petroleum- Contaminated Aquifer A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH for the degree of Doctor of Natural Sciences presented by Jutta Kleikemper Dipl.-Geoökol., University of Bayreuth born on October 7, 1972 citizen of Germany Accepted on recommendation of Prof. Dr. Josef Zeyer, examiner Prof. Dr. Bernhard Wehrli, co-examiner Dr. Martin Schroth, co-examiner Zurich 2003

3 Summary Contamination of groundwater and soil with petroleum hydrocarbons (PHC) is a widespread environmental problem. Intrinsic bioremediation of polluted sites has recently evolved as an accepted technology. This method takes advantage of microorganisms that ideally convert hydrocarbons to carbon dioxide and water. Anaerobic microbial processes such as sulfate reduction and methanogenesis play an important role for the degradation of PHC at such sites. However, these processes are poorly understood. The objective of this thesis was to assess rates of sulfate reduction and methanogenesis and to investigate microbial community structure of sulfate-reducing and methanogenic microorganisms in a PHC-contaminated aquifer. Field tests and laboratory microcosm studies were conducted and a combination of hydrological (single-well push-pull tests), chemical, molecular, and stable isotope tools was used. All studies were conducted in a PHCcontaminated aquifer in Studen, Switzerland or using sediment from this aquifer. Microbial sulfate reduction was successfully assessed and quantified using single-well push-pull tests in combination with analysis of stable sulfur isotope fractionation. Computed first-order rate coefficients for sulfate reduction ranged from to day -1. To assess the activity of different groups of sulfate-reducing bacteria, we injected low-molecular weight organic acids (acetate, lactate, propionate, and butyrate) along with sulfate in a second series of push-pull tests. Low-molecular weight organic acids are typically consumed by specific groups of sulfate-reducing bacteria (Desulfobacter, Desulfovibrio, and Desulfobulbus). Microbial activities determined in these tests agreed well with fluorescence in situ hybridization that also detected the targeted groups of sulfate-reducing bacteria. In addition, denaturing gradient gel electrophoresis showed that the structure of the suspended bacterial community did not change during the push-pull tests. In all push-pull tests, sulfur isotope fractionation provided strong evidence for microbial sulfate reduction (enrichment factor ε = ). In a microcosm study, we incubated sediment from the Studen aquifer with low-molecular weight organic acids and identified the groups of sulfate-reducing bacteria that were selectively stimulated. Additions of lactate and propionate led to the enrichment of Desulfobulbus, while acetate, butyrate and citrate enriched for Desulfobacteriaceae, as determined by fluorescence in situ hybridization and phospholipid fatty acid analysis

4 combined with multivariate statistical analysis. These results agreed with those from the push-pull experiments. The influence of carbon sources (organic acids and PHC) on the extent of sulfur isotope fractionation was investigated in microcosms using a pure culture and enrichment cultures from the Studen aquifer. The average enrichment factor of all enrichment cultures (ε = 23.0 ) agreed well with ε values determined in push-pull tests. Hence, sulfur isotope fractionation may be a useful tool to quantify microbial sulfate reduction at field sites. Methanogenesis was investigated in a series of push-pull tests by injecting acetate, formate, H 2 / CO 2 or methanol to target different groups of methanogenic Archaea. Since these substrates had to be injected at concentrations much higher than in situ concentrations for push-pull tests to be evaluable, determined rates are denoted as potential rates of methanogenesis. These rates were highest for formate (1.86 mm d -1 ), followed by H 2 (0.91 mm d -1 ), acetate (0.38 mm d -1 ), and methanol (0.11 mm d -1 ). Substrate consumption and methane production in all tests agreed with the results of molecular methods. Sequencing of bands excised from denaturing gradient gels and fluorescence in situ hybridization detected the presence of acetate- (Methanosaeta) and formate or H 2 / CO 2 - (e.g. Methanomicrobiaceae) consuming methanogens. However, no methanol-degrading Archaea were detected. In conclusion, this thesis contributes to our understanding of biogeochemical processes in a PHC-contaminated aquifer undergoing intrinsic bioremediation. In particular, sulfate reduction and methanogenesis were quantified in situ, microbial community structure was assessed, and the extent of sulfur isotope fractionation during sulfate reduction for this environment was determined in field and microcosm studies. The combination of hydrogeological, chemical, molecular, and isotope methods yielded additional insights.

5 Zusammenfassung Kontaminationen von Grundwasser und Boden mit Mineralölkohlenwasserstoffen (MKW) sind ein verbreitetes Umweltproblem. Intrinsische Bioremediation kontaminierter Standorte ist in den letzten Jahren zu einer akzeptierten Technologie geworden. Diese Methode basiert auf dem Abbau von Kohlenwasserstoffen durch Mikroorganismen, im Idealfall zu Kohlendioxid und Wasser. Anaerobe mikrobielle Prozesse wie Sulfatreduktion und Methanogenese spielen eine wichtige Rolle für den Abbau von MKW an solchen Standorten. Diese Prozesse jedoch sind bisher wenig untersucht worden. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Raten von Sulfatreduktion und Methanogenese und der Populationsstruktur von Sulfatreduzenten und methanogenen Mikroorganismen in einem MKW-kontaminierten Grundwasserleiter. Feldexperimente und Labor-Mikrokosmenstudien wurden durchgeführt und eine Kombination von hydrologischen ( Single-Well Push-Pull-Tests ), chemischen, molekularbiologischen und stabilen Isotopen- Methoden wurde eingesetzt. Alle Untersuchungen wurden in einem MKW-kontaminierten Grundwasserleiter in Studen, Schweiz, durchgeführt, beziehungsweise mit Sediment aus diesem Grundwasserleiter. Die mikrobielle Sulfatreduktion wurde mit Hilfe von Single-Well Push-Pull - Feldexperimenten in Kombination mit Analysen der Fraktionierung stabiler Schwefelisotopen erfolgreich untersucht und quantifiziert. Berechnete Ratenkoeffizienten erster Ordnung für die Sulfatreduktion lagen zwischen und d -1. Um die Aktivitäten verschiedener Gruppen von Sulfatreduzenten zu bestimmen, injizierten wir niedermolekulare organische Säuren (Acetat, Lactat, Propionat und Butyrat) zusammen mit Sulfat in einer zweiten Serie von Push-Pull Experimenten. Niedermolekulare organische Säuren werden typischerweise durch spezifische Gruppen von Sulfatreduzenten abgebaut (Desulfobacter, Desulfovibrio und Desulfobulbus). Mikrobielle Aktivitäten in diesen Tests stimmten mit Fluoreszenz in situ Hybridisierungen überein, welche die gleichen Gruppen von Sulfatreduzenten detektierten. Zusätzlich zeigte Denaturing Gradient Gelelektrophorese, dass sich die Populationsstruktur der suspendierten Bakterien während der Push-Pull Experimente nicht änderte. In allen Push-Pull Tests lieferte die Fraktionierung von Schwefelisotopen starke Hinweise auf mikrobielle Sulfatreduktion (Enrichment factor ε = ).

6 In einer Mikrokosmenstudie wurde Sediment aus dem Grundwasserleiter in Studen mit niedermolekularen organischen Säuren inkubiert und diejenigen Gruppen von Sulfatreduzenten identifiziert, welche selektiv stimuliert wurden. Zusätze von Lactat und Propionat führten zur Anreicherung von Desulfobulbus, während Acetat, Butyrat und Citrat Desulfobacteriaceae anreicherten, wie mit Hilfe von Fluoreszenz in situ Hybridisierung und Phospholipid-Fettsäuren-Analyse kombiniert mit multivariater statistischer Analyse bestimmt wurde. Diese Resultate stimmten mit denen der Push-Pull Experimente überein. Der Einfluss der Kohlenstoffquelle (organische Säuren und MKW) auf das Ausmass der Schwefelisotopenfraktionierung wurde in Mikrokosmen mit einer Reinkultur und Anreicherungskulturen aus dem Grundwasserleiter in Studen untersucht. Der durchschnittliche Enrichment factor aller Anreicherungskulturen (ε = 23.0 ) stimmte gut mit ε-werten aus Push-Pull Tests überein. Daher könnte die Schwefelisotopenfraktionierung eine nützliche Methode sein, um mikrobielle Sulfatreduktion an Feldstandorten zu quantifizieren. Die Methanogenese wurde in einer Serie von Push-Pull Tests untersucht, in der Acetat, Format, H 2 / CO 2 oder Methanol injiziert wurden, welche von verschiedenen Gruppen methanogener Archaea verwendet werden. Da diese Substrate in Konzentrationen viel höher als ihre in-situ Konzentrationen injiziert werden mussten, damit die Push-Pull Tests auswertbar waren, bezeichnen wir die gemessenen Raten als potentielle Raten der Methanogenese. Diese Raten waren am höchsten für Format (1.86 mm d -1 ), gefolgt von H 2 (0.91 mm d -1 ), Acetat (0.38 mm d -1 ) und Methanol (0.11 mm d -1 ). Substratzehrung und Methanproduktion in allen Tests stimmten mit den Resultaten molekularer Methoden überein. Sequenzierung ausgeschnittener Banden aus Denaturing Gradient Gelen und Fluoreszenz in situ Hybridisierung detektierten die Anwesenheit Acetat- (Methanosaeta) und Format- oder H 2 / CO 2 - (z. B. Methanomicrobiaceae) verwendender methanogener Archaea. Allerdings konnten keine Methanol-degradierenden Archaea detektiert werden. Diese Arbeit trägt bei zum Verständnis von biogeochemischen Prozessen in einem MKWkontaminierten Grundwasserleiter, in dem intrinsische Bioremediation abläuft. Insbesondere wurden Sulfatreduktion und Methanogenese in situ quantifiziert, die mikrobielle Populationsstruktur untersucht und das Ausmass der Schwefelisotopenfraktionierung während der Sulfatreduktion an einem solchen Standort in Feld- und Mikrokosmenstudien erkundet. Die Kombination von hydrogeologischen, chemischen, molekularbiologischen und Isotopenmethoden ergab zusätzliche Einblicke.