HercepTest for the Dako Autostainer

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1 HercepTest for the Dako Autostainer Code K th edition/ 19ème édition/ 19. Ausgabe For immunocytochemical staining. The kit is for 50 tests (100 slides). Pour coloration immunocytochimique. Le kit est prévu pour 50 tests (100 lames). Für immunzytochemische Färbeverfahren. Der Kit ist für 50 Tests (100 Objektträger) ausreichend. ( ) P04087EFG_01_K / p. 1/152

2 Contents/ Contenu/ Inhalt ENGLISH Page/ Page/ Seite Intended Use 6 Summary and Explanation - Breast 7 Background 7 Characteristics 7 Principle of Procedure - Breast 7 Reagents - Breast 8 Materials provided 8 Materials required but not provided 9 Storage - Breast 10 Specimen Preparation - Breast 10 Paraffin-embedded sections 10 Treatment of tissues prior to staining 10 Precautions - Breast 11 INSTRUCTIONS FOR USE - Breast 12 A. Reagent Preparation 12 A.1 Epitope Retrieval Solution 12 A.2 Wash Buffer 12 A.3 Substrate-Chromogen Solution (DAB) 12 A.4 Counterstain 12 A.5 Mounting Medium 13 B. Staining Procedure Performed on the Autostainer 13 B.1 Procedural notes 13 B.2 Staining protocol 13 Quality Control - Breast 16 Interpretation of Staining - Breast 18 Limitations - Breast 21 General limitations 21 Product-specific limitations 21 Performance Characteristics - Breast 22 Background 22 Comparison studies 22 Comparison to the Clinical Trial Assay (CTA) 22 Accuracy 23 Reproducibility 23 Immunoreactivity 24 Troubleshooting - Breast 25 Summary and Explanation - Gastric 28 Background 28 Characteristics 28 Principle of Procedure - Gastric 28 Reagents - Gastric 29 Materials provided 29 Materials required but not provided 30 Storage - Gastric 30 Specimen Preparation - Gastric 30 Paraffin-embedded sections 31 Treatment of tissues prior to staining 31 Precautions - Gastric 32 INSTRUCTIONS FOR USE - Gastric 33 A. Reagent Preparation 33 A.1 Epitope Retrieval Solution 33 A.2 Wash Buffer 33 A.3 Substrate-Chromogen Solution (DAB) 33 A.4 Counterstain 34 A.5 Mounting Medium 34 B. Staining Procedure Performed on the Autostainer 34 B.1 Procedural notes 34 B.2 Staining protocol 35 Quality Control - Gastric 36 Interpretation of Staining - Gastric 38 Limitations - Gastric 41 General limitations 41 Product-specific limitations 42 Performance Characteristics - Gastric 42 Background 42 Reproducibility 44 ( ) P04087EFG_01_K / p. 2/152

3 Immunoreactivity 47 Troubleshooting - Gastric 48 References 149 Explanation of symbols 151 FRANÇAIS Utilisation prévue 51 Résumé et explication Sein 52 Contexte 52 Caractéristiques 52 Principe de la procédure Sein 52 Réactifs Sein 53 Matériel fourni 53 Matériel requis mais non fourni 54 Conservation Sein 55 Préparation des échantillons Sein 55 Coupes incluses en paraffine 55 Traitement des tissus avant coloration 56 Précautions - Sein 56 INSTRUCTIONS D UTILISATION Sein 57 A. Préparation des réactifs 57 A.1 Solution de restauration de l épitope 57 A.2 Tampon de lavage 58 A.3 Solution de substrat chromogène (DAB) 58 A.4 Contre-colorant 58 A.5 Milieu de montage 58 B. Procédure de coloration sur l Autostainer 58 B.1 Remarques sur la procédure 58 B.2 Protocole de coloration 59 Contrôle de qualité Sein 61 Interprétation de la coloration Sein 63 Limites Sein 66 Limites générales 66 Limites spécifiques au produit 67 Caractéristiques de performance Sein 68 Contexte 68 Études comparatives 68 Comparaison à l essai clinique (CTA) 68 Précision 69 Reproductibilité 69 Immunoréactivité 70 Dépannage Sein 71 Résumé et explication Estomac 74 Contexte 74 Caractéristiques 74 Principe de la procédure Estomac 74 Réactifs Estomac 75 Matériel fourni 75 Matériel requis mais non fourni 76 Conservation Estomac 77 Préparation des échantillons Estomac 77 Coupes incluses en paraffine 77 Traitement des tissus avant coloration 78 Précautions Estomac 78 INSTRUCTIONS D UTILISATION Estomac 81 A. Préparation des réactifs 81 A.1 Solution de restauration de l épitope 81 A.2 Tampon de lavage 81 A.3 Solution de substrat chromogène (DAB) 81 A.4 Contre-colorant 81 A.5 Milieu de montage 81 B. Procédure de coloration sur l Autostainer 82 B.1 Remarques sur la procédure 82 B.2 Protocole de coloration 82 Contrôle de qualité Estomac 84 Interprétation de la coloration Estomac 85 Limites Estomac 89 Limites générales 89 ( ) P04087EFG_01_K / p. 3/152

4 Limites spécifiques au produit 90 Caractéristiques de performance Estomac 91 Contexte 91 Reproductibilité 92 Immunoréactivité 95 Dépannage Estomac 96 Références 149 Explication des symbols 151 DEUTSCH Verwendungszweck 99 Zusammenfassung und Erläuterung - Brustkrebs 100 Hintergrund 100 Eigenschaften 100 Prinzip des Testverfahrens - Brustkrebs 100 Reagenzien - Brustkrebs 101 Mitgelieferte Materialien 101 Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs) 102 Aufbewahrung - Brustkrebs 102 Probenvorbereitung - Brustkrebs 103 Paraffineingebettete Schnitte 103 Gewebebehandlung vor der Färbung 103 Vorsichtsmaßnahmen - Brustkrebs 104 GEBRAUCHSANWEISUNG - Brustkrebs 105 A. Reagenzienvorbereitung 105 A.1 Epitopdemaskierungslösung 105 A.2 Waschpuffer 105 A.3 Substrat-Chromogenlösung (DAB) 106 A.4 Gegenfärbung 106 A.5 Fixiermittel 106 B. Färbeprozedur auf dem Autostainer 106 B.1 Hinweise 106 B.2 Färbeprotokoll 107 Qualitätskontrolle - Brustkrebs 109 Interpretation des Anfärbens - Brustkrebs 110 Beschränkungen - Brustkrebs 114 Allgemeine Beschränkungen 114 Produktspezifische Beschränkungen 115 Leistungsmerkmale - Brustkrebs 115 Hintergrund 115 Vergleichsstudien 116 Vergleich mit dem Clinical Trial Assay (CTA) 116 Genauigkeit 117 Reproduzierbarkeit 117 Immunreaktivität 118 Fehlersuche - Brustkrebs 119 Zusammenfassung und Erläuterung - Magenkarzinom 122 Hintergrund 122 Eigenschaften 122 Prinzip des Testverfahrens - Magenkarzinom 122 Reagenzien - Magenkarzinom 123 Mitgelieferte Materialien 123 Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs) 124 Aufbewahrung - Magenkarzinom 125 Probenvorbereitung - Magenkarzinom 125 Paraffineingebettete Schnitte 125 Gewebebehandlung vor der Färbung 126 Vorsichtsmaßnahmen - Magenkarzinom 126 GEBRAUCHSANWEISUNG - Magenkarzinom 129 A. Reagenzienvorbereitung 129 A.1 Epitopdemaskierungslösung 129 A.2 Waschpuffer 129 A.3 Substrat-Chromogenlösung (DAB) 129 A.4 Gegenfärbung 129 A.5 Fixiermittel 129 B. Färbeprozedur auf dem Autostainer 130 B.1 Hinweise 130 B.2 Färbeprotokoll 130 ( ) P04087EFG_01_K / p. 4/152

5 Qualitätskontrolle - Magenkarzinom 132 Interpretation des Anfärbens - Magenkarzinom 134 Beschränkungen - Magenkarzinom 137 Allgemeine Beschränkungen 137 Produktspezifische Beschränkungen 138 Leistungsmerkmale - Magenkarzinom 139 Hintergrund 139 Reproduzierbarkeit 141 Immunreaktivität 145 Fehlersuche - Magenkarzinom 146 Literatur 149 Erläuterung der Symbole 151 ( ) P04087EFG_01_K / p. 5/152

6 ENGLISH Intended Use For in vitro diagnostic use. HercepTest is a semi-quantitative immunocytochemical assay to determine HER2 protein overexpression in breast cancer tissues routinely processed for histological evaluation and formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue from patients with adenocarcinoma of the stomach including gastroesophageal junction. HercepTest is indicated as an aid in the assessment of patients for whom Herceptin (trastuzumab) treatment is being considered (see Herceptin package insert). NOTE for breast cancer only: All of the patients in the Herceptin clinical trials were selected using an investigational immunocytochemical clinical trial assay (CTA). of the patients in those trials were selected using the HercepTest. The HercepTest was compared to the CTA on an independent set of samples and found to provide acceptably concordant results. The actual correlation of the HercepTest to Herceptin clinical outcome has not been established. NOTE for gastric cancer only: All of the patients in the phase III BO18255 (ToGA) study sponsored by Hoffmann-La Roche were selected using Dako HercepTest (IHC) and Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH). The study demonstrated the clinical utility of both tests for the assessment of HER2 status in patients with inoperable locally advanced, recurrent and/or metastatic adenocarcinoma of the stomach, or gastroesophageal junction. For the present kit, Code K5207, reagent volumes have been adjusted especially for use with the Autostainer. Adenocarcinoma of the stomach including gastroesophageal junction is also referred to as gastric cancer in this document. For breast cancer application, please refer to pages For gastric cancer application, please refer to pages Important: Please note differences for breast cancer tissue and gastric cancer tissue especially in the Interpretation of Staining Sections. ( ) P04087EFG_01_K / p. 6/152

7 Breast Cancer Summary and Explanation - Breast Background The human HER2 gene (also known as ERBB2 or NEU) encodes a protein often referred to as HER2 protein or p185 HER2. The HER2 protein is a membrane receptor tyrosine kinase with homology to the epidermal growth factor receptor (EGFR or HER1) (1-8). The HER2 protein is a normal component expressed by a variety of epithelial cell types (8). In a fraction of patients with breast cancer, the HER2 protein is overexpressed as part of the process of malignant transformation and tumor progression (9). Overexpression of the HER2 protein on the surface of breast cancer cells suggested that it could be a target for an antibody therapeutic. Herceptin (trastuzumab) is a humanized monoclonal antibody (10) that binds with high affinity to the HER2 protein and has been shown to inhibit the proliferation of human tumor cells that overexpress HER2 protein in vitro and in vivo (11-13). Characteristics HercepTest was developed to provide an alternative to the investigational CTA used in the Herceptin clinical studies. The performance of HercepTest for determination of HER2 protein overexpression was evaluated in an independent study comparing the results of the HercepTest to the CTA on 548 breast tumor specimens, none of which were obtained from patients in the Herceptin clinical studies. The results indicated a 79% concordance between the results from the two assays on these tissue specimens. The concordance data also indicates that a 3+ reading with HercepTest was highly likely to correspond with a positive reading on the CTA which would have met the entry criteria for the trial (2+ or 3+). A finding of 2+ on HercepTest did not correlate as well with the CTA results. Approximately 42% (53/126) of HercepTest 2+ results were negative by CTA (0-1+) which would not have allowed entry into the Herceptin clinical trials. HercepTest is interpreted as negative for HER2 protein overexpression (0 and 1+ staining intensity), weakly positive (2+ staining intensity), and strongly positive (3+ staining intensity). HercepTest is not intended to provide prognostic information to the patient and physician and has not been validated for that purpose. Principle of Procedure - Breast The HercepTest contains reagents required to complete a two-step immuno-cytochemical staining procedure for routinely processed, paraffin-embedded specimens. Following incubation with the primary rabbit antibody to human HER2 protein, this kit employs a ready-to-use Visualization Reagent based on dextran technology. This reagent consists of both secondary goat anti-rabbit immunoglobulin molecules and horseradish peroxidase molecules linked to a common dextran polymer backbone, thus eliminating the need for sequential application of link antibody and peroxidase-conjugated antibody. Cross-reaction of the Visualization Reagent with human immunoglobulins and fetal calf serum has been removed by solid-phase absorption. The enzymatic conversion of the subsequently added chromogen results in formation of a visible reaction product at the antigen site. The specimen may then be counterstained and coverslipped. Results are interpreted using a light microscope. Control Slides containing three formalin-fixed, paraffin-embedded human breast cancer cell lines with staining intensity scores of 0, 1+, and 3+ are provided to validate staining runs. The staining intensity of these cell lines has been correlated to the number of receptors per cell. HercepTest, Code K5207, is applicable for automated staining using the Autostainer. ( ) P04087EFG_01_K / p. 7/152

8 Breast Cancer Reagents - Breast Materials provided The materials listed below are sufficient for 50 tests (50 slides incubated with Primary Antibody to HER2 Protein and 50 slides incubated with the corresponding Negative Control Reagent). The number of tests is based on the use of 200 µl per tissue section (22 mm x 22 mm) of vials Nos. 1, 2, 3 and 4, and of the Substrate-Chromogen Solution (DAB). The kit provides materials sufficient for a maximum of 15 individual staining runs. Vial No. Quantity Description 1 2 x 11 ml 2 1 x 12 ml 3 2 x 11 ml 4 1 x 12 ml 5 15 x 11 ml 6 3 x 3 ml 7 3 x 500mL 8 2 x 1 L 3 x 5 slides Peroxidase-Blocking Reagent: 3% hydrogen peroxide containing 15 mmol/l sodium azide (NaN 3 ). Rabbit Anti-Human HER2 Protein: Ready-to-use affinity-isolated antibody. Supplied in 0.05 mol/l Tris/HCl, 0.1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7.2, containing stabilizing protein. Immunogen: Synthetic C-terminal fragment (intracytoplasmic part) of the HER2 protein coupled to keyhole limpet hemocyanin. Specificity: HER2 protein. Purification method: The antibody is affinity isolated by using an immobilized HER2 protein peptide. Visualization Reagent: Dextran polymer conjugated with horseradish peroxidase and affinity-isolated goat anti-rabbit immunoglobulins. Supplied in Tris/HCl buffer containing stabilizing protein and an antimicrobial agent. Negative Control Reagent: Immunoglobulin fraction of normal rabbit serum at an equivalent protein concentration as the antibody to HER2 protein. Supplied in 0.05 mol/l Tris/HCl, 0.1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7.2, containing stabilizing protein. DAB Buffered Substrate: Substrate buffer solution, ph 7.5, containing <0.1% hydrogen peroxide, stabilizers, enhancers, and an antimicrobial agent. DAB Chromogen: 5% 3,3 -diaminobenzidine tetrahydrochloride chromogen solution. Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): 0.1 mol/l citrate buffer with a detergent. Wash Buffer (10x): Tris/HCl buffer with a detergent and an antimicrobial agent. Control Slides: Each slide contains sections of three formalinfixed, paraffin-embedded breast carcinoma cell lines representing ( ) P04087EFG_01_K / p. 8/152

9 Breast Cancer different levels of HER2 protein expression: MDA-231 (0), MDA- 175 (1+), and SK-BR-3 (3+). The Control Slides have been heat treated for better adherence of sections to glass slides. Any additional heat treatment of Control Slides performed to improve the adherence of sections to glass slides may compromise staining results. NOTE: All reagents, including Epitope Retrieval Solution and Wash Buffer, are formulated specifically for use with this test. For the test to perform as specified, no substitutions should be made except for the Wash Buffer, where Dako Code S3006 may be used. Materials required but not provided Ammonium hydroxide, 15 mol/l diluted to 37 mmol/l Counterstain: Hematoxylin, such as water-based Mayer's Hematoxylin, Dako Code S3301 (see INSTRUCTIONS FOR USE, A.4) Coverslips Distilled or deionized water (Washing Water) Drying oven, capable of maintaining 60 C or less Ethanol, absolute and 95% Light microscope (4-40x objective magnification) Mounting medium, such as Dako Faramount, Code S3025, or Glycergel, Code C0563 Positive and Negative Tissues to use as process controls (see Quality Control Section) Slides, SuperFrost Plus, poly-l-lysine-coated slides, or Dako Silanized Slides, Code S3003, (see Specimen Preparation) Staining jars or baths Timer (capable of 2-40 minute intervals) Water bath with lid (capable of maintaining Epitope Retrieval Solution at C) Xylene, toluene, or xylene substitutes K5207 has been tailored for use with the Autostainer Immunostaining System, Code S3400. Please refer to the Autostainer User Guide for necessary Autostainer Components. ( ) P04087EFG_01_K / p. 9/152

10 Breast Cancer Storage - Breast Store at 2-8 C. Do not use the kit after the expiration date stamped on the outside package. If reagents are stored under any conditions other than those specified in this package insert, they must be validated by the user (14a, 14b). Note that Control Slides must also be stored at 2-8 C. There are no obvious signs to indicate instability of this product. Therefore, Positive and Negative Controls should be run simultaneously with patient specimens. If unexpected staining is observed, which cannot be explained by variations in laboratory procedures, and a problem with HercepTest is suspected, immediately contact Dako s Technical Services. Specimen Preparation - Breast Specimens from biopsy must be handled to preserve the tissue for immunocytochemical staining. Standard methods of tissue processing should be used for all specimens (15). Paraffin-embedded sections Tissues preserved in neutral buffered formalin or Bouin s fixative for routine processing and paraffin embedding are suitable for use. For example, specimens from the biopsy should be blocked into a thickness of 3 or 4 mm and fixed for hours in neutral buffered formalin. The tissues are then dehydrated in a series of alcohols and xylene, followed by infiltration by melted paraffin held at no more than 60 C. Properl y fixed and embedded tissues expressing the HER2 protein will keep indefinitely prior to sectioning and slide mounting if stored in a cool place (15-25 C) (15, 16). In the USA, the Clinical Laboratory Improvement Act of 1988 requires in 42 CFR (b) that The laboratory must retain stained slides at least ten years from the date of examination and retain specimen blocks at least two years from the date of examination (16). Tissue specimens should be cut into sections of 4-5 µm, mounted onto slides and air-dried at room temperature for a minimum of 12 hours (or until dry) or at 37 C overnight or at 60 C for one hour. CAUTION: Excessive heating for more than one hour at 60 C may cause a significant decrease or loss of the specific membrane-associated HER2 immunoreactivity (17). To preserve antigenicity, tissue sections mounted onto slides (SuperFrost Plus, poly-l-lysine or silanized slides) should be stained within 4-6 weeks of sectioning when stored at room temperature (20-25 C) (18). The slides required fo r HER2 protein evaluation and verification of tumor presence should be prepared at the same time. A minimum of 5 slides is recommended, 1 slide for tumor presence, 2 slides for HER2 protein evaluation (1 for incubation with vial No. 2 and 1 for incubation with vial No. 4), and 2 slides for back-up. The use of HercepTest TM on decalcified tissues has not been validated and is not recommended. Consult Dako s "Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods" (19) and references 15 and 16 for further details on specimen preparation. Treatment of tissues prior to staining A specific epitope retrieval method in 10 mmol/l citrate buffer, must be used for optimal assay performance. The Epitope Retrieval Solution is supplied in the HercepTest kit. This method involves heating of tissue sections mounted on slides that are immersed in 10 mmol/l citrate buffer (20) in a calibrated water bath capable of maintaining the Epitope Retrieval Solution at the required temperature (95-99 C). Laboratories l ocated at higher elevations should determine the best method of maintaining the required water bath temperature. The epitope retrieval must be performed in a water bath. Other methods of heating have been tested and do not give reproducible results. Immediately after epitope retrieval, commence the staining procedure. Deviation from the described procedure may affect results. ( ) P04087EFG_01_K / p. 10/152

11 Breast Cancer Precautions - Breast 1. For in vitro diagnostic use. 2. For professional users. 3. Vial 1, Peroxidase-Blocking Reagent, contains 3% hydrogen peroxide. Safety data sheet available for professional users on request. 4. Vial 6, DAB Chromogen, contains 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride and is labeled: H350 H341 P201 P280 Danger P308 + P313 P405 P501 May cause cancer. Suspected of causing genetic defects. Obtain special instructions before use. Wear protective gloves. Wear eye or face protection. Wear protective clothing. IF exposed or concerned: Get medical attention. Store locked up. Dispose of contents and container in accordance with all local, regional, national and international regulations. As a general rule, persons under 18 years of age are not allowed to work with this product. Users must be carefully instructed in the proper work procedure, the dangerous properties of the product and the necessary safety instructions. Please refer to the Safety Data Sheet (SDS) for additional information. 5. Vial 8, Wash Buffer (10x), contains 5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride, and 0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane. May produce an allergic reaction. The Wash Buffer (10x) is labeled: Warning H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Causes serious eye irritation. Wear eye or face protection. Wash hands thoroughly after handling. IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. 6. This product contains sodium azide (NaN 3 ), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though not classified as hazardous, sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups of metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent metal azide build-up in plumbing (21, 22). 7. Vial 2, 3 and 4 contain material of animal origin. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used. 8. Control slides and specimens, before and after fixation, and all materials exposed to them, should be handled as if capable of transmitting infection, and disposed of with proper precautions (23). Never pipette reagents by mouth and avoid contacting the skin and mucous membranes with reagents and specimens. If reagents come in contact with sensitive areas, wash with copious amounts of water. 9. Minimize microbial contamination of reagents to avoid non-specific staining. ( ) P04087EFG_01_K / p. 11/152

12 Breast Cancer 10. Incubation times, temperatures, or methods other than those specified may give erroneous results. Excess drying at 60 C for more than one hour may cause a significan t decrease or loss of the specific membrane-associated HER2 immunoreactivity (17). 11. Reagents have been optimally diluted. Further dilution may result in loss of antigen staining. 12. All reagents, including Epitope Retrieval Solution and Wash Buffer, are formulated specifically for use with this test. In order for the test to perform as specified, no substitutions should be made except for the Wash Buffer, where Code S3006 may be used. 13. The Visualization Reagent and DAB Chromogen may be affected adversely if exposed to excessive light levels. Do not store system components or perform staining in strong light, such as direct sunlight. 14. Wear appropriate personal protective equipment to avoid contact with eyes and skin. Refer to the Safety Data Sheet (SDS) for additional information. 15. Paraffin residuals may lead to false negative results. 16. Use of reagent volumes other than recommended may result in loss of visible HER2 immunoreactivity. Tissue sections larger than 22 mm x 22 mm will require 2-3x 200 µl of reagent applied in 2-3 automated application areas. INSTRUCTIONS FOR USE - Breast A. Reagent Preparation It is convenient to prepare the following reagents prior to staining: A.1 Epitope Retrieval Solution Dilute a sufficient quantity of Vial 7 (Epitope Retrieval Solution 10x) 1:10 using distilled or deionized water for the staining procedure that is planned. Unused diluted solution may be stored at 2-8 C for one month. Discard diluted sol ution if cloudy in appearance. A.2 Wash Buffer Dilute a sufficient quantity of Vial 8 (Wash Buffer 10x) 1:10 using distilled or deionized water for the wash steps. Unused diluted buffer may be stored at 2-8 C for o ne month. Discard buffer if cloudy in appearance. The Autostainer is programmed to rinse tissue sections after the Peroxidase-Blocking Reagent and Substrate-Chromogen Solution. Note that for these rinse steps either distilled (or deionized) water or Wash Buffer may be used. All other rinse steps require the use of Wash Buffer. A.3 Substrate-Chromogen Solution (DAB) Prepare Substrate-Chromogen Solution by adding 11 drops (25-30 µl per drop) of DAB Chromogen from Vial 6 to one Vial 5 containing DAB Buffered Substrate (11 ml) and mix. Prepared Substrate-Chromogen Solution (DAB) is stable for approximately 5 days when stored at 2-8 C. This solution should be mixed thoroughly prior to use. Any precipitate developing in the solution does not affect staining quality. NOTE: The color of the DAB Chromogen in Vial 6 may vary from clear to light lavender-brown. This will not affect the performance of this product. Please dilute according to the guidelines in this package insert. Addition of excess DAB Chromogen to the DAB Buffered Substrate will result in deterioration of the positive signal. A.4 Counterstain The colored end-product of the DAB staining reaction is alcohol and water insoluble. Use a hematoxylin counterstain and adjust the hematoxylin staining intensity to a similar level shown in Dako s "HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer". Hematoxylin, either alcohol or water-based, such as Dako Mayer's Hematoxylin, Code S3301, may be used. Follow hematoxylin counterstaining with a thorough rinse in distilled or deionized water, then immerse tissue slides into a bath of 37 mmol/l ammonia water (see Section B.2, Step 3). ( ) P04087EFG_01_K / p. 12/152

13 Breast Cancer Ammonia water (37 mmol/l) is prepared by mixing 2.5 ml of 15 mol/l (concentrated) ammonium hydroxide with 1 liter of distilled or deionized water. Unused 37 mmol/l ammonia water may be stored at room temperature (20-25 C) in a tightly capped bottle for up to 12 months. A.5 Mounting Medium Non-aqueous, permanent mounting medium is recommended. However, aqueous mounting is also acceptable. Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use, Code S3025, or Glycergel Mounting Medium, Code C0563, is recommended for aqueous mounting. Liquefy Glycergel by warming to approximately 40 (± 5) C prior to use. B. Staining Procedure Performed on the Autostainer B.1 Procedural notes The user should read these instructions carefully and become familiar with all components and instrumentation prior to use (see Precautions). All reagents should be equilibrated to room temperature (20-25 C) prior to immunostaining. Likewise, all incubations should be performed at room temperature. Do not allow tissue sections to dry while loading slides on the Autostainer and during the staining procedure. Dried tissue sections may display increased non-specific staining. If the staining procedure is interrupted, slides may be kept in a buffer bath following incubation of the primary antibody for up to one hour at room temperature (20-25 C) without affecting the staining performance. Deparaffinization and rehydration: Prior to staining, tissue slides must be deparaffinized to remove embedding medium and rehydrated. Avoid incomplete removal of paraffin. Residual embedding medium will result in increased non-specific staining. This step should be performed at room temperature (20-25 C). 1. Place slides in a xylene bath and incubate for 5 (±1) minutes. Change baths and repeat once. 2. Tap off excess liquid and place slides in absolute ethanol for 3 (±1) minutes. Change baths and repeat once. 3. Tap off excess liquid and place slides in 95% ethanol for 3 (±1) minutes. Change baths and repeat once. 4. Tap off excess liquid and place slides in distilled or deionized water for a minimum of 30 seconds. Commence staining procedure as outlined in Section B.2, Step 1, Epitope retrieval. Xylene and alcohol solutions should be changed after 40 slides. Toluene or xylene substitutes, such as Histoclear, may be used in place of xylene. NOTE: The reagents and instructions supplied in this kit have been designed for optimal performance. Further dilution of the reagents or alteration of incubation temperatures may give erroneous or discordant results. Differences in tissue processing and technical procedures in the user s laboratory may invalidate the assay results for use in selecting patients for Herceptin therapy. B.2 Staining protocol Performed at room temperature, C. Step 1: Epitope retrieval Fill staining jars, e.g. Coplin jars, with the diluted Epitope Retrieval Solution (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.1). Place staining jars containing Epitope Retrieval Solution in water bath. Heat water bath and the Epitope Retrieval Solution to C. Upon heating the Epitope Retrieval Solution becomes cloudy in appearance. Cover jars with lids to stabilize the temperature and avoid evaporation. ( ) P04087EFG_01_K / p. 13/152

14 Breast Cancer Immerse the room temperature deparaffinized sections in the preheated Epitope Retrieval Solution in the staining jars. BRING TEMPERATURE OF THE WATER BATH AND THE EPITOPE RETRIEVAL SOLUTION BACK TO C. Incubate for 40 (±1) minutes at C. Remove the entire jar with slides from the water bath. Allow the slides to cool in the Epitope Retrieval Solution for 20 (±1) minutes at room temperature. Decant the Epitope Retrieval Solution and rinse sections in the Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.2). For optimal performance, soak sections in Wash Buffer for 5-20 minutes after epitope retrieval and prior to staining. NOTE: The Epitope Retrieval Solution is designed for single use application only. Do not re-use. Step 2: Autostainer procedure 1. Use the Autostainer-generated map on the HercepTest autoprogram for required program times and reagent volumes (see point 4 below for specific volumes). 2. Place the Autostainer reagent vials in the Autostainer reagent rack according to the computer-generated reagent map. 3. Load the slides onto the Autostainer according to the computer- generated slide map. 4. Set Program and begin the HercepTest program. The following is an outline of the program run: Rinse 200 µl Peroxidase-Blocking Reagent - 5 minutes Rinse 200 µl Primary Anti-HER2 Protein (or Negative Control Reagent) - 30 minutes Rinse 200 µl Visualization Reagent - 30 minutes Rinse Rinse Switch 200 µl Substrate-Chromogen Solution (DAB) - 10 minutes Rinse slides in deionized water after the substrate-chromogen step NOTE: Autostainer Hardware version 01 rinses slides in buffer. Therefore, the slides must be rinsed with deionized water after they have been removed from the Autostainer. Step 3: Counterstain (instructions are for hematoxylin) Remove slides from the Autostainer and counterstain in hematoxylin as described below. Immerse slides in a bath of hematoxylin. Incubate for 2 5 minutes, depending on the strength of hematoxylin used. Rinse gently in a distilled or deionized water bath. Ensure all residual hematoxylin has been cleared. Optional: Dip slides 10 times into a bath of 37 mmol/l ammonia water (see Section A.4). Rinse slides gently in a bath of distilled or deionized water for 2-5 minutes. NOTE: Depending on the incubation length and potency of the hematoxylin used, counterstaining will result in a pale to dark blue coloration of the cell nuclei. Excessive or incomplete counterstaining may compromise proper interpretation of results. ( ) P04087EFG_01_K / p. 14/152

15 Breast Cancer Step 4: Mounting Non-aqueous, permanent mounting medium is recommended. Otherwise, aqueous mounting medium is also acceptable. Specimens may be mounted and coverslipped with a water-based mounting medium such as Dako Faramount, Code S3025, or Glycergel, Code C0563. NOTE: Slides may be read when convenient. However, some fading may occur if slides are coverslipped with an aqueous mounting medium and exposed to strong light over a period of one week. To minimize fading, store slides in the dark at room temperature (20-25 C). ( ) P04087EFG_01_K / p. 15/152

16 Breast Cancer Quality Control - Breast Differences in tissue fixation, processing and embedding in the user s laboratory may produce significant variability in results, necessitating regular performance of in-house controls in addition to the Control Slides supplied by Dako. In the USA, consult the quality control guidelines of the College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry, see also CLSI (formerly NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24), and reference 25 for additional information. Table 1. The purpose of daily quality control. Tissue: Fixed and Processed Like Patient Sample Positive Control: Tissue or cells containing target antigen to be detected (could be located in patient tissue). The ideal control is weakly positive staining tissue as this is most sensitive to antibody or antigen degradation Specific Antibody and Secondary Antibody Controls all steps of the analysis. Validates reagent and procedures used for HER2 protein staining Non-Specific Antibody* or Buffer Plus Same Secondary Antibody as Used with Specific Antibody Detection of non-specific background staining Negative Control: Tissues or cells expected to be negative (could be located in patient tissue or positive control tissue) Detection of unintended antibody crossreactivity to cells/cellular components Detection of non-specific background staining Patient tissue Detection of specific staining Detection of non-specific background staining Control Slide supplied by Dako Controls staining procedure only * Serum from same species as the specific antibody, but not directed against the same target antigen. To detect non-specific antibody binding, e.g. binding of Fc portion of antibody by the tissue. Control Slide (provided): Each of the supplied Control Slides contains three pelleted, formalin-fixed, paraffin-embedded human breast cancer cell lines with staining intensity scores of 0, 1+ and 3+. One slide should be stained in each staining run. The evaluation of the Control Slide cell lines supplied by Dako indicates the validity of the staining run. Positive Control Tissue: Controls should be fresh autopsy/biopsy/surgical specimens fixed, processed and embedded as soon as possible in the same manner as the patient sample(s). Positive tissue controls are indicative of correctly prepared tissues and proper staining techniques. One Positive Control Tissue for each set of test conditions should be included in each staining run. The Positive Control Tissues should give weak positive staining so they can detect subtle changes in the primary antibody sensitivity. The Control Slides supplied with this kit or specimens processed differently from the patient sample(s) validate reagent performance only and do not verify tissue preparation. Use previously determined HER2 protein 2+ overexpressing invasive (infiltrating) human breast carcinoma tissue for the ideal Positive Control Tissue. NOTE: Known positive control tissue should only be utilized for monitoring the correct performance of processed tissues and test reagents, NOT as an aid in formulating a specific diagnosis of patient samples. If the Positive Control Tissue fails to demonstrate appropriate positive staining, results with the patient specimens should be considered invalid. Negative Control Tissue: Use a negative control tissue (known to be HER2 protein negative) fixed, processed and embedded in a manner identical to the patient sample(s) with each staining run to verify the specificity of the primary antibody and to provide an indication of specific background staining. Colon, liver or thyroid are appropriate for negative control tissue. The variety of different cell types present in most tissue sections offers internal negative ( ) P04087EFG_01_K / p. 16/152

17 Breast Cancer control sites (this should be verified by the user). Normal breast ducts can serve as internal negative controls. If specific staining occurs in the Negative Control Tissue or in the internal negative control tissue, results with the patient specimens should be considered invalid and the test re-run. Non-Specific Negative Control Reagent: Use the supplied Negative Control Reagent in place of the primary antibody with a section of each patient specimen to evaluate non-specific staining and allow better interpretation of specific staining at the antigen site. The incubation period for the Negative Control Reagent should correspond to that of the primary antibody. Assay verification: Prior to initial use of an antibody or staining system in a diagnostic procedure, the user should verify the antibody's specificity by testing it on a series of in-house tissues with known immunocytochemical performance characteristics representing known positive and negative tissues. Refer to the quality control procedures previously outlined in this section of the product insert and to the quality control requirements of the CAP Certification Program for Immunohistochemistry and/or CLSI (formerly NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24). These quality control procedures should be repeated for each new antibody lot, or whenever there is a change in assay parameters. Breast carcinomas with known HER2 protein staining intensities from 0-3+ and negative tissues, e.g. colon, liver or thyroid are suitable for assay verification. ( ) P04087EFG_01_K / p. 17/152

18 Breast Cancer Interpretation of Staining - Breast For the determination of HER2 protein overexpression, only the membrane staining intensity and pattern should be evaluated using the scale presented in Table 2. Slide evaluation should be performed by a pathologist using a light microscope. For evaluation of the immunocytochemical staining and scoring, an objective of 10x magnification is appropriate. The use of a 20-40x objective magnification is useful in confirmation of the score. Cytoplasmic staining should be considered non-specific staining and is not to be included in the assessment of membrane staining intensity (8). To aid in the differentiation of 0, 1+, 2+ and 3+ staining, refer to Dako s "HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer" for representative pictures of the staining intensities. Only specimens from patients with invasive breast carcinoma should be scored. In cases with carcinoma in situ and invasive carcinoma in the same specimen, only the invasive component should be scored. Table 2. Cell membrane staining intensity criteria. Staining pattern No staining is observed or membrane staining is observed in less than 10% of the tumor cells A faint/barely perceptible membrane staining is detected in more than 10% of the tumor cells. The cells are only stained in part of their membrane A weak to moderate complete membrane staining is observed in more than 10% of the tumor cells A strong complete membrane staining is observed in more than 10% of the tumor cells Score (Report to treating physician) HER2 Protein Overexpression Assessment (Report to treating physician) Negative Negative Weakly positive Strongly positive HercepTest is interpreted as negative for HER2 protein overexpression (0 and 1+ staining intensity), weakly positive (2+ staining intensity), and strongly positive (3+ staining intensity). HercepTest is not intended to provide prognostic information to the patient and physician and has not been validated for that purpose. For each staining run, slides should be examined in the order presented in Table 3 to determine the validity of the staining run and enable semi-quantitative assessment of the staining intensity of the sample tissue. ( ) P04087EFG_01_K / p. 18/152

19 Breast Cancer Table 3. Order of slide evaluation. Slide Reading Order Rationale 1. Control Slide containing the three cell lines Presence of 3+ brown cell membrane staining (rimming) in the 3+ Control Cell Line SK-BR-3, partial brown rimming in the 1+ Control Cell Line MDA-175, and no staining in the 0 Control Cell Line MDA-231 indicates a valid assay Punctate and discontinuous membrane staining is present in a small to moderate number of the cells in the weakly positive 1+ Control Cell Line MDA-175. Also dot-like immunostaining of the Golgi region of the cytoplasm can be observed in this cell line Presence of brown staining in the 0 Control Cell Line MDA-231 (negative for HER2 protein staining) indicates that there was non-specific staining during the assay. The assay results may be invalid due to overstaining 2. Positive Control Tissue Slide Presence of brown membrane staining should be observed. Staining of the cytoplasm and negative tissues should not be more than Negative Control Tissue Slide The ABSENCE of specific staining in the Negative Control Tissue Slide confirms the lack of kit cross-reactivity to cells/cellular components. If specific membrane staining occurs in the Negative Control Tissue Slide, results with the patient specimen should be considered invalid 4. Patient tissue slide stained using the Negative Control Reagent Absence of specific membrane staining verifies the specific labeling of the target antigen by the primary antibody Other tan or brown staining occurring in the cytoplasm of the specimen treated with the Negative Control Reagent, such as in connective tissue, leukocytes, erythrocytes, or necrotic tissue, should be considered non-specific background staining and should be reported under the comments section of the data spreadsheet 5. Patient tissue slide stained using the primary antibody When HER2 protein overexpression is detected in the specimen, it will appear as brown rimming localized on the cell membrane of tumor cells treated with the primary antibody 1. Control Slide (provided): The Control Slide stained with HercepTest should be examined first to ascertain that all reagents are functioning properly. The presence of a brown (3,3 - diaminobenzidine, DAB) reaction product at the cell membrane is indicative of positive reactivity. Presence of circumferential brown cell membrane staining (rimming) in the 3+ Control Cell Line SK-BR-3, partial brown rimming in the 1+ Control Cell Line MDA-175, and no staining in the 0 Control Cell Line MDA-231 indicates a valid assay. If any of the Control Cell Lines perform outside of these criteria, all results with the patient specimens should be considered invalid. 2. Positive Control Tissue: The Positive Control Tissue Slide should be examined next. This slide verifies that the fixation method and epitope retrieval process are effective. Use intact cells for interpretation of staining results because necrotic or degenerated cells often stain non-specifically (26). Staining should be observed in tumor tissue as brown, cell membrane staining. Brown staining of the cytoplasm and negative tissues within the specimen should not be more than corresponding to 1+ staining intensity score. 3. Negative Control Tissue: The Negative Control Tissue Slide should be examined after the Positive Control Tissue to verify the specificity of the labeling of the target antigen by the primary antibody. The absence of specific staining in the Negative Control Tissue confirms the lack of kit cross-reactivity to cells/cellular components. If specific staining occurs in the Negative Control Tissue, results with the patient specimen should be considered invalid. Alternatively, negative portions of the Positive Control Tissue may serve as the Negative Control Tissue, but this should be verified by the user. Note that a weak reaction (0-1+ staining intensity) can be observed in most normal epithelial tissue. Possible negative control tissues include: colon, liver and thyroid. ( ) P04087EFG_01_K / p. 19/152

20 Breast Cancer Non-specific staining, if present, will be of a diffuse appearance. Sporadic staining of connective tissue may also be observed in sections from excessively formalin-fixed tissues Patient Tissue: Examine patient specimens stained with HercepTest last. Positive staining intensity should be assessed within the context of any non-specific background staining of the Negative Control Reagent. As with any immunocytochemical test, a negative result means that the antigen was not detected, not that the antigen was absent in the cells/tissue assayed. Refer to Summary and Explanation, Limitations, and Performance Characteristics for specific information regarding HercepTest immunoreactivity. Additional Recommendations for Interpretation of HercepTest Staining Most metastatic breast carcinomas tested for HER2 protein overexpression are given a score of 0 or 3+. While the majority of these cases are clear-cut, a small percentage of the remaining 1+ and 2+ samples may be more difficult to interpret. Use the following guidelines for interpretation of HercepTest staining in your laboratory. Evaluate the Control Cell Lines to validate the assay performance. Evaluate the Positive and Negative Control Slides. A hematoxylin and eosin (H&E) staining of the tissue specimen is recommended for the first evaluation. (The tumor may not be obvious when looking at the sample stained with HercepTest. An H&E stained slide is required from the pathologist to verify the presence of the tumor.). The HercepTest TM should be performed on a paired section (serial section) from the same paraffin block of the specimen. Evaluate the sections stained for HER2 protein overexpression at low power first. The majority of positive cases will be obvious at low power magnification. Well-preserved and well-stained areas of the specimen should be used to make a determination of the percent positive tumor cells. In general, the score of cases should be obvious at low magnification. If determination between 1+/2+ borderline cases is difficult at low magnification, the score is usually 1+. To verify membrane staining, use 20-40x objective magnification. If a majority of tumor cells demonstrate complete membrane staining, the staining is either 2+ or 3+. Go to 20 40x objective magnification to confirm score. In a majority of the 3+ cases, at least 80% of the tumor cells are stained and the membrane staining is intense. If the specimen is near the cut off of 10% tumor cells positive, it is recommended that a minimum of 100 tumor cells be counted to determine the percentage of stained cells. If there is complete membrane staining at a weak to moderate intensity in greater than 10% of the tumor cells, the score of the specimen is 2+. This is usually accompanied by incomplete membrane staining of the majority of the remaining tumor cells. If less than 10% of the tumor cells have complete circumferential membrane staining, although other tumor cells may demonstrate an incomplete membrane staining, the score is 1+. If less than 10% of the tumor cells have complete or incomplete circumferential membrane staining, the score is 0. ( ) P04087EFG_01_K / p. 20/152

21 Breast Cancer Limitations - Breast General limitations 1. Immunocytochemistry is a multi-step diagnostic process that requires specialized training in the selection of the appropriate reagents; tissue selection, fixation, and processing; preparation of the immunocytochemistry slide; and interpretation of the staining results. 2. Tissue staining is dependent on the handling and processing of the tissue prior to staining. Improper fixation, freezing, thawing, washing, drying, heating, sectioning, or contamination with other tissues or fluids may produce artifacts, antibody trapping, or false-negative results. Inconsistent results may be due to variations in fixation and embedding methods, or to inherent irregularities within the tissue. 3. Excessive or incomplete counterstaining may compromise proper interpretation of results. 4. The clinical interpretation of any positive staining or its absence must be evaluated within the context of clinical presentation, morphology and other histopathological criteria. The clinical interpretation of any staining, or its absence, must be complemented by morphological studies and proper controls as well as other diagnostic tests. It is the responsibility of a qualified pathologist, who is familiar with the antibodies, reagents and methods used, to interpret the stained preparation. Staining must be performed in a certified, licensed laboratory under the supervision of a pathologist who is responsible for reviewing the stained slides and assuring the adequacy of positive and negative controls. 5. Tissues from persons infected with hepatitis B virus and containing hepatitis B surface antigen (HBsAg) may exhibit non-specific staining with horseradish peroxidase (27). 6. Reagents may demonstrate unexpected reactions in previously untested tissue types. The possibility of unexpected reactions even in tested tissue types cannot be completely eliminated due to biological variability of antigen expression in neoplasms, or other pathological tissues (28). Contact Dako s Technical Services with documented unexpected reaction. 7. False-positive results may be seen due to non-immunological binding of proteins or substrate reaction products. They may also be caused by pseudoperoxidase activity (erythrocytes) and endogenous peroxidase activity (cytochrome C) (28). 8. The staining procedure should be performed at ambient temperature of C. Product-specific limitations 1. The antigen present in the 1+ Control Cell Line MDA-175 is subject to degradation over time. Assess the Control Slide results in connection with the expiration date of the Control Slide. Negative staining of the MDA-175 cells may only indicate that the Control Slide has degraded. The Control Slides must be stored at 2-8 C. 2. False-negative results could be caused by degradation of the antigen in the tissues over time. Specimens should be stained within 4-6 weeks of mounting of tissues on slides when stored at room temperature (20-25 C) (29). 3. For optimal and reproducible results, the HER2 protein requires heat-induced epitope retrieval when tissues are routinely fixed (neutral buffered formalin or Bouin s fixative) and paraffin embedded. This pre-treatment needs to be completed at the beginning of the entire staining process. See the Specimen Preparation Section, Treatment of tissues prior to staining for instructions. 4. Heat-induced epitope retrieval of the HER2 protein should only be done using a calibrated water bath. Other methods of heating have been tested and do not give reproducible results. 5. Do not replace kit reagents with reagents carrying other lot numbers or with reagents from other manufacturers. The only exception is the Wash Buffer that may be replaced with Dako Wash Buffer, code S3006. ( ) P04087EFG_01_K / p. 21/152

22 Breast Cancer 6. False results could be obtained from evaluation of cytoplasmic staining. Consider only the intensity of cell membrane staining when interpreting results. 7. Stained Control Slides should be used only for validation of the staining run and should not be used as a guide to score the staining reaction in tissue sections. 8. Strong focal staining (3+), i.e. hot spots, may occasionally be seen. This may be the result of uneven fixation and/or processing of tissue. Immunostaining of a second tissue block from the same specimen is recommended. 9. Use of HercepTest on specimens fixed in fixatives other than neutral buffered formalin or Bouin s fixative has not been validated. 10. Normal epithelium in breast tissue should stain between 0 and 1+. If higher than 1+ staining of the normal epithelium is observed, the test should be repeated. Note that normal tonsil and esophageal epithelia may stain up to 2+ intensity. Performance Characteristics - Breast Background The clinical trial assay (CTA) used to identify eligible patients for the Herceptin clinical studies was for investigational use and is no longer available. The HercepTest was developed to provide a comparable alternative to the CTA. The safety and effectiveness of Herceptin were evaluated in a randomized controlled clinical trial and a large, open-labelled trial (See Herceptin package insert). All patients selected for the Herceptin clinical trials demonstrated overexpression of HER2 protein by immunocytochemistry testing performed with the CTA at a central laboratory. Patients were eligible for Herceptin treatment if their tumor had 2+ or 3+ levels of HER2 protein overexpression (based on a 0-3+ scale, where 3+ represented the highest level). Subgroup analysis of the results from these studies suggests that patients whose tissues are strongly positive (3+) for HER2 protein overexpression may benefit more from Herceptin than patients whose tissues are weakly positive (2+). The degree of HER2 protein overexpression is potentially an important predictor of the effect of Herceptin treatment. Because none of the patients in the Herceptin studies were selected using the HercepTest the correlation between the degree of positivity and the likelihood of clinical benefit from Herceptin treatment is unknown. Comparison studies Two studies were performed to characterize the HercepTest. 1) Comparison to the Clinical Trial Assay (CTA). 2) Accuracy when compared with five additional assays. Comparison to the Clinical Trial Assay (CTA) The HercepTest was compared to the CTA used to identify eligible patients for Herceptin therapy using 274 HER2 protein positive (2+ or 3+) and an equal number of HER2 protein negative breast cancer tissue specimens. Table 4 shows the results in a 2 x 2 diagram where 0 and 1+ were considered to be negative and 2+ and 3+ were positive. Table 4. A 2 x 2 concordance of the HercepTest to the Clinical Trial Assay (number of specimens). Clinical Trial Assay Positive Negative Total HercepTest Positive Negative Total Concordance: 79% (76 82%) 95% confidence interval. ( ) P04087EFG_01_K / p. 22/152

23 Breast Cancer The overall binary concordance of the HercepTest to the CTA was 79% (431/548), with a 2- sided 95% confidence interval of 76 82%. Twenty one per cent (21%) of the results were discordant between these two methods. The HercepTest results are reported on a 0-3+ scale interpreted as negative for HER2 protein overexpression (0 and 1+ staining intensity), weakly positive (2+ staining intensity), and strongly positive (3+ staining intensity). Table 5. A 3 x 3 concordance for HercepTest and Clinical Trial Assay. Clinical Trial Assay Total HercepTest Total This 3 x 3 presentation of the concordance study indicates that a 3+ reading on the HercepTest is highly likely to correspond with a positive result on the CTA, which would have met the entry criteria for the Herceptin trial (2+ or 3+). A finding of 2+ on HercepTest did not correlate as well with the CTA results. Approximately 42% (53/126) of HercepTest 2+ results were negative by CTA (0-1+) which would not have allowed entry into the Herceptin clinical trials. Accuracy HercepTest was also tested on 2 microscope slides containing paraffin-embedded tissue sections from 168 breast tumors. These tumors had been previously characterized by five different methods of determining HER2 gene amplification and overexpression of HER2 protein, including in-house Southern blot, fluorescence in situ hybridization (FISH) for amplification of DNA, Northern blot RNA analysis, Western blot, and immunocytochemistry (ICC) on frozen tissues (29). The results are presented in Table 6. Table 6. Comparison of HercepTest to combined results (OE) from gene amplification and HER2 protein overexpression tests. Reference OE Classification + - Total HercepTest Total Positive agreement: 43/69 = 62% Negative agreement: 99/99 = 100% The results indicated an 85% (142/168) level of agreement (95% confidence interval of 78-89%) between the positivity (2+ and 3+) and negativity (0 and 1+) staining intensity by the HercepTest. of the samples negative by the 5 different methods were positive by the HercepTest, whereas the combined results for the 5 different methods showed a higher number of positive cases. Reproducibility Intra-run reproducibility: Intra-run reproducibility was tested in one laboratory with 5 specimens of different ICC intensity staining scores. Each specimen was run in triplicate in a masked randomized format. This protocol was used with automated staining. All specimens gave 100% reproducible results. Inter-run reproducibility: Inter-run reproducibility was tested at three laboratories over 4 days with 5 specimens of different ICC intensity staining scores randomized and masked using automated methodology. Excellent reproducibility was seen for positive versus negative results (0 and 1+ versus 2+ and 3+) with the exception of two samples in one laboratory that varied between 1+ and 2+. There was 100% reproducibility for the 2+ and 3+ samples. ( ) P04087EFG_01_K / p. 23/152

24 Breast Cancer Inter-laboratory reproducibility: Inter-laboratory reproducibility was tested at three geographically separated laboratories with 40 identical randomized and masked specimens of various ICC staining intensity scores. Freshly cut slides were forwarded to each testing laboratory for automated staining and evaluation by a pathologist. Inter-laboratory percent agreement ranged from 83% to 90% for a dichotomous positive/negative determination where 0 and 1+ were negative and 2+ and 3+ were positive for HER2 protein overexpression. Compared to results obtained at the reference laboratory that had performed the CTA, 12.5% (15/120) comparative results were discrepant between negative (0 or 1+) and positive (2+ or 3+) determinations. An additional 10% (12/120) were discrepant between 2+ and 3+ scores. Immunoreactivity Table 7 summarizes HercepTest immunoreactivity with the recommended panel of normal tissues. All tissues were formalin fixed and paraffin embedded and stained with HercepTest according to the instructions in the package insert. Table 7. Summary of HercepTest normal tissue reactivity. Tissue Type (No. Tested) Positive Tissue Element Staining and Staining Pattern Adrenal (3) Bone marrow (3) Brain/Cerebellum (3) Brain/Cerebrum (3) Breast (3) Cervix uteri (3) Colon (3) Esophagus (3) Heart (3) Kidney (3) Liver (3) Lung (3) Mesothelial cells (3) Ovary (3) Pancreas (3) Parathyroid (3) Peripheral nerve (3) Pituitary (3) Prostate (3) Salivary gland (3) Skeletal muscle (3) Skin (3) Small intestine (3) Spleen (3) Stomach (3) Testis (3) Thymus (3) Thyroid (3) Tonsil (3) Uterus (3) Mammary gland (1 of 3 tissues, 1+ staining intensity) Tubules of renal medulla (3 of 3 tissues, 1 2+ in 5 50% of cells, cytoplasmic) Prostate gland/ducts (3 of 3 tissues, 1+ staining intensity, 50% of cells, cytoplasmic) Sweat glands (1 of 3 tissues, 1+, 30% of cells, cytoplasmic) Columnar epithelium, surface (1 of 3 tissues, 2+ staining intensity, 25% of cells) Epithelium (1 of 3 tissues, 1+ staining intensity, 25% of cells) Squamous epithelium (3 of 3 tissues, 1+ staining intensity, 80% of cells) Reported staining in all tissues was membrane, unless otherwise noted. All three specimens of each tissue type had the same staining intensity unless otherwise noted. ( ) P04087EFG_01_K / p. 24/152

25 Breast Cancer Troubleshooting - Breast Refer to the Troubleshooting section in Dako s previously referenced Handbook (19) for remedial action, or contact Dako s Technical Service Department to report unusual staining. Problem Probable Cause Suggested Action 1. No staining of slides 2. Weak staining of slides 1a. Programming error. Reagents not used in proper order 1b. Reagent vials were not loaded in the correct locations in the reagent racks 1c. Insufficient reagent in reagent vial 1a. Check programming grid to verify that the staining run was programmed correctly 1b. Check the Reagent Map to verify the proper location of reagent vials 1c. Ensure that enough reagent is loaded into the reagent vials prior to commencing the run. Refer to Reagent Map for volumes required 1d. Sodium azide in Wash Solution 1d. Use fresh preparation of Wash Buffer provided in the kit 1e. Excessive heating of mounted tissue sections prior to deparaffinization and heatinduced antigen retrieval may lead to loss of visible HER2 immunoreactivity. 1e. Air dry the tissue sections at room temperature for a minimum of 12 hours or until dry. Alternatively, dry at 37 C overnight or dry at 60 C for a maximum of one hour. Drying of tissue sections at elevated temperatures must only be performed in a calibrated oven with uniform heat distribution (17). 2a. Inadequate epitope retrieval 2a. Verify that Epitope Retrieval Solution reaches C for a full 40 minutes and is allowed to cool for an additional 20 minutes 2b. Inadequate reagent incubation times 2c. Inappropriate fixation method used 2b. Review Staining Procedure instructions 2c. Ensure that patient tissue is not over-fixed or that an alternative fixative was not used 2d. Excessive heating of mounted tissue sections prior to deparaffinization and heatinduced antigen retrieval may cause a significant decrease in visible HER2 immunoreactivity 2e. Insufficient reagent volume applied 2d. Air dry the tissue sections at room temperature for a minimum of 12 hours or until dry. Alternatively, dry at 37 C overnight or dry at 60 C for a maximum of one hour. Drying of tissue sections at elevated temperatures must only be performed in a calibrated oven with uniform heat distribution (17). 2e. Check size of tissue section (22 mm x 22 mm) and reagent volume applied ( ) P04087EFG_01_K / p. 25/152

26 Breast Cancer 3. Excessive background staining of slides 4. Tissue detaches from slides 5. Excessively strong specific staining 6. Weak staining of the 1+ Control Slide Cell Line 3a. Paraffin incompletely removed 3a. Use fresh clearing solutions and follow procedure as outlined in Section B.1 3b. Starch additives used in mounting sections to slides 3b. Avoid using starch additives for adhering sections to glass slides. Many additives are immunoreactive 3c. Slides not thoroughly rinsed 3c. Ensure that the Autostainer is properly primed prior to running. Check to make sure that adequate buffer is provided for entire run. Use fresh solutions of buffers and washes 3d. Sections dried during staining procedure 3e. Sections dried while loading the Autostainer 3f. Inappropriate fixation method used 3g. Non-specific binding of reagents to tissue 3d. Verify that the appropriate volume of reagent is applied to slides. Make sure the Autostainer is run with the hood in the closed position and is not exposed to excessive heat or drafts 3e. Ensure sections remain wet with buffer while loading and prior to initiating run 3f. Ensure that approved fixative was used. Alternative fixative may cause excessive background staining 3g. Check fixation method of the specimen and presence of necrosis 4a. Use of incorrect slides 4a. Use silanized slides, such as Dako Silanized Slides, Code S3003, SuperFrost Plus or poly- L-lysine coated slides 5a. Inappropriate fixation method used 5b. Use of improper heat source for epitope retrieval, e.g. steamer, microwave oven or autoclave 5c. Reagent incubation times too long 5d. Inappropriate wash solution used 6a. Incorrect epitope retrieval protocol followed 6b. Lack of reaction with Substrate- Chromogen Solution (DAB) 5a Ensure that only approved fixatives and fixation methods are used 5b. Ensure that only a water bath is used for the epitope retrieval step 5c. Review Staining Procedure instructions 5d. Use only the Wash Buffer that is recommended for the kit 6a. Immerse the slides in the preheated Epitope Retrieval Solution. Bring temperature of the Epitope Retrieval Solution back to C and pre-treat for a full 40 minutes 6b. Ensure that the full 10-minute incubation time is used. Ensure that only one drop of DAB Chromogen was added to 1 ml of DAB Buffered Substrate ( ) P04087EFG_01_K / p. 26/152

27 Breast Cancer 7. Epitope Retrieval Solution is cloudy in appearance when heated 8. Epitope Retrieval Solution is cloudy in appearance when stored (prior to heating) 6c. Degradation of Control Slide 6c. Check kit expiration date and kit storage conditions on outside of package 7. When heated the solution turns cloudy in appearance 8. The solution has been incorrectly stored or the expiration date of the solution has passed 7. This is normal and does not influence the staining 8. Check kit expiration date and kit storage conditions on outside of package. Discard the epitope retrieval solution NOTE: If the problem cannot be attributed to any of the above causes, or if the suggested corrective action fails to resolve the problem, please call Dako s Technical Services for further assistance. Additional information on staining techniques and specimen preparation can be found in Dako s previously referenced Handbook (19) (available from Dako), Atlas of Immunohistology (30) and Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04087EFG_01_K / p. 27/152

28 Gastric Cancer Summary and Explanation - Gastric Background The human HER2 gene (also known as ERBB2 or NEU) encodes a protein often referred to as HER2 protein or p185 HER2. The HER2 protein is a membrane receptor tyrosine kinase with homology to the epidermal growth factor receptor (EGFR or HER1) (1-8). The HER2 protein is a normal component expressed by a variety of epithelial cell types (8). Overexpression of the HER2 protein and amplification of the HER2 gene in gastric cancer have been shown in a large number of studies (32). HER2 positivity can be detected in approximately 20% of the patients by either IHC or FISH (32). Preclinical in vitro and in vivo studies have demonstrated that trastuzumab (Herceptin ) is effective in different gastric cancer models thus leading to the initiation of several clinical studies (32-36). In a phase III study BO18255, the ToGA trial, HER2-positive patients with inoperable locally advanced, recurrent and/or metastatic adenocarcinoma of the stomach or gastrooesophageal junction were randomized to receive 5-FU or capecitabine and cisplatin either alone or in combination with trastuzumab. A statistically significant gain in overall survival (OS) was seen in the patients that received the combined treatment of trastuzumab and chemotherapy (37, 38). Trastuzumab is a humanized monoclonal antibody that binds with high affinity to the HER2 protein and has been shown to inhibit the proliferation of human tumor cells that overexpress HER2 protein in vitro and in vivo (33-36). Characteristics 3803 patients have been screened for HER2 status for enrolment in the ToGA study. In this study both HER2 protein overexpression by IHC (HercepTest, Dako) and HER2 gene amplification by FISH (HER2 FISH pharmdx, Dako) were measured. Valid test results were obtained in 3665 samples with either IHC or FISH tests and in 3280 samples with both tests. The results from the ToGA study showed that 22.1% of the patients with advanced gastric cancer were HER2-positive as determined either by IHC or FISH as per definition of the ToGA HER2 selection criteria (38). With respect to the use of the HercepTest in the assessment of patients for whom trastuzumab treatment is being considered, please see the package insert for Herceptin for more information. Principle of Procedure - Gastric The HercepTest contains reagents required to complete a two-step immuno-cytochemical staining procedure for routinely processed, paraffin-embedded specimens. Following incubation with the primary rabbit antibody to human HER2 protein, this kit employs a ready-to-use Visualization Reagent based on dextran technology. This reagent consists of both secondary goat anti-rabbit immunoglobulin molecules and horseradish peroxidase molecules linked to a common dextran polymer backbone, thus eliminating the need for sequential application of link antibody and peroxidase-conjugated antibody. Cross-reaction of the Visualization Reagent with human immunoglobulins and fetal calf serum has been removed by solid-phase absorption. The enzymatic conversion of the subsequently added chromogen results in formation of a visible reaction product at the antigen site. The specimen may then be counterstained and coverslipped. Results are interpreted using a light microscope. Control Slides containing three formalin-fixed, paraffin-embedded human breast cancer cell lines with staining intensity scores of 0, 1+, and 3+ are provided to validate staining runs. The staining intensity of these cell lines has been correlated to the number of receptors per cell. HercepTest, Code K5207, is applicable for automated staining using the Autostainer. ( ) P04087EFG_01_K / p. 28/152

29 Reagents - Gastric Gastric Cancer Materials provided The materials listed below are sufficient for 50 tests (50 slides incubated with Primary Antibody to HER2 Protein and 50 slides incubated with the corresponding Negative Control Reagent). The number of tests is based on the use of 200 µl per tissue section (22 mm x 22 mm) of vials Nos. 1, 2, 3 and 4, and of the Substrate-Chromogen Solution (DAB). The kit provides materials sufficient for a maximum of 15 individual staining runs. Vial No. Quantity Description 1 2 x 11 ml 2 1 x 12 ml 3 2 x 11 ml 4 1 x 12 ml 5 15 x 11 ml 6 3 x 3 ml 7 3 x 500 ml 8 2 x 1 L 3 x 5 slides Peroxidase-Blocking Reagent: 3% hydrogen peroxide containing 15 mmol/l sodium azide (NaN 3 ). Rabbit Anti-Human HER2 Protein: Ready-to-use affinity-isolated antibody. Supplied in 0.05 mol/l Tris/HCl, 0.1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7.2, containing stabilizing protein. Immunogen: Synthetic C-terminal fragment (intracytoplasmic part) of the HER2 protein coupled to keyhole limpet hemocyanin. Specificity: HER2 protein. Purification method: The antibody is affinity isolated by using an immobilized HER2 protein peptide. Visualization Reagent: Dextran polymer conjugated with horseradish peroxidase and affinity-isolated goat anti-rabbit immunoglobulins. Supplied in Tris/HCl buffer containing stabilizing protein and an antimicrobial agent. Negative Control Reagent: Immunoglobulin fraction of normal rabbit serum at an equivalent protein concentration as the antibody to HER2 protein. Supplied in 0.05 mol/l Tris/HCl, 0.1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7.2, containing stabilizing protein. DAB Buffered Substrate: Substrate buffer solution, ph 7.5, containing <0.1% hydrogen peroxide, stabilizers, enhancers, and an antimicrobial agent. DAB Chromogen: 5% 3,3 -diaminobenzidine tetrahydrochloride chromogen solution. Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): 0.1 mol/l citrate buffer with a detergent. Wash Buffer (10x): Tris/HCl buffer with a detergent and an antimicrobial agent. Control Slides: Each slide contains sections of three formalinfixed, paraffin-embedded breast carcinoma cell lines representing different levels of HER2 protein expression: MDA-231 (0), MDA- ( ) P04087EFG_01_K / p. 29/152

30 Gastric Cancer 175 (1+), and SK-BR-3 (3+). The Control Slides have been heat treated for better adherence of sections to glass slides. Any additional heat treatment of Control Slides performed to improve the adherence of sections to glass slides may compromise staining results. NOTE: All reagents, including Epitope Retrieval Solution and Wash Buffer, are formulated specifically for use with this test. For the test to perform as specified, no substitutions should be made except for the Wash Buffer, where Dako Code S3006 may be used. Materials required but not provided Ammonium hydroxide, 15 mol/l diluted to 37 mmol/l Counterstain: Hematoxylin, such as water-based Mayer's Hematoxylin, Dako Code S3301 (see INSTRUCTIONS FOR USE, A.4) Coverslips Distilled or deionized water (Washing Water) Drying oven, capable of maintaining 60 C or less Ethanol, absolute and 95% Light microscope (4-40x objective magnification) Mounting medium, such as Dako Faramount, Code S3025, or Glycergel, Code C0563 Positive and Negative Tissues to use as process controls (see Quality Control Section) Slides, SuperFrost Plus, poly-l-lysine-coated slides, or Dako Silanized Slides, Code S3003, (see Specimen Preparation) Staining jars or baths Timer (capable of 2-40 minute intervals) Water bath with lid (capable of maintaining Epitope Retrieval Solution at C) Xylene, toluene, or xylene substitutes K5207 has been tailored for use with the Autostainer Immunostaining System, Code S3400. Please refer to the Autostainer User Guide for necessary Autostainer Components. Storage - Gastric Store at 2-8 C. Do not use the kit after the expiration date stamped on the outside package. If reagents are stored under any conditions other than those specified in this package insert, they must be validated by the user (14a, 14b). Note that Control Slides must also be stored at 2-8 C. There are no obvious signs to indicate instability of this product. Therefore, Positive and Negative Controls should be run simultaneously with patient specimens. If unexpected staining is observed, which cannot be explained by variations in laboratory procedures, and a problem with HercepTest is suspected, immediately contact Dako s Technical Services. Specimen Preparation - Gastric Adenocarcinoma specimens of the stomach, including gastroesophageal junction from biopsies, excisions, or resections must be handled correctly to preserve the tissue for immunocytochemical staining. Standard methods of tissue processing should be used for all specimens (15). When testing small biopsy specimens, ascertain intact tumor ( ) P04087EFG_01_K / p. 30/152

31 Gastric Cancer morphology and the presence of sufficient tumor cells for IHC evaluation. If HercepTest analysis is performed on a biopsy specimen, multiple (7-8) evaluable biopsy specimens from different regions of the tumor should be analysed to ensure reliable determination of HER2 status. Paraffin-embedded sections Tissues preserved in neutral buffered formalin and paraffin embedding are suitable for use. Specimens should e.g. be cut into blocks of a thickness of 3 or 4 mm and fixed for hours in neutral-buffered formalin. Biopsy specimens were fixed for 6-8 hours in the ToGA trial (for study reference, refer to (37)). The tissues are then dehydrated in a series of alcohols and xylene, followed by infiltration by melted paraffin held at no more than 60 C. Properly fixed and embedded tissues expressing the HER2 protein will keep indefinitely prior to sectioning and slide mounting if stored in a cool place (15-25 C) (15, 16). In the USA, the Clinical Laboratory Improvement Act of 1988 requires in 42 CFR (b) that The laboratory must retain stained slides at least ten years from the date of examination and retain specimen blocks at least two years from the date of examination (16). Tissue specimens should be cut into sections of 4-5 µm, mounted onto slides and air-dried at room temperature for a minimum of 12 hours (or until dry) or at 37 C overnight or at 60 C for one hour. CAUTION: Excessive heating for more than one hour at 60 C may cause a significant decrease or loss of the specific membrane-associated HER2 immunoreactivity (17). To preserve antigenicity, tissue sections mounted onto slides (SuperFrost Plus, poly-l-lysine or silanized slides) should be stained within 4-6 weeks of sectioning when stored at room temperature (20-25 C) (18). The slides required fo r HER2 protein evaluation and verification of tumor presence should be prepared at the same time. A minimum of 5 slides is recommended, 1 slide for tumor presence, 2 slides for HER2 protein evaluation (1 for incubation with vial No. 2 and 1 for incubation with vial No. 4), and 2 slides for back-up. The use of HercepTest TM on decalcified tissues has not been validated and is not recommended. Consult Dako s Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19) and references 15 and 16 for further details on specimen preparation. Treatment of tissues prior to staining A specific epitope retrieval method in 10 mmol/l citrate buffer, must be used for optimal assay performance. The Epitope Retrieval Solution is supplied in the HercepTest kit. This method involves heating of tissue sections mounted on slides that are immersed in 10 mmol/l citrate buffer (20) in a calibrated water bath capable of maintaining the Epitope Retrieval Solution at the required temperature (95-99 C). Laboratories l ocated at higher elevations should determine the best method of maintaining the required water bath temperature. The epitope retrieval must be performed in a water bath. Other methods of heating have been tested and do not give reproducible results. Immediately after epitope retrieval, commence the staining procedure. Deviation from the described procedure may affect results. ( ) P04087EFG_01_K / p. 31/152

32 Gastric Cancer Precautions - Gastric 1. For in vitro diagnostic use. 2. For professional users. 3. Vial 1, Peroxidase-Blocking Reagent, contains 3% hydrogen peroxide. Safety data sheet available for professional users on request. 4. Vial 6, DAB Chromogen, contains 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride and is labeled: H350 H341 P201 P280 Danger P308 + P313 P405 P501 May cause cancer. Suspected of causing genetic defects. Obtain special instructions before use. Wear protective gloves. Wear eye or face protection. Wear protective clothing. IF exposed or concerned: Get medical attention. Store locked up. Dispose of contents and container in accordance with all local, regional, national and international regulations. As a general rule, persons under 18 years of age are not allowed to work with this product. Users must be carefully instructed in the proper work procedure, the dangerous properties of the product and the necessary safety instructions. Please refer to the Safety Data Sheet (SDS) for additional information. 5. Vial 8, Wash Buffer (10x), contains 5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride, and 0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane. May produce an allergic reaction. The Wash Buffer (10x) is labeled: Warning H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Causes serious eye irritation. Wear eye or face protection. Wash hands thoroughly after handling. IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. 6. This product contains sodium azide (NaN 3 ), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though not classified as hazardous, sodium azide may react w i th lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups of metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent metal azide build-up in plumbing (21, 22). 7. Vial 2, 3 and 4 contain material of animal origin. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used. 8. Control slides and specimens, before and after fixation, and all materials exposed to them, should be handled as if capable of transmitting infection, and disposed of with proper precautions (23). Never pipette reagents by mouth and avoid contacting the skin and mucous membranes with reagents and specimens. If reagents come in contact with sensitive areas, wash with copious amounts of water. 9. Minimize microbial contamination of reagents to avoid non-specific staining. ( ) P04087EFG_01_K / p. 32/152

33 Gastric Cancer 10. Incubation times, temperatures, or methods other than those specified may give erroneous results. Excess drying at 60 C for more than one hour may cause a significan t decrease or loss of the specific membrane-associated HER2 immunoreactivity (17). 11. Reagents have been optimally diluted. Further dilution may result in loss of antigen staining. 12. All reagents, including Epitope Retrieval Solution and Wash Buffer, are formulated specifically for use with this test. In order for the test to perform as specified, no substitutions should be made except for the Wash Buffer, where Code S3006 may be used. 13. The Visualization Reagent and DAB Chromogen may be affected adversely if exposed to excessive light levels. Do not store system components or perform staining in strong light, such as direct sunlight. 14. Wear appropriate personal protective equipment to avoid contact with eyes and skin. Refer to the Safety Data Sheet (SDS) for additional information. 15. Paraffin residuals may lead to false negative results. 16. For accurate interpretation of HercepTest results on stained biopsy samples from adenocarcinoma of the stomach, including gastroesophageal junction, a cluster of at least 5 stained tumor cells is recommended. A cluster of at least 5 stained tumor cells consists of 5 connected HER2 stained tumor cells. 17. Due to the heterogeneous nature of gastric cancer biopsy specimens it is important to perform HER2 IHC testing on multiple pieces (7-8) of biopsy from different regions of the tumor to obtain a reliable result. 18. Use of reagent volumes other than recommended may result in loss of visible HER2 immunoreactivity. Tissue sections larger than 22 mm x 22 mm will require 2-3x 200 µl of reagent applied in 2-3 automated application areas. 19. It is recommended to test more than one tissue block of gastric cancer resections when the specimen exhibits a high level of heterogeneity (41). INSTRUCTIONS FOR USE - Gastric A. Reagent Preparation It is convenient to prepare the following reagents prior to staining: A.1 Epitope Retrieval Solution Dilute a sufficient quantity of Vial 7 (Epitope Retrieval Solution 10x) 1:10 using distilled or deionized water for the staining procedure that is planned. Unused diluted solution may be stored at 2-8 C for one month. Discard diluted sol ution if cloudy in appearance. A.2 Wash Buffer Dilute a sufficient quantity of Vial 8 (Wash Buffer 10x) 1:10 using distilled or deionized water for the wash steps. Unused diluted buffer may be stored at 2-8 C for o ne month. Discard buffer if cloudy in appearance. The Autostainer is programmed to rinse tissue sections after the Peroxidase-Blocking Reagent and Substrate-Chromogen Solution. Note that for these rinse steps either distilled (or deionized) water or Wash Buffer may be used. All other rinse steps require the use of Wash Buffer. A.3 Substrate-Chromogen Solution (DAB) Prepare Substrate-Chromogen Solution by adding 11 drops (25-30 µl per drop) of DAB Chromogen from Vial 6 to one Vial 5 containing DAB Buffered Substrate (11 ml) and mix. Prepared Substrate-Chromogen Solution (DAB) is stable for approximately 5 days when stored at 2-8 C. This solution should be mixed thoroughly prior to use. Any precipitate developing in the solution does not affect staining quality. ( ) P04087EFG_01_K / p. 33/152

34 Gastric Cancer NOTE: The color of the DAB Chromogen in Vial 6 may vary from clear to light lavender-brown. This will not affect the performance of this product. Please dilute according to the guidelines in this package insert. Addition of excess DAB Chromogen to the DAB Buffered Substrate will result in deterioration of the positive signal. A.4 Counterstain The colored end-product of the DAB staining reaction is alcohol and water insoluble. Use a hematoxylin counterstain and adjust the hematoxylin staining intensity to a similar level shown in Dako s HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer. Hematoxylin, either alcohol or water-based, such as Dako Mayer's Hematoxylin, Code S3301, may be used. Follow hematoxylin counterstaining with a thorough rinse in distilled or deionized water, then immerse tissue slides into a bath of 37 mmol/l ammonia water (see Section B.2, Step 3). Ammonia water (37 mmol/l) is prepared by mixing 2.5 ml of 15 mol/l (concentrated) ammonium hydroxide with 1 liter of distilled or deionized water. Unused 37 mmol/l ammonia water may be stored at room temperature (20-25 C) in a tightly capped bottle for up to 12 months. A.5 Mounting Medium Non-aqueous, permanent mounting medium is recommended. However, aqueous mounting is also acceptable. Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use, Code S3025, or Glycergel Mounting Medium, Code C0563, is recommended for aqueous mounting. Liquefy Glycergel by warming to approximately 40 (± 5) C prior to use. B. Staining Procedure Performed on the Autostainer B.1 Procedural notes The user should read these instructions carefully and become familiar with all components and instrumentation prior to use (see Precautions). All reagents should be equilibrated to room temperature (20-25 C) prior to immunostaining. Likewise, all incubations should be performed at room temperature. Do not allow tissue sections to dry while loading slides on the Autostainer and during the staining procedure. Dried tissue sections may display increased non-specific staining. If the staining procedure is interrupted, slides may be kept in a buffer bath following incubation of the primary antibody for up to one hour at room temperature (20-25 C) without affecting the staining performance. Deparaffinization and rehydration: Prior to staining, tissue slides must be deparaffinized to remove embedding medium and rehydrated. Avoid incomplete removal of paraffin. Residual embedding medium will result in increased non-specific staining. This step should be performed at room temperature (20-25 C). 1. Place slides in a xylene bath and incubate for 5 (±1) minutes. Change baths and repeat once. 2. Tap off excess liquid and place slides in absolute ethanol for 3 (±1) minutes. Change baths and repeat once. 3. Tap off excess liquid and place slides in 95% ethanol for 3 (±1) minutes. Change baths and repeat once. 4. Tap off excess liquid and place slides in distilled or deionized water for a minimum of 30 seconds. Commence staining procedure as outlined in Section B.2, Step 1, Epitope retrieval. Xylene and alcohol solutions should be changed after 40 slides. Toluene or xylene substitutes, such as Histoclear, may be used in place of xylene. NOTE: The reagents and instructions supplied in this kit have been designed for optimal performance. Further dilution of the reagents or alteration of incubation temperatures may give ( ) P04087EFG_01_K / p. 34/152

35 Gastric Cancer erroneous or discordant results. Differences in tissue processing and technical procedures in the user s laboratory may invalidate the assay results for use in selecting patients for Herceptin therapy. B.2 Staining protocol Performed at room temperature, C. Step 1: Epitope retrieval Fill staining jars, e.g. Coplin jars, with the diluted Epitope Retrieval Solution (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.1). Place staining jars containing Epitope Retrieval Solution in water bath. Heat water bath and the Epitope Retrieval Solution to C. Upon heating the Epitope Retrieval Solution becomes cloudy in appearance. Cover jars with lids to stabilize the temperature and avoid evaporation. Immerse the room temperature deparaffinized sections in the preheated Epitope Retrieval Solution in the staining jars. BRING TEMPERATURE OF THE WATER BATH AND THE EPITOPE RETRIEVAL SOLUTION BACK TO C. Incubate for 40 (±1) minutes at C. Remove the entire jar with slides from the water bath. Allow the slides to cool in the Epitope Retrieval Solution for 20 (±1) minutes at room temperature. Decant the Epitope Retrieval Solution and rinse sections in the Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.2). For optimal performance, soak sections in Wash Buffer for 5-20 minutes after epitope retrieval and prior to staining. NOTE: The Epitope Retrieval Solution is designed for single use application only. Do not re-use. Step 2: Autostainer procedure 1. Use the Autostainer-generated map on the HercepTest autoprogram for required program times and reagent volumes (see point 4 below for specific volumes). 2. Place the Autostainer reagent vials in the Autostainer reagent rack according to the computer-generated reagent map. 3. Load the slides onto the Autostainer according to the computer- generated slide map. 4. Set Program and begin the HercepTest program. The following is an outline of the program run: Rinse 200 µl Peroxidase-Blocking Reagent - 5 minutes Rinse 200 µl Primary Anti-HER2 Protein (or Negative Control Reagent) - 30 minutes Rinse 200 µl Visualization Reagent - 30 minutes Rinse Rinse Switch 200 µl Substrate-Chromogen Solution (DAB) - 10 minutes Rinse slides in deionized water after the substrate-chromogen step ( ) P04087EFG_01_K / p. 35/152

36 Gastric Cancer NOTE: Autostainer Hardware version 01 rinses slides in buffer. Therefore, the slides must be rinsed with deionized water after they have been removed from the Autostainer. Step 3: Counterstain (instructions are for hematoxylin) Remove slides from the Autostainer and counterstain in hematoxylin as described below. Immerse slides in a bath of hematoxylin. Incubate for 2 5 minutes, depending on the strength of hematoxylin used. Rinse gently in a distilled or deionized water bath. Ensure all residual hematoxylin has been cleared. Optional: Dip slides 10 times into a bath of 37 mmol/l ammonia water (see Section A.4). Rinse slides gently in a bath of distilled or deionized water for 2-5 minutes. NOTE: Depending on the incubation length and potency of the hematoxylin used, counterstaining will result in a pale to dark blue coloration of the cell nuclei. Excessive or incomplete counterstaining may compromise proper interpretation of results. Step 4: Mounting Non-aqueous, permanent mounting medium is recommended. Otherwise, aqueous mounting medium is also acceptable. Specimens may be mounted and coverslipped with a water-based mounting medium such as Dako Faramount, Code S3025, or Glycergel, Code C0563. NOTE: Slides may be read when convenient. However, some fading may occur if slides are coverslipped with an aqueous mounting medium and exposed to strong light over a period of one week. To minimize fading, store slides in the dark at room temperature (20-25 C). Quality Control - Gastric Differences in tissue fixation, processing and embedding in the user s laboratory may produce significant variability in results, necessitating regular performance of in-house controls in addition to the Control Slides supplied by Dako. In the USA, consult the quality control guidelines of the College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry, see also CLSI (formerly NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24), and reference 25 for additional information. Table 8. The purpose of daily quality control. Tissue: Fixed and Processed Like Patient Sample Positive Control: Tissue or cells containing target antigen to be detected (could be located in patient tissue). The ideal control is weakly positive staining tissue as this is most sensitive to antibody or antigen degradation Specific Antibody and Secondary Antibody Controls all steps of the analysis. Validates reagent and procedures used for HER2 protein staining Non-Specific Antibody* or Buffer Plus Same Secondary Antibody as Used with Specific Antibody Detection of non-specific background staining Negative Control: Tissues or cells expected to be negative (could be located in patient tissue or positive control tissue) Detection of unintended antibody crossreactivity to cells/cellular components Detection of non-specific background staining Patient tissue Detection of specific staining Detection of non-specific background staining Control Slide supplied by Dako Controls staining procedure only ( ) P04087EFG_01_K / p. 36/152

37 Gastric Cancer * Serum from same species as the specific antibody, but not directed against the same target antigen. To detect non-specific antibody binding, e.g. binding of Fc portion of antibody by the tissue. Control Slide (provided): Each of the supplied Control Slides contains three pelleted, formalin-fixed, paraffin-embedded human breast cancer cell lines with staining intensity scores of 0, 1+ and 3+. One slide should be stained in each staining run. The evaluation of the Control Slide cell lines supplied by Dako indicates the validity of the staining run. Positive Control Tissue: Controls should be fresh autopsy/biopsy/surgical specimens fixed, processed and embedded as soon as possible in the same manner as the patient sample(s). Positive tissue controls are indicative of correctly prepared tissues and proper staining techniques. One Positive Control Tissue for each set of test conditions should be included in each staining run. The Positive Control Tissues should give weak positive staining so they can detect subtle changes in the primary antibody sensitivity. The Control Slides supplied with this kit or specimens processed differently from the patient sample(s) validate reagent performance only and do not verify tissue preparation. Use previously determined HER2 protein 2+ overexpressing tissue from adenocarcinoma of the stomach, including gastroesophageal junction for the ideal Positive Control Tissue. NOTE: Known positive control tissue should only be utilized for monitoring the correct performance of processed tissues and test reagents, NOT as an aid in formulating a specific diagnosis of patient samples. If the Positive Control Tissue fails to demonstrate appropriate positive staining, results with the patient specimens should be considered invalid. Negative Control Tissue: Use a negative control tissue (known to be HER2 protein negative) fixed, processed and embedded in a manner identical to the patient sample(s) with each staining run to verify the specificity of the primary antibody and to provide an indication of specific background staining. Colon, liver or thyroid are appropriate for negative control tissue. The variety of different cell types present in most tissue sections offers internal negative control sites (this should be verified by the user). If specific staining occurs in the Negative Control Tissue, results with the patient specimens should be considered invalid and the test re-run. Non-Specific Negative Control Reagent: Use the supplied Negative Control Reagent in place of the primary antibody with a section of each patient specimen to evaluate non-specific staining and allow better interpretation of specific staining at the antigen site. The incubation period for the Negative Control Reagent should correspond to that of the primary antibody. Assay verification: Prior to initial use of an antibody or staining system in a diagnostic procedure, the user should verify the antibody's specificity by testing it on a series of in-house tissues with known immunocytochemical performance characteristics representing known positive and negative tissues. Refer to the quality control procedures previously outlined in this section of the product insert and to the quality control requirements of the CAP Certification Program for Immunohistochemistry and/or CLSI (formerly NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24). These quality control procedures should be repeated for each new antibody lot, or whenever there is a change in assay parameters. Adenocarcinomas of the stomach, including gastroesophageal junction, with known HER2 protein staining intensities from 0-3+ and negative tissues, e.g. colon, liver or thyroid are suitable for assay verification. ( ) P04087EFG_01_K / p. 37/152

38 Gastric Cancer Interpretation of Staining - Gastric For determination of HER2 protein expression, only the membrane staining intensity and pattern should be evaluated using the scale presented in Table 9. Slide evaluation should be performed by a pathologist using a light microscope. For evaluation of the immunohistochemical staining and scoring, an objective of 10X magnification is appropriate. The use of a 5-40X objective magnification is useful in confirmation of the score. Cytoplasmic staining should be considered non-specific staining and is not to be included in the assessment of membrane staining intensity (8). To aid in the differentiation of 0, 1+, 2+ and 3+ staining, refer to Dako s HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer for representative pictures of the staining intensities and patterns. Only specimens from patients with adenocarcinoma of the stomach, including gastroesophageal junction, should be scored. In cases with intestinal metaplasia and gastric adenocarcinoma in the same specimen, only the gastric adenocarcinoma component should be scored. For interpretation of HercepTest stained biopsies a cluster of at least 5 stained tumor cells is recommended. A cluster of at least 5 stained tumor cells consists of 5 connected HER2 stained tumor cells. Table 9. Interpretation and scoring of HER2 immunohistochemical staining Score Surgical Specimen Staining Pattern Biopsy Specimen Staining Pattern HER2 Overexpression Assessment 0 No reactivity or membranous reactivity in < 10% of tumor cells No reactivity or no membranous reactivity in any (or < 5 clustered) tumor cell Negative 1+ Faint/barely perceptible membranous reactivity in 10% of tumor cells; cells are reactive only in part of their membrane Tumor cell cluster ( 5 cells) with a faint/barely perceptible membranous reactivity irrespective of percentage of tumor cells stained Negative 2+ Weak to moderate complete, basolateral or lateral membranous reactivity in 10% of tumor cells Tumor cell cluster ( 5 cells) with a weak to moderate complete, basolateral or lateral membranous reactivity irrespective of percentage of tumor cells stained Equivocal 3+ Strong complete, basolateral or lateral membranous reactivity in 10% of tumor cells Tumor cell cluster ( 5 cells) with a strong complete, basolateral or lateral membranous reactivity irrespective of percentage of tumor cells stained Positive Guidelines based on Hofmann et al. (40). HercepTest is interpreted as negative for HER2 protein overexpression (0 and 1+ score), equivocal (2+ score), and positive (3+ score). HercepTest is not intended to provide prognostic information to the patient and physician and has not been validated for that purpose. For each staining run, slides should be examined in the order presented in Table 10 to determine the validity of the staining run and enable semi-quantitative assessment of the staining intensity of the sample tissue. ( ) P04087EFG_01_K / p. 38/152

39 Gastric Cancer Table 10. Order of slide evaluation. Slide Reading Order Rationale 1. Control Slide containing the three cell lines Presence of 3+ brown cell membrane staining (rimming) in the 3+ Control Cell Line SK-BR-3, partial brown rimming in the 1+ Control Cell Line MDA-175, and no staining in the 0 Control Cell Line MDA-231 indicates a valid assay Punctate and discontinuous membrane staining is present in a small to moderate number of the cells in the weakly positive 1+ Control Cell Line MDA-175. Also dot-like immunostaining of the Golgi region of the cytoplasm can be observed in this cell line Presence of brown staining in the 0 Control Cell Line MDA-231 (negative for HER2 protein staining) indicates that there was non-specific staining during the assay. The assay results may be invalid due to overstaining 2. Positive Control Tissue Slide Presence of brown membrane staining should be observed. Staining of the cytoplasm and negative tissues should not be more than Negative Control Tissue Slide The ABSENCE of specific staining in the Negative Control Tissue Slide confirms the lack of kit cross-reactivity to cells/cellular components. If specific membrane staining occurs in the Negative Control Tissue Slide, results with the patient specimen should be considered invalid 4. Patient tissue slide stained using the Negative Control Reagent 5. Patient tissue slide stained using the primary antibody Absence of specific membrane staining verifies the specific labeling of the target antigen by the primary antibody Other tan or brown staining occurring in the cytoplasm of the specimen treated with the Negative Control Reagent, such as in connective tissue, leukocytes, erythrocytes, or necrotic tissue, should be considered non-specific background staining and should be reported under the comments section of the data spreadsheet When HER2 protein overexpression is detected in the specimen, it will appear as brown rimming localized on the cell membrane of tumor cells treated with the primary antibody 1. Control Slide (provided): The Control Slide stained with HercepTest should be examined first to ascertain that all reagents are functioning properly. The presence of a brown (3,3 -diaminobenzidine, DAB) reaction product at the cell membrane is indicative of positive reactivity. Presence of circumferential brown cell membrane staining (rimming) in the 3+ Control Cell Line SK-BR-3, partial brown rimming in the 1+ Control Cell Line MDA-175, and no staining in the 0 Control Cell Line MDA-231 indicates a valid assay. If any of the Control Cell Lines perform outside of these criteria, all results with the patient specimens should be considered invalid. 2. Positive Control Tissue: The Positive Control Tissue Slide should be examined next. This slide verifies that the fixation method and epitope retrieval process are effective. Use intact cells for interpretation of staining results because necrotic or degenerated cells often stain non-specifically (26). Staining should be observed in tumor tissue as brown, cell membrane staining. Brown staining of the cytoplasm and negative tissues within the specimen should not be more than corresponding to 1+ staining intensity score. 3. Negative Control Tissue: The Negative Control Tissue Slide should be examined after the Positive Control Tissue to verify the specificity of the labeling of the target antigen by the primary antibody. The absence of specific staining in the Negative Control Tissue confirms the lack of kit cross-reactivity to cells/cellular components. If specific staining occurs in the Negative Control Tissue, results with the patient specimen should be considered invalid. Alternatively, negative portions of the Positive Control Tissue may serve as the Negative Control Tissue, but this should be verified by the user. Note that a weak reaction (0-1+ ( ) P04087EFG_01_K / p. 39/152

40 Gastric Cancer staining intensity) can be observed in most normal epithelial tissue. Possible negative control tissues include: colon, liver and thyroid. Non-specific staining, if present, will be of a diffuse appearance. Sporadic staining of connective tissue may also be observed in sections from excessively formalin-fixed tissues Patient Tissue: Examine patient specimens stained with HercepTest last. Positive staining intensity should be assessed within the context of any non-specific background staining of the Negative Control Reagent. As with any immunocytochemical test, a negative result means that the antigen was not detected, not that the antigen was absent in the cells/tissue assayed. Refer to Summary and Explanation, Limitations, and Performance Characteristics for specific information regarding HercepTest immunoreactivity. Additional Recommendations for Interpretation of HercepTest Staining Adenocarcinoma of the stomach, including gastroesophageal junction tested for HER2 protein overexpression are scored from 0 to 3+. While the 0 and 3+ cases are clear-cut, a small percentage of the remaining 1+ and 2+ samples may be more difficult to interpret. Use the following guidelines for interpretation of HercepTest staining in your laboratory. Evaluate the Control Cell Lines to validate the assay performance. Evaluate the Positive and Negative Control Slides. A hematoxylin and eosin (H&E) staining of the tissue specimen is recommended for the first evaluation. (The tumor may not be obvious when looking at the sample stained with HercepTest. An H&E stained slide is required from the pathologist to verify the presence of the tumor.). The HercepTest TM should be performed on a paired section (serial section) from the same paraffin block of the specimen. Evaluate the sections stained for HER2 protein overexpression at low power first. The majority of positive cases will be obvious at low power magnification. For 1+ cases, use 40x objective magnification to verify membrane staining. For 2+ cases, use 10x-20x objective magnification to verify membrane staining. Surgical specimen Well-preserved and well-stained areas of the specimen should be used to make a determination of the percent of positive tumor cells. If a majority of tumor cells demonstrate complete, basolateral or lateral membrane staining, the staining is either 2+ or 3+. If there is complete, basolateral or lateral membrane staining at a strong intensity in equal to or more than 10% of the tumor cells in surgical specimens, the score of the specimen is 3+. If there is complete, basolateral or lateral membrane staining at a weak to moderate intensity in equal to or more than 10% of the tumor cells in surgical specimens, the score of the specimen is 2+. If equal to or more than 10% of the tumor cells in surgical specimens, stained only in part of their membrane, have a faint/barely perceptible intensity, the score of the specimen is 1+. If less than 10% of the tumor cells in surgical specimens have staining, irrespective of the staining pattern (e.g. complete, basolateral, lateral or part of their membrane), the score is 0. If no staining is observed the score of the surgical specimen is 0. ( ) P04087EFG_01_K / p. 40/152

41 Biopsy specimen Gastric Cancer A cluster of at least 5 stained tumor cells consists of 5 connected HER2 stained tumor cells If there is a tumor cell cluster of at least 5 stained tumor cells with a strong complete, basolateral or lateral membrane staining, the score of the biopsy specimen is 3+, irrespective of percentage of tumor cells stained. If there is a tumor cell cluster of at least 5 stained tumor cells with a weak to moderate complete, basolateral or lateral membrane staining, the score of the biopsy specimen is 2+, irrespective of percentage of tumor cells stained. If there is a tumor cell cluster of at least 5 stained tumor cells with a faint/barely perceptible membrane staining and cells are stained only in part of their membrane, the score of the biopsy specimen is 1+, irrespective of percentage of tumor cells stained. If no staining is observed the score of the biopsy specimen is 0. If membrane staining (irrespective of staining intensity) is observed in less than 5 clustered tumor cells, the score of the biopsy specimen is 0. Limitations - Gastric General limitations 1. Immunocytochemistry is a multi-step diagnostic process that requires specialized training in the selection of the appropriate reagents; tissue selection, fixation, and processing; preparation of the immunocytochemistry slide; and interpretation of the staining results. 2. Tissue staining is dependent on the handling and processing of the tissue prior to staining. Improper fixation, freezing, thawing, washing, drying, heating, sectioning, or contamination with other tissues or fluids may produce artifacts, antibody trapping, or false-negative results. Inconsistent results may be due to variations in fixation and embedding methods, or to inherent irregularities within the tissue. 3. Excessive or incomplete counterstaining may compromise proper interpretation of results. 4. The clinical interpretation of any positive staining or its absence must be evaluated within the context of clinical presentation, morphology and other histopathological criteria. The clinical interpretation of any staining, or its absence, must be complemented by morphological studies and proper controls as well as other diagnostic tests. It is the responsibility of a qualified pathologist, who is familiar with the antibodies, reagents and methods used, to interpret the stained preparation. Staining must be performed in a certified, licensed laboratory under the supervision of a pathologist who is responsible for reviewing the stained slides and assuring the adequacy of positive and negative controls. 5. Tissues from persons infected with hepatitis B virus and containing hepatitis B surface antigen (HBsAg) may exhibit non-specific staining with horseradish peroxidase (27). Reagents may demonstrate unexpected reactions in previously untested tissue types. The possibility of unexpected reactions even in tested tissue types cannot be completely eliminated due to biological variability of antigen expression in neoplasms, or other pathological tissues (28). Contact Dako s Technical Services with documented unexpected reaction. 6. False-positive results may be seen due to non-immunological binding of proteins or substrate reaction products. They may also be caused by pseudoperoxidase activity (erythrocytes) and endogenous peroxidase activity (cytochrome C) (28). 7. The staining procedure should be performed at ambient temperature of C. ( ) P04087EFG_01_K / p. 41/152

42 Gastric Cancer Product-specific limitations 1. The antigen present in the 1+ Control Cell Line MDA-175 is subject to degradation over time. Assess the Control Slide results in connection with the expiration date of the Control Slide. Negative staining of the MDA-175 cells may only indicate that the Control Slide has degraded. The Control Slides must be stored at 2-8 C. 2. False-negative results could be caused by degradation of the antigen in the tissues over time. Specimens should be stained within 4-6 weeks of mounting of tissues on slides when stored at room temperature (20-25 C) (29). 3. For optimal and reproducible results, the HER2 protein requires heat-induced epitope retrieval when tissues are routinely fixed (neutral-buffered formalin) and paraffin embedded. This pre-treatment needs to be completed at the beginning of the entire staining process. See the Specimen Preparation Section, Treatment of tissues prior to staining for instructions. 4. Heat-induced epitope retrieval of the HER2 protein should only be done using a calibrated water bath. Other methods of heating have been tested and do not give reproducible results. 5. Do not replace kit reagents with reagents carrying other lot numbers or with reagents from other manufacturers. The only exception is the Wash Buffer that may be replaced with Dako Wash Buffer, Code S False results could be obtained from evaluation of cytoplasmic staining. Consider only the intensity of cell membrane staining when interpreting results. 7. Stained Control Slides should be used only for validation of the staining run and should not be used as a guide to score the staining reaction in tissue sections. 8. Strong focal staining (3+), i.e. hot spots, may occasionally be seen. This may be the result of uneven fixation and/or processing of tissue. Immunostaining of a second tissue block from the same specimen is recommended. 9. Use of HercepTest on specimens fixed in fixatives other than neutral buffered formalin has not been validated. 10. Note that normal tonsil and esophageal epithelia may stain up to 2+ intensity. 11. Use of crushed gastric cancer specimens and interpretation of artifactual staining around a biopsy edge should be avoided. Performance Characteristics - Gastric Background The safety and efficacy of trastuzumab (Herceptin ) has been demonstrated in a clinical study (the ToGA trial) (38, 39). The study was designed as an open labeled, randomised, multicenter phase III study in HER2-positive patients with inoperable locally advanced, recurrent and/or metastatic adenocarcinoma of the stomach or gastroesophageal junction. In ToGA trial the HER2 positivity was defined as being either IHC-positive (3+) (HercepTest, Dako) and/or positive by HER2 FISH (HER2/CEN17 2.0) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako). After inclusion in the study the patients were randomized to receive chemotherapy (5-FU or capecitabine and cisplatin) or chemotherapy plus trastuzumab. The primary endpoint in the study was overall survival (OS). In the study a total 594 patients were randomized and 584 patients received the study medication and were included in the full analyses set (FAS). For the primary endpoint the combination of chemotherapy plus trastuzumab was shown to be statistically superior to chemotherapy alone. The median OS increased from 11.1 to 13.8 months ( ) P04087EFG_01_K / p. 42/152

43 Gastric Cancer (p=0.0046) with a hazard ratio of 0.74 (95 % CI: ). The Kaplan-Meier curves for OS are shown in Figure 1. Probability of survial Log-Rank Test P = Time (months) NO. Left Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Treatment Group Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figure 1. Kaplan-Meier curve of OS (n=584). Pre-specified exploratory subgroup analyses by HER2 status were performed once the data were available. Two new HER2 subgroups were defined post hoc based on IHC scoring: Group 1 ( low HER2 expressing group ): Group 2 ( high HER2 expressing group ): IHC 0/FISH+ and IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ and IHC 3+ (FISH+ or FISHor FISH no result) (n=446) When the primary analysis on OS was repeated post hoc for the high HER2 expressing group (n=446) the benefit in favor of the combined treatment was even greater. The median OS for the group of patients who had received chemotherapy plus trastuzumab increased to 16.0 months compared to 11.8 months for the patients on chemotherapy alone. The hazard ratio for this analysis decreased to 0.65 (95 % CI: ). The Kaplan-Meier curves for OS for the high HER2 expressing group is shown in Figure 2. ( ) P04087EFG_01_K / p. 43/152

44 Gastric Cancer Probability of Survial Time (months) NO. Left Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Treatment Group Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figure 2. Kaplan-Meier curve of OS for the high HER2 expressing group (n=446). The ToGA trial has shown that the combination of IHC and FISH testing is predictive for the effect of the combined treatment with chemotherapy and trastuzumab, however the exploratory post hoc analyses seems to indicate that patients with higher levels of HER2 protein expression (IHC2+/FISH+ and IHC3+) derive greater benefit. This may be explained by the fact that the protein is the target for trastuzumab. For further information on the ToGA trial, please see the package insert for Herceptin. Reproducibility Intra-run reproducibility: Intra-run reproducibility was tested in one laboratory with 3 specimens of different IHC staining scores. Each specimen was run in triplicate. This protocol was used with automated staining. All specimens gave 100% reproducible results. Intra-run reproducibility was tested in one laboratory with 11 specimens of different IHC staining scores. Each specimen was run in triplicate.this protocol was used with manual staining. All specimens gave 100% reproducible results. Inter-run and inter-laboratory reproducibility: HercepTest analysis of 60 different gastric cancer specimens obtained from stomach or gastroesophageal junction areas representing surgical resections and biopsies were performed on five non-consecutive days at three study sites. The 60 specimens in the study were equally distributed in the three HER2 status categories. A total of 2040 HER2 scorings were performed by six pathologists. Day-to-day agreement (negative, equivocal, positive) ranged from 83.1% to 98.3%. In 47 of 60 possible comparisons the agreements were at 90.0% or above. In Table 11, specific examples of the day-to-day comparisons are shown with average agreements at 91.2%, 92.5% and 92.5% for the three sites. Site-to-site agreements were 82.7%, 75.0% and 88.0%, respectively for pairwise site comparison (see Table 12). According to Fisher s exact test, the results were not different between sites. Observer-to-observer agreements between pathologists at each site were 88.0%, 83.6% and 81.0% for the three study sites, respectively (Table 13). ( ) P04087EFG_01_K / p. 44/152

45 Gastric Cancer In conclusion HercepTest analysis of gastric cancer specimens at three study sites demonstrated good agreement between observations with respect to days, sites and observers. Table 11. Day-to-Day Overall Agreements in Percent - A Subset of 12 Out of 60 Comparisons Observer 1 Observer 2 Average Agreement CI95 LL 1 Agreement CI95 LL 1 Agreement Site 1 Site 2 Site 3 Day 1 vs Day Day 3 vs Day Day 1 vs Day Day 3 vs Day Day 1 vs Day Day 3 vs Day CI95 LL: 95% lower limit confidence interval Table 12. Site-to-site Overall Agreements in Percent Agreement CI95 LL 1 Average Agreement Site 1 vs Site 2 Site 1 vs Site 3 Site 2 vs Site 3 Day 1 vs Day Day 2 vs Day Day 3 vs Day Day 4 vs Day Day 5 vs Day Day 1 vs Day Day 2 vs Day Day 3 vs Day Day 4 vs Day Day 5 vs Day Day 1 vs Day Day 2 vs Day Day 3 vs Day Day 4 vs Day Day 5 vs Day CI95 LL: 95% lower limit confidence interval ( ) P04087EFG_01_K / p. 45/152

46 Gastric Cancer Table 13. Observer-to-Observer Agreements in Percent Agreement CI 95 LL 1 Average Agreement Site 1 Site 2 Site 3 Day Day Day Day Day Day Day Day Day Day Day Day Day Day Day CI95 LL: 95% lower limit confidence interval ( ) P04087EFG_01_K / p. 46/152

47 Gastric Cancer Immunoreactivity Table 14 summarizes HercepTest immunoreactivity with the recommended panel of normal tissues. All tissues were formalin fixed and paraffin embedded and stained with HercepTest according to the instructions in the package insert. Table 14. Summary of HercepTest normal tissue reactivity. Tissue Type (No. Tested) Adrenal (3) Bone marrow (3) Brain/Cerebellum (3) Brain/Cerebrum (3) Breast (3) Cervix uteri (3) Colon (3) Esophagus (3) Heart (3) Kidney (3) Liver (3) Lung (3) Mesothelial cells (3) Ovary (3) Pancreas (3) Parathyroid (3) Peripheral nerve (3) Pituitary (3) Prostate (3) Salivary gland (3) Skeletal muscle (3) Skin (3) Small intestine (3) Spleen (3) Stomach (3) Testis (3) Thymus (3) Thyroid (3) Tonsil (3) Uterus (3) Positive Tissue Element Staining and Staining Pattern Mammary gland (1 of 3 tissues, 1+ staining intensity) Tubules of renal medulla (3 of 3 tissues, 1 2+ in 5 50% of cells, cytoplasmic) Prostate gland/ducts (3 of 3 tissues, 1+ staining intensity, 50% of cells, cytoplasmic) Sweat glands (1 of 3 tissues, 1+, 30% of cells, cytoplasmic) Columnar epithelium, surface (1 of 3 tissues, 2+ staining intensity, 25% of cells) Epithelium (1 of 3 tissues, 1+ staining intensity, 25% of cells) Squamous epithelium (3 of 3 tissues, 1+ staining intensity, 80% of cells) Reported staining in all tissues was membrane, unless otherwise noted. All three specimens of each tissue type had the same staining intensity unless otherwise noted. ( ) P04087EFG_01_K / p. 47/152

48 Gastric Cancer Troubleshooting - Gastric Refer to the Troubleshooting section in Dako s previously referenced Handbook (19) for remedial action, or contact Dako s Technical Service Department to report unusual staining. Problem Probable Cause Suggested Action 1. No staining of slides 2. Weak staining of slides 1a. Programming error. Reagents not used in proper order 1b. Reagent vials were not loaded in the correct locations in the reagent racks 1c. Insufficient reagent in reagent vial 1a. Check programming grid to verify that the staining run was programmed correctly 1b. Check the Reagent Map to verify the proper location of reagent vials 1c. Ensure that enough reagent is loaded into the reagent vials prior to commencing the run. Refer to Reagent Map for volumes required 1d. Sodium azide in Wash Solution 1d. Use fresh preparation of Wash Buffer provided in the kit 1e. Excessive heating of mounted tissue sections prior to deparaffinization and heatinduced antigen retrieval may lead to loss of visible HER2 immunoreactivity. 1e. Air dry the tissue sections at room temperature for a minimum of 12 hours or until dry. Alternatively, dry at 37 C overnight or dry at 60 C for a maximum of one hour. Drying of tissue sections at elevated temperatures must only be performed in a calibrated oven with uniform heat distribution (17). 2a. Inadequate epitope retrieval 2a. Verify that Epitope Retrieval Solution reaches C for a full 40 minutes and is allowed to cool for an additional 20 minutes 2b. Inadequate reagent incubation times 2c. Inappropriate fixation method used 2b. Review Staining Procedure instructions 2c. Ensure that patient tissue is not over-fixed or that an alternative fixative was not used 2d. Excessive heating of mounted tissue sections prior to deparaffinization and heatinduced antigen retrieval may cause a significant decrease in visible HER2 immunoreactivity 2e. Insufficient reagent volume applied 2d. Air dry the tissue sections at room temperature for a minimum of 12 hours or until dry. Alternatively, dry at 37 C overnight or dry at 60 C for a maximum of one hour. Drying of tissue sections at elevated temperatures must only be performed in a calibrated oven with uniform heat distribution (17). 2e. Check size of tissue section (22 mm x 22 mm) and reagent volume applied ( ) P04087EFG_01_K / p. 48/152

49 Gastric Cancer 3. Excessive background staining of slides 4. Tissue detaches from slides 5. Excessively strong specific staining 6. Weak staining of the 1+ Control Slide Cell Line 3a. Paraffin incompletely removed 3a. Use fresh clearing solutions and follow procedure as outlined in Section B.1 3b. Starch additives used in mounting sections to slides 3b. Avoid using starch additives for adhering sections to glass slides. Many additives are immunoreactive 3c. Slides not thoroughly rinsed 3c. Ensure that the Autostainer is properly primed prior to running. Check to make sure that adequate buffer is provided for entire run. Use fresh solutions of buffers and washes 3d. Sections dried during staining procedure 3e. Sections dried while loading the Autostainer 3f. Inappropriate fixation method used 3g. Non-specific binding of reagents to tissue 3d. Verify that the appropriate volume of reagent is applied to slides. Make sure the Autostainer is run with the hood in the closed position and is not exposed to excessive heat or drafts 3e. Ensure sections remain wet with buffer while loading and prior to initiating run 3f. Ensure that approved fixative was used. Alternative fixative may cause excessive background staining 3g. Check fixation method of the specimen and presence of necrosis 4a. Use of incorrect slides 4a. Use silanized slides, such as Dako Silanized Slides, Code S3003, SuperFrost Plus or poly- L-lysine coated slides 5a. Inappropriate fixation method used 5b. Use of improper heat source for epitope retrieval, e.g. steamer, microwave oven or autoclave 5c. Reagent incubation times too long 5d. Inappropriate wash solution used 6a. Incorrect epitope retrieval protocol followed 6b. Lack of reaction with Substrate- Chromogen Solution (DAB) 5a Ensure that only approved fixatives and fixation methods are used 5b. Ensure that only a water bath is used for the epitope retrieval step 5c. Review Staining Procedure instructions 5d. Use only the Wash Buffer that is recommended for the kit 6a. Immerse the slides in the preheated Epitope Retrieval Solution. Bring temperature of the Epitope Retrieval Solution back to C and pre-treat for a full 40 minutes 6b. Ensure that the full 10-minute incubation time is used. Ensure that only one drop of DAB Chromogen was added to 1 ml of DAB Buffered Substrate ( ) P04087EFG_01_K / p. 49/152

50 Gastric Cancer 7. Epitope Retrieval Solution is cloudy in appearance when heated 8. Epitope Retrieval Solution is cloudy in appearance when stored (prior to heating) 6c. Degradation of Control Slide 6c. Check kit expiration date and kit storage conditions on outside of package 7. When heated the solution turns cloudy in appearance 8. The solution has been incorrectly stored or the expiration date of the solution has passed 7. This is normal and does not influence the staining 8. Check kit expiration date and kit storage conditions on outside of package. Discard the epitope retrieval solution NOTE: If the problem cannot be attributed to any of the above causes, or if the suggested corrective action fails to resolve the problem, please call Dako s Technical Services for further assistance. Additional information on staining techniques and specimen preparation can be found in Dako s previously referenced Handbook (19) (available from Dako), Atlas of Immunohistology (30) and Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04087EFG_01_K / p. 50/152

51 FRANÇAIS Utilisation prévue Pour diagnostic in vitro. Le test HercepTest est un dosage semi-quantitatif permettant de déterminer la surexpression de la protéine HER2 dans des échantillons tissulaires de cancers du sein traités en routine pour une évaluation histologique, et dans des échantillons tissulaires fixés au formol et inclus en paraffine, traités en routine, issus de patients atteints d adénocarcinome de l estomac, notamment à la jonction gastro-œsophagienne. L utilisation du HercepTest est indiquée pour l évaluation des patients chez lesquels un traitement par Herceptin (trastuzumab) est envisagé (voir la notice du Herceptin ). REMARQUE pour le cancer du sein uniquement : toutes les patientes participant aux essais cliniques sur Herceptin ont été sélectionnées via un essai clinique immunocytochimique (CTA). Aucune des patientes enrôlées dans ces essais n a été sélectionnée en utilisant HercepTest. HercepTest a été comparé à l essai clinique immunocytochimique sur un ensemble d échantillons indépendant et s est avéré donner des résultats acceptables du point de vue de la concordance. Une éventuelle corrélation entre le HercepTest et les résultats cliniques du Herceptin n a pas été établie. REMARQUE pour le cancer de l estomac uniquement : tous les patients participant à l étude de phase III BO18255 (ToGA) sponsorisée par Hoffmann-La Roche ont été sélectionnés en utilisant le test HercepTest (IHC) de Dako et le kit HER2 FISH pharmdx (FISH) de Dako. L étude a mis en évidence l utilité clinique des deux tests dans le cadre de l évaluation du statut de HER2 chez les patients atteints d un adénocarcinome de l estomac ou de la jonction gastro-œsophagienne localement avancé, inopérable, récidivant et/ou métastasique. Pour ce kit, réf. K5207, les volumes de réactif ont été adaptés pour être utilisés avec l automate Autostainer. Dans ce document, les termes «cancer gastrique» ou «cancer de l estomac» sont également utilisés pour se référer à l adénocarcinome de l estomac, y compris de la jonction gastro-œsophagienne. Pour l application au cancer du sein, consulter les pages 52 à 73. Pour l application au cancer gastrique, consulter les pages 74 à 98. Important : noter les différences qu il existe entre le tissu d un cancer du sein et celui d un cancer de l estomac, en particulier aux sections Interprétation de la coloration. ( ) P04087EFG_01_K / p. 51/152

52 Cancer du sein Résumé et explication Sein Contexte Le gène HER2 humain (également appelé ERBB2 ou NEU) code une protéine souvent appelée protéine HER2 ou p185 HER2. La protéine HER2 est une tyrosine kinase des récepteurs membranaires présentant une homologie avec le récepteur du facteur de croissance épidermique (RFCE ou HER1) (1-8). La protéine HER2 est un composant normal exprimé par un grand nombre de types de cellules épithéliales (8). Chez certaines patientes atteintes d un cancer du sein, la protéine HER2 est surexprimée dans le cadre du processus de transformation maligne et de progression de la tumeur (9). La surexpression de la protéine HER2 à la surface des cellules de cancer du sein suggère qu elle peut être la cible d un traitement par anticorps. Herceptin (trastuzumab) est un anticorps monoclonal humanisé (10) qui se lie avec une forte affinité à la protéine HER2 et s est avéré inhiber la prolifération des cellules tumorales humaines qui surexpriment la protéine HER2 in vitro et in vivo (11-13). Caractéristiques HercepTest a été développé pour offrir une alternative au CTA utilisé dans les études cliniques Herceptin. Les performances de HercepTest en termes de détermination de la surexpression de la protéine HER2 ont été évaluées par une étude indépendante comparant les résultats de HercepTest à ceux du CTA portant sur 548 échantillons de tumeur du sein, aucun n ayant été prélevé sur des patientes enrôlées dans les études cliniques Herceptin. Les résultats indiquent une concordance de 79 % entre les résultats des deux essais sur ces échantillons de tissu. Les données de concordance indiquent également qu une lecture de 3+ avec HercepTest correspond probablement à une lecture positive sur le CTA qui répondrait aux critères d enrôlement pour l essai (2+ ou 3+). Un résultat 2+ avec le test HercepTest ne correspond pas aussi bien aux résultats du CTA. Environ 42 % (53/126) des résultats 2+ avec le HercepTest étaient négatifs avec le CTA (0 1+), ce qui ne permettait pas l enrôlement dans les essais cliniques Herceptin. Le HercepTest est interprété comme négatif à la surexpression de la protéine HER2 (intensité de coloration 0 et de 1+), faiblement positif (intensité de coloration 2+) et fortement positif (intensité de coloration 3+). Le HercepTest n est pas conçu pour donner des informations pronostiques au patient et au médecin et n a pas été validé dans ce but. Principe de la procédure Sein HercepTest contient les réactifs requis pour effectuer une procédure de coloration immunocytochimique en deux étapes pour des échantillons inclus en paraffine et traités en routine. Après incubation avec l anticorps primaire de lapin dirigé contre la protéine HER2 humaine, ce kit utilise le réactif de visualisation prêt à l emploi à base de dextrane. Ce réactif comporte des molécules d immunoglobuline secondaire de chèvre anti-lapin et des molécules de peroxydase de raifort liées à une chaîne polymère de dextrane commune, ce qui permet d éliminer l application séquentielle d un anticorps de liaison et d un anticorps conjugué à de la peroxydase. La réaction croisée du réactif de visualisationavec les immunoglobulines humaines et le sérum fœtal de veau a été éliminée par absorption en phase solide. La conversion enzymatique du chromogène ajouté par la suite entraîne la formation d un produit de réaction visible sur le site de l antigène. L échantillon peut alors être contre-coloré et recouvert d une lamelle de protection. Un microscope optique est utilisé pour l interprétation des résultats. Des lames de contrôle contenant trois lignées cellulaires de cancer de sein humain fixées au formol et incluses en paraffine avec des notes d intensité de coloration de 0, 1+ et 3+ sont fournies pour valider les cycles de coloration. L intensité de coloration de ces trois lignées cellulaires a été corrélée au nombre de récepteurs par cellule. ( ) P04087EFG_01_K / p. 52/152

53 Cancer du sein Le test HercepTest, réf. K5207, peut être utilisé pour la coloration automatisée sur l Autostainer. Réactifs Sein Matériel fourni Le matériel indiqué permet d effectuer 50 tests (50 lames incubées avec l anticorps primaire dirigé contre la protéine HER2 et 50 lames incubées avec le réactif de contrôle négatif correspondant). Le nombre de tests correspond à l utilisation, pour chaque coupe de tissu (22 mm x 22 mm), de 200 µl des flacons 1, 2, 3 et 4, et de la solution de substrat chromogène (DAB). Le kit fournit la quantité suffisante de matériels pour un maximum de 15 cycles de coloration. Flacon nº Quantité Description 1 2 x 11 ml 2 1 x 12 ml 3 2 x 11 ml 4 1 x 12 ml 5 15 x 11 ml 6 3 x 3 ml Peroxidase-Blocking Reagent : réactif inhibiteur de la peroxydase constitué de peroxyde d hydrogène à 3 % contenant 15 mmol/l d azide de sodium ((NaN 3 ). Rabbit Anti-Human HER2 Protein : anticorps de lapin antiprotéine HER2 humaine, isolé par affinité prêt à l emploi. Fourni sous forme de tampon Tris/HCl à 0,05 mol/l, de NaCl à 0,1 mol/l, de NaN 3 à 15 mmol/l, de ph 7,2, contenant une protéine stabilisante. Immunogène : le fragment C-terminal de synthèse (partie intracytoplasmique) de la protéine HER2 couplée à de l hémocyanine de patelle. Spécificité : protéine HER2. Méthode de purification : l anticorps est isolé par affinité en utilisant un peptide de protéine HER2 immobilisé. Visualization Reagent : réactif de visualisation constitué de polymère de dextrane conjugué à la peroxydase de raifort et des immunoglobulines anti-lapin de chèvre isolées par affinité. Fourni dans un tampon Tris-HCl contenant une protéine stabilisante et un agent antimicrobien. Negative Control Reagent : réactif de contrôle négatif, constitué d une fraction d immunoglobuline de sérum de lapin normal à une concentration en protéine équivalente comme anticorps dirigé contre la protéine HER2. Fourni sous forme de tampon Tris/HCl à 0,05 mol/l, de NaCl à 0,1 mol/l, de NaN 3 à 15 mmol/l, de ph 7,2, contenant une protéine stabilisante. DAB Buffered Substrate : substrat tamponné DAB constitué d une solution tampon de substrat, ph 7,5, contenant moins de 0,1 % de peroxyde d hydrogène, des stabilisants, des amplificateurs et un agent antimicrobien. DAB Chromogen : chromogène DAB constitué d une solution chromogène de 3,3 -diaminobenzidine tétrachlorhydrate à 5 %. ( ) P04087EFG_01_K / p. 53/152

54 7 3 x 500 ml 8 2 x 1 L 3 x 5 lames Cancer du sein Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x) : solution de restauration de l épitope constituée de tampon citrate à 0,1 mol/l contenant un détergent. Wash Buffer (10x) : tampon de lavage constitué d un tampon Tris/HCl contenant un détergent et un agent antimicrobien. Control Slides : chaque lame de contrôle contient des coupes de trois lignées cellulaires de carcinome mammaire fixées au formol et incluses en paraffine représentant différents niveaux d expression de la protéine HER2 : MDA-231 (0), MDA-175 (1+) et SK-BR-3 (3+). Les lames de contrôle ont été traitées à la chaleur pour une meilleure adhérence des coupes aux lames de verre. Tout autre traitement par la chaleur des lames de contrôle effectué en vue d améliorer l adhérence des coupes aux lames de verre peut compromettre les résultats de coloration. REMARQUE : les formules de tous les réactifs, y compris de la solution de restauration de l épitope et du tampon de lavage, sont spécifiques à leur utilisation avec ce test. Pour que le test fonctionne comme indiqué, aucune substitution ne doit être effectuée, sauf pour le tampon de lavage, pour lequel le produit Dako réf. S3006 peut être utilisé. Matériel requis mais non fourni Hydroxyde d ammonium, 15 mol/l dilué à 37 mmol/l Contre-colorant : hématoxyline, comme le produit Mayer s Hematoxylin, Dako réf. S3301 (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, A.4) Lamelles de protection Eau distillée ou dé-ionisée (eau de lavage) Étuve de séchage, capable de conserver une température de 60 C maximum Éthanol, absolu et à 95 % Microscope optique (grossissement de 4x à 40x) Milieu de montage, de type Dako Faramount, réf. S3025 ou Glycergel, réf. C0563 Tissus positifs et négatifs à utiliser comme contrôles du processus (voir la section Contrôle de qualité) Lames, SuperFrost Plus, enduites de poly-l-lysine ou Dako Silanized Slides (réf. S3003), (voir Préparation des échantillons) Cuves ou bains de coloration Minuteur (avec une capacité de 2 à 40 min) Bain-marie avec couvercle (capable de maintenir la température de la solution de restauration de l épitope entre 95 et 99 C) Xylène, toluène ou substituts de xylène Le produit réf. K5207 a été spécialement conçu pour être utilisé avec le système d immunocoloration Autostainer, réf. S3400. Consulter le guide d utilisation de l Autostainer à propos des éléments Autostainer nécessaires. ( ) P04087EFG_01_K / p. 54/152

55 Cancer du sein Conservation Sein Conserver entre 2 et 8 C. Ne pas utiliser le kit après la date de péremption indiquée sur l emballage. Si les réactifs sont conservés dans des conditions autres que celles indiquées, celles-ci doivent être validées par l utilisateur (14a,14b). Les lames de contrôle doivent aussi être conservées entre 2 et 8 C. Aucun signe visible n indique l instabilité du produit. Par conséquent, les contrôles positifs et négatifs doivent être testés en même temps que les échantillons de patient. Si une coloration inattendue est observée, ne pouvant être expliquée par un changement des procédures du laboratoire et en cas de suspicion d un problème lié à HercepTest, contacter immédiatement les services techniques de Dako. Préparation des échantillons Sein Les échantillons de biopsie doivent être manipulés de manière à préserver le tissu pour la coloration immunocytochimique. Des méthodes standards de traitement des tissus doivent être utilisées pour tous les échantillons (15). Coupes incluses en paraffine L utilisation de tissus conservés dans du formol neutre tamponné ou dans du liquide de Bouin pour être traités en routine et inclus en paraffine est adaptée. Par exemple, les échantillons de biopsie doivent être inclus dans 3 à 4 mm de paraffine et fixés pendant 18 à 24 heures dans du formol neutre tamponné. Les tissus sont ensuite déshydratés dans différents bains d alcools et de xylène, puis infiltrés dans de la paraffine fondue conservée à 60 C maximum. Les tissus exprimant la protéine HER2, inclus et fixés correctement, peuvent être conservés indéfiniment avant la coupe et le montage des lames s ils sont conservés dans un endroit frais (entre 15 et 25 C) (15,16). Aux États-Unis, le «Clinical Labor atory Improvement Act of 1988» (Loi sur l amélioration des pratiques cliniques en laboratoire de 1988) stipule dans son article 42 CFR (b) que «Le laboratoire doit conserver les lames colorées pendant au moins dix ans après la date de l examen et les blocs d échantillons pendant au moins deux ans à compter de la date d examen» (16). Les échantillons tissulaires doivent être coupés en tranches de 4 à 5 µm, montés sur lame et séchés à l air libre pendant au moins 12 heures (ou jusqu à ce qu ils soient secs) à température ambiante, ou toute une nuit à 37 C ou encore pendant une heure à 60 C. ATTENTION : un chauffage excessif pendant plus d une heure à 60 C ou plus peut entraîner une perte ou une diminution marquée de l immunoréactivité spécifique de la protéine HER2 associée à la membrane (17). Afin de conserver l antigénicité, les coupes de tissu, montées sur les lames (SuperFrost Plus, lames enduites de poly-l-lysine, lames silanisées), doivent être colorées dans les 4 à 6 semaines suivant la coupe lorsqu elles sont conservées à température ambiante (entre 20 et 25 C) (18). Les lames nécessaires pour l évaluatio n de la protéine HER2 et la vérification de la présence d une tumeur doivent être préparées au même moment. Il est recommandé d utiliser au moins 5 lames : 1 lame pour la présence d une tumeur, 2 lames pour l évaluation de la protéine HER2 (une lame pour incubation avec le flacon nº 2 et une pour incubation avec le flacon nº 4) et 2 lames de secours. L utilisation du test HercepTest TM sur des tissus décalcifiés n a pas été validée et n est pas recommandée. Consulter le Manuel Dako «Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods» (Méthodes de coloration immunohistochimique) (19) et les références 15 et 16 pour plus de détails sur la préparation des échantillons. ( ) P04087EFG_01_K / p. 55/152

56 Cancer du sein Traitement des tissus avant coloration Une méthode spécifique de restauration de l épitope dans un tampon citrate à 10 mmol/l doit être utilisée pour obtenir des performances de dosage optimales. La solution de restauration de l épitope est fournie dans le kit HercepTest. Cette méthode implique le chauffage des coupes de tissus montées sur les lames et leur immersion dans un tampon citrate à 10 mmol/l (20), dans un bain-marie étalonné, capable de maintenir la température requise de la solution de restauration de l épitope (entre 95 et 99 C). L es laboratoires situés en altitude doivent déterminer la meilleure méthode pour maintenir la température requise dans le bain-marie. La restauration de l épitope doit être réalisée dans un bain-marie. D autres méthodes de chauffage ont été testées sans générer de résultats reproductibles. Commencer la procédure de coloration immédiatement après la restauration de l épitope. Tout écart par rapport à la procédure décrite peut affecter les résultats. Précautions - Sein 1. Pour diagnostic in vitro. 2. Pour utilisateurs professionnels. 3. Le flacon 1 de réactif inhibiteur de la peroxydase contient 3 % de peroxyde d hydrogène. La fiche technique de sécurité destinée aux utilisateurs professionnels est disponible sur demande. 4. Le flacon 6 de chromogène DAB contient 5 - <10 % tétrachlorure de biphényle-3,3',4,4'- tétrayltétraammonium et est étiqueté : H350 H341 P201 P280 Danger P308 + P313 P405 P501 Peut provoquer le cancer. Susceptible d'induire des anomalies génétiques. Se procurer les instructions avant utilisation. Porter des gants de protection. Porter un équipement de protection des yeux ou du visage. Porter des vêtements de protection. EN CAS d exposition prouvée ou suspectée: Consulter un médecin. Garder sous clef. Éliminer le contenu et le récipient en conformité avec toutes réglementations locales, régionales, nationales, et internationales. D'une manière générale, les personnes âgées de moins de 18 ans ne sont pas autorisées à utiliser ce produit. Les utilisateurs doivent être formés aux procédures de travail adéquates, aux propriétés dangereuses du produit et aux instructions de sécurité nécessaires. Se reporter à la fiche de données de sécurité pour plus d'informations. 5. Le flacon 8 de tampon de lavage Wash Buffer (10x), contient 5-<10% 2-Amino-2- (hydroxyméthyl) propane-1,3-diol, chlorhydrate et 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxanne. Peut déclencher une réaction allergique. Le flacon 8, Wash buffer (10x), est étiqueté : Attention H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Provoque une sévère irritation des yeux. Porter un équipement de protection des yeux ou du visage. Se laver les mains soigneusement après manipulation. EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX: Rincer avec ( ) P04087EFG_01_K / p. 56/152

57 Cancer du sein précaution à l eau pendant plusieurs minutes. Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer. 6. Ce produit contient de l azide de sodium (NaN 3 ), produit chimique hautement toxique dans sa forme pure. Aux concentrations du produit, bien que non classé comme dangereux, l azide de sodium peut réagir avec le cuivre et le plomb des canalisations pour former des azides de métal hautement explosifs. Lors de l élimination, rincer abondamment à l eau pour éviter toute accumulation d azide métallique dans les canalisations (21, 22). 7. Les flacons 2, 3 et 4 contiennent des produits d origine animale. Comme avec tout produit d origine biologique, des procédures de manipulation appropriées doivent être respectées. 8. Les échantillons et les lames de contrôle, avant et après fixation, et tous les matériels en contact avec ceux-ci, doivent être manipulés comme s ils étaient susceptibles de transmettre une infection et jetés en prenant les précautions appropriées (23). Ne pas pipeter les réactifs à la bouche et éviter tout contact de la peau et des muqueuses avec les réactifs et les échantillons. Si les réactifs entrent en contact avec des zones sensibles, laver abondamment à l eau. 9. Minimiser tout risque de contamination microbienne des réactifs afin d éviter une coloration non spécifique. 10. Toute durée, température ou méthode d incubation autres que celles indiquées peuvent entraîner des résultats erronés. Un séchage excessif pendant plus d une heure à 60 C ou plus peut entraîner une perte ou une diminution marquées de l immunoréactivité spécifique de la protéine HER2 associée à la membrane (17). 11. Les réactifs sont à la dilution optimale. Une dilution supplémentaire peut entraîner une perte de coloration des antigènes. 12. Les formules de tous les réactifs, y compris de la solution de restauration de l épitope et du tampon de lavage, sont spécifiques à leur utilisation avec ce test. Pour que le test fonctionne comme indiqué, aucune substitution ne doit être effectuée, sauf pour le tampon de lavage, pour lequel le produit Dako réf. S3006 peut être utilisé. 13. Le réactif de visualisation et le chromogène DAB peuvent être affectés négativement en cas d exposition à une luminosité élevée. Ne pas conserver les composants du kit ni effectuer de coloration sous une lumière vive, telle la lumière directe du soleil. 14. Porter un équipement de protection approprié pour éviter tout contact avec les yeux et la peau. Se reporter à la fiche des données de sécurité (FDS) pour plus d informations. 15. Les résidus de paraffine peuvent produire des faux négatifs. 16. L emploi de volumes de réactifs autres que ceux recommandés peut entraîner une perte d immunoréactivité visible de la protéine HER2. Les coupes de tissu supérieures à 22 mm x 22 mm nécessitent d appliquer 2 à 3 fois 200 µl de réactif sur 2 ou 3 zones d application automatisée. INSTRUCTIONS D UTILISATION Sein A. Préparation des réactifs Il est pratique de préparer les réactifs suivants avant la coloration : A.1 Solution de restauration de l épitope À l aide d eau distillée ou dé-ionisée, diluer une quantité suffisante du flacon 7 (Epitope Retrieval Solution 10x) au 1:10 pour la procédure de coloration prévue. La solution diluée inutilisée peut être conservée à 2 8 C pendant un mois. Jeter la s olution diluée si elle a un aspect trouble. ( ) P04087EFG_01_K / p. 57/152

58 Cancer du sein A.2 Tampon de lavage À l aide d eau distillée ou dé-ionisée, diluer une quantité suffisante du flacon 8 (Wash Buffer 10x) au 1:10, pour les étapes de lavage. Le tampon inutilisé peut être conservé à 2 8 C pen dant un mois. Jeter le tampon s il semble trouble. L Autostainer est programmé pour rincer les coupes tissulaires après le réactif d inhibition de la peroxydase et la solution de substrat chromogène. Il convient de noter que l on peut utiliser de l eau distillée (ou dé-ionisée) ou du tampon de lavage pour ces étapes de rinçage. Du tampon de lavage doit être utilisé pour toutes les autres étapes de rinçage. A.3 Solution de substrat chromogène (DAB) Préparer la solution de substrat chromogène en ajoutant 11 gouttes (25 à 30 µl par goutte) de chromogène DAB du flacon 6 dans le flacon 5 contenant le substrat tamponné DAB (11 ml) puis mélanger. La solution de substrat chromogène (DAB) préparée est stable pendant environ 5 jours lorsqu elle est conservée entre 2 et 8 C. Cette solution doit être bien mélangée avant utilisation. La formation d un précipité dans la solution n affecte pas la qualité de la coloration. REMARQUE : la couleur du chromogène DAB du flacon 6 peut varier de transparent à lavandemarron clair. Cela n affecte en rien les performances de ce produit. La dilution doit être effectuée conformément aux instructions de la présente notice. L ajout d une quantité trop importante de chromogène DAB dans le tampon substrat DAB entraîne une détérioration du signal positif. A.4 Contre-colorant Le produit final de la réaction de coloration au DAB n est soluble ni dans l alcool ni dans l eau. Utiliser une contre-coloration à l hématoxyline et ajuster l intensité de la coloration à l hématoxyline au niveau indiqué dans l ouvrage intitulé «HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer» (Manuel d interprétation du test HercepTest Cancer du sein) de Dako. Il est possible d utiliser de l hématoxyline, à base d alcool ou d eau, comme la Dako Mayer s Hematoxylin, réf. S3301. Faire suivre la contre-coloration à l hématoxyline par un rinçage abondant à l eau distillée ou dé-ionisée, puis immerger les lames dans un bain de solution aqueuse d ammoniaque à 37 mmol/l (voir section B.2, étape 3). La solution aqueuse d ammoniaque (à 37 mmol/l) est préparée en mélangeant 2,5 ml d hydroxyde d ammonium à 15 mol/l avec 1 litre d eau distillée ou dé-ionisée. La solution aqueuse d ammoniaque à 37 mmol/l inutilisée peut être conservée à température ambiante (entre 20 et 25 C) durant 12 mois, dans un flacon hermétiquement fermé. A.5 Milieu de montage L utilisation d un milieu de montage permanent non aqueux est recommandée. Cependant, un milieu de montage aqueux peut également être utilisé. Les milieux de montage de Dako, Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use, réf. S3025 ou Glycergel Mounting Medium, réf. C0563, sont recommandés pour le montage aqueux. Liquéfier le Glycergel en le chauffant à environ 40 C (±5 C) avant utilisat ion. B. Procédure de coloration sur l Autostainer B.1 Remarques sur la procédure L utilisateur doit lire attentivement les présentes instructions et se familiariser avec tous les composants et instruments avant utilisation (voir la section Précautions). Tous les réactifs doivent être ramenés à température ambiante (entre 20 et 25 C) avant de procéder à l immunocoloration. De la même manière, toutes les incubations doivent être effectuées à température ambiante. Ne pas laisser les coupes tissulaires sécher durant le chargement des lames sur l Autostainer et durant la procédure de coloration. Les coupes tissulaires desséchées peuvent présenter une coloration non spécifique plus importante. ( ) P04087EFG_01_K / p. 58/152

59 Cancer du sein Si la procédure de coloration doit être interrompue, les lames peuvent être conservées dans un bain de tampon après incubation de l anticorps primaire, jusqu à une heure à température ambiante (20 25 C), sans que cela affecte les perf ormances de coloration. Déparaffinage et réhydratation : avant la coloration, les lames de tissu doivent être déparaffinées afin d éliminer le milieu de montage, puis réhydratées. Éviter toute élimination incomplète de la paraffine. Les résidus de milieu d inclusion provoquent un accroissement du nombre de colorations non spécifiques. Cette étape doit être exécutée à température ambiante (20 25 C). 1. Placer les lames dans un bain de xylène et laisser incuber pendant 5 (±1) minutes. Changer les bains et répéter l opération une fois. 2. Tapoter afin d éliminer l excès de liquide et placer les lames dans de l éthanol absolu pendant 3 minutes (±1 minute). Changer les bains et répéter l opération une fois. 3. Tapoter afin d éliminer l excès de liquide et placer les lames dans de l éthanol à 95 % pendant 3 minutes (±1 minute). Changer les bains et répéter l opération une fois. 4. Tapoter afin d éliminer l excès de liquide et placer les lames dans de l eau distillée ou dé-ionisée pendant au moins 30 secondes. Commencer la procédure de coloration comme indiqué à la section B.2, Étape 1, restauration de l épitope. Les solutions de xylène et d alcool doivent être renouvelées toutes les 40 lames. Du toluène ou des substituts de xylène, comme l Histoclear, peuvent être utilisés à la place du xylène. REMARQUE : les réactifs et les instructions fournis dans cette trousse ont été conçus pour des performances optimales. Une dilution supplémentaire des réactifs ou une modification des températures d incubation peuvent entraîner des résultats erronés ou discordants. Des différences dans le traitement des tissus et les procédures techniques au sein du laboratoire de l utilisateur peuvent invalider les résultats de l essai utilisés pour la sélection des patients devant être traités par Herceptin. B.2 Protocole de coloration Exécuté à température ambiante entre 20 et 25 C. Étape 1 : restauration de l épitope Remplir les cuves, par ex., cuves de Coplin, de solution de restauration de l épitope diluée (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, section A.1). Placer les cuves de coloration contenant la solution de restauration de l épitope diluée dans un bain-marie. Faire chauffer le bain-marie et la solution de restauration de l épitope entre 95 et 99 C. Lors du chauffage, la solution de restauration de l épitope prend un aspect trouble. Couvrir les cuves pour stabiliser la température et éviter toute évaporation. Immerger les coupes déparaffinées et amenées à température ambiante dans l Epitope Retrieval Solution préchauffée dans les cuves de coloration. RAMENER LA TEMPÉRATURE DU BAIN-MARIE ET DE LA SOLUTION DE RESTAURATION DE L ÉPITOPE ENTRE 95 ET 99 C. Incuber pendant 40 (±1) minutes entre 95 et 99 C. Retirer la cuve contenant les lames du bain-marie. Laisser les lames refroidir dans la solution de restauration de l épitope pendant 20 (±1) minutes à température ambiante. Faire décanter la solution de restauration de l épitope et rincer les coupes avec du tampon de lavage (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, Section A.2). Pour des performances optimales, laisser tremper les coupes dans le tampon de lavage pendant 5 à 20 minutes après restauration de l épitope et avant coloration. REMARQUE : la solution de restauration de l épitope est conçue pour une application unique. Ne pas réutiliser. Étape 2 : procédure sur l Autostainer ( ) P04087EFG_01_K / p. 59/152

60 Cancer du sein 1. Consulter les durées de programme et les volumes de réactif nécessaires (voir le point 4 ci-dessous pour les volumes spécifiques) sur la carte établie par l Autostainer sur le programme automatique HercepTest. 2. Placer les flacons de réactifs de l Autostainer sur le portoir de réactifs de l automate conformément à la carte des réactifs établie par l ordinateur. 3. Charger les lames sur l Autostainer conformément à la carte des lames, établie par l ordinateur. 4. Paramétrer le programme et lancer le programme HercepTest. Voici une description rapide du cycle de programme : Rincer 200 µl de réactif inhibiteur de la peroxydase 5 minutes Rincer 200 µl d anticorps primaire anti-protéine HER2 (ou réactif de contrôle négatif) 30 minutes Rincer 200 µl de réactif de visualisation 30 minutes Rincer Rincer Transférer 200 µl de solution de substrat chromogène (DAB) 10 minutes Rincer les lames à l eau dé-ionisée après l étape du substrat chromogène REMARQUE : l automate Autostainer version 01 rince les lames dans un tampon. Par conséquent, il faut rincer les lames à l eau dé-ionisée après les avoir sorties de l Autostainer. Étape 3 : contre-coloration (instructions données pour l hématoxyline) Retirer les lames de l Autostainer et effectuer une contre-coloration à l hématoxyline comme indiqué ci-dessous. Immerger les lames dans un bain d hématoxyline. Incuber durant 2 à 5 minutes, en fonction de la concentration de l hématoxyline utilisée. Rincer doucement dans un bain d eau distillée ou dé-ionisée. Veiller à éliminer toute hématoxyline résiduelle. Facultatif : plonger 10 fois les lames dans un bain de solution aqueuse d ammoniaque à 37 mmol/l (voir section A.4). Rincer doucement les lames dans un bain d eau distillée ou dé-ionisée durant 2 à 5 minutes. REMARQUE : en fonction de la durée de l incubation et de la puissance de l hématoxyline utilisée, la contre-coloration entraînera une coloration bleu clair à bleu foncé des noyaux cellulaires. Une contre-coloration excessive ou incomplète peut conduire à une interprétation erronée des résultats. Étape 4 : montage L utilisation d un milieu de montage permanent non aqueux est recommandée. Cependant, un milieu de montage aqueux peut également être utilisé. Les échantillons peuvent être montés en utilisant un milieu de montage aqueux de type Dako Faramount, réf. S3025, ou Glycergel, réf. C0563, puis recouverts d une lamelle. REMARQUE : les lames peuvent être lues à tout moment. Cependant, une atténuation peut se produire si les lames sont recouvertes d un milieu de montage ( ) P04087EFG_01_K / p. 60/152

61 Cancer du sein aqueux et exposées à une forte lumière pendant une semaine. Pour limiter cette atténuation, conserver les lames dans l obscurité à température ambiante (20 25 C). Contrôle de qualité Sein Des différences dans la fixation, le traitement et l inclusion des tissus dans le laboratoire de l utilisateur peuvent générer une variabilité significative des résultats, ce qui requiert des contrôles internes réguliers, en complément des lames de contrôle fournies par Dako. Aux États-Unis, les utilisateurs doivent consulter les consignes de contrôle de qualité du College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry, du document CLSI (ancien NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24) et la référence 25 pour plus d informations. ( ) P04087EFG_01_K / p. 61/152

62 Cancer du sein Tableau 1. Objectif du contrôle qualité quotidien. Tissu : fixé et traité comme un échantillon de patient Contrôle positif : tissu ou cellules contenant l antigène cible à détecter (peut être localisé dans le tissu du patient). Le contrôle idéal est un tissu présentant une faible coloration positive pour être plus sensible à l anticorps ou à une dégradation de l antigène. Anticorps spécifique et secondaire Contrôle toutes les étapes de l analyse. Valide le réactif et les procédures utilisés pour la coloration de la protéine HER2. Anticorps non spécifique* ou tampon avec même anticorps secondaire que celui utilisé avec l anticorps spécifique Détection d une coloration de fond non spécifique. Contrôle négatif : tissus ou cellules devant être négatifs (peuvent être localisés dans un tissu de patient ou tissu de contrôle positif). Détection d une réactivité croisée inattendue de l anticorps aux cellules/éléments cellulaires. Détection d une coloration de fond non spécifique. Tissus de patient Détection d une coloration spécifique. Détection d une coloration de fond non spécifique. Lame de contrôle fournie par Dako. Procédure de coloration des contrôles uniquement. * Sérum provenant de la même espèce que l anticorps spécifique mais non dirigé contre le même antigène cible. Pour détecter les liaisons de l anticorps non spécifiques, par ex., la liaison de la partie Fc de l anticorps par le tissu. Lame de contrôle (fournie) : chacune des lames de contrôle fournies contient trois lignées cellulaires de cancer du sein humain fixées au formol, incluses en paraffine et enrobées, présentant des notes d intensité de 0, 1+ et 3+. Une lame doit être colorée lors de chaque cycle de coloration. L évaluation des lignées cellulaires de la lame de contrôle fournie par Dako indique la validité du cycle de coloration. Tissu de contrôle positif : les contrôles doivent être des échantillons d autopsie/de biopsie/de chirurgie récents fixés, traités et inclus aussi rapidement que possible de la même manière que le ou les échantillons de patient. Les contrôles de tissu positifs indiquent si les tissus ont été préparés correctement et si des techniques de coloration appropriées ont été utilisées. Un tissu de contrôle positif pour chaque ensemble de conditions d analyse doit être inclus dans chaque cycle de coloration. Les tissus de contrôle positif doivent présenter une faible coloration positive pour pouvoir détecter des changements minimes de sensibilité de l anticorps primaire. Les lames de contrôle fournies avec ce kit ou les échantillons traités différemment du ou des échantillons de patient valident les performances des réactifs uniquement et non la préparation des tissus. Dans l idéal, il est recommandé d utiliser des tissus issus de carcinome mammaire humain (infiltrant) invasif surexprimant la protéine HER2 (2+), analysés précédemment et déterminés comme tels, comme tissus de contrôle positif. REMARQUE : les tissus de contrôle positif connus ne doivent être utilisés que pour vérifier les bonnes performances des tissus traités et des réactifs de test, et NON pour établir un diagnostic spécifique aux échantillons de patient. Si les tissus de contrôle positifs ne présentent pas la coloration positive appropriée, les résultats des échantillons de patients doivent être considérés comme non valides. Tissu de contrôle négatif : utiliser un tissu de contrôle négatif (connu pour être négatif à la protéine HER2) fixé, traité et inclus de la même manière que le ou les échantillons de patient avec chaque cycle de coloration pour vérifier la spécificité de l anticorps primaire et fournir une indication de la coloration de fond spécifique. Le côlon, le foie ou la thyroïde sont des tissus de contrôle négatif appropriés. La variété des différents types cellulaires présents dans la plupart des coupes de tissu offre des sites de contrôle négatifs internes (cela doit être vérifié par l utilisateur). Les canaux mammaires sains peuvent servir de contrôles négatifs internes. ( ) P04087EFG_01_K / p. 62/152

63 Cancer du sein Si une coloration spécifique est observée dans les tissus de contrôle négatif ou les tissus de contrôle négatif interne, les résultats obtenus à partir des échantillons de patients doivent être considérés comme non valides et le test doit être effectué de nouveau. Réactif de contrôle négatif non spécifique : utiliser le réactif de contrôle négatif fourni au lieu de l anticorps primaire avec une coupe de chaque échantillon de patient afin d évaluer la coloration non spécifique et d obtenir une meilleure interprétation de la coloration spécifique au niveau du site de l antigène. La période d incubation du réactif de contrôle négatif doit correspondre à celle de l anticorps primaire. Vérification du dosage : avant toute première utilisation d un système de coloration ou d anticorps lors d une procédure diagnostique, l utilisateur doit vérifier les performances spécifiques de l anticorps en le testant sur une série de tissus en interne dont les caractéristiques de performance immunocytochimique sont connues, représentant des tissus positifs et négatifs connus. Consulter les procédures de contrôle qualité mentionnées ci-dessus dans la présente notice, ainsi que les exigences de contrôle de qualité du Certification Program for Immunohistochemistry du CAP et/ou du document Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline du CLSI (ancien NCCLS) (24). Ces procédures de contrôle qualité doivent être reproduites pour chaque nouveau lot d anticorps ou dès lors qu un changement est apporté aux paramètres du dosage. Les carcinomes mammaires pour lesquels les intensités de coloration de la protéine HER2 connues vont de 0 à 3+ et les tissus négatifs comme le côlon, le foie ou la thyroïde, conviennent à la vérification du dosage. Interprétation de la coloration Sein Pour la détermination de la surexpression de la protéine HER2, seuls l intensité et le schéma de coloration de la membrane doivent être évalués en utilisant l échelle présentée au Tableau 2. L évaluation des lames doit être réalisée par un pathologiste à l aide d un microscope optique. Pour l évaluation de la coloration immunocytochimique et la notation, un objectif à grossissement de 10X est approprié. L utilisation d un objectif à grossissement de 20 40x permet de confirmer le score. La coloration cytoplasmique doit être considérée comme une coloration non spécifique et ne doit pas être incluse dans l évaluation de l intensité de coloration de la membrane (8). Pour faciliter la différenciation des colorations 0, 1+, 2+ et 3+, se reporter à l ouvrage intitulé «HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer» (Manuel d interprétation du test HercepTest Cancer du sein) de Dako pour consulter des illustrations des intensités de coloration. Seuls les échantillons de patientes souffrant de carcinome mammaire invasif doivent être notés. Dans les cas d échantillons contenant à la fois des carcinomes in situ et invasifs, seuls les composants invasifs doivent être évalués. Tableau 2. Critères de détermination de l intensité de coloration de la membrane cellulaire. Schéma de coloration Aucune coloration n est observée ou une coloration de la membrane est observée dans moins de 10 % des cellules tumorales. Une coloration de la membrane légère/à peine perceptible est détectée dans plus de 10 % des cellules tumorales. Les cellules ne sont colorées que sur une partie de leur membrane Une coloration faible à modérée de l intégralité de la membrane est observée dans plus de 10 % des cellules tumorales. Une forte coloration de l intégralité de la membrane est observée dans plus de 10 % des cellules tumorales. Note (Rapport au médecin traitant) Évaluation de la surexpression de la protéine HER2 (Rapport au médecin traitant) Négative Négative Faiblement positive Fortement positive Le HercepTest est interprété comme négatif à la surexpression de la protéine HER2 (intensité de coloration 0 et 1+), faiblement positif (intensité de coloration 2+) et fortement ( ) P04087EFG_01_K / p. 63/152

64 Cancer du sein positif (intensité de coloration 3+). Le HercepTest n est pas conçu pour donner des informations pronostiques au patient et au médecin et n a pas été validé dans ce but. Pour chaque cycle de coloration, les lames doivent être examinées dans l ordre présenté au Tableau 3 pour déterminer la validité du cycle de coloration et permettre une évaluation semiquantitative de l intensité de coloration du tissu de l échantillon. Tableau 3. Ordre d évaluation des lames. Ordre de lecture des lames Raisonnement 1. Lame de contrôle contenant les trois lignées cellulaires Présence d une coloration 3+ brune de la membrane cellulaire (anneau) dans la lignée cellulaire de contrôle SK-BR-3 d intensité 3+, anneaux bruns partiels dans la lignée cellulaire de contrôle MDA-175 d intensité 1+, et aucune coloration dans la lignée cellulaire de contrôle MDA-231 d intensité 0 : indique que le dosage est valide. Une coloration membranaire ponctuelle et discontinue est présente dans un nombre faible à modéré de cellules de la lignée cellulaire de contrôle MDA-175 faiblement positive d intensité 1+. Une coloration immunologique punctiforme de l appareil de Golgi du cytoplasme peut être observée dans cette lignée cellulaire. La présence d une coloration brune dans la lignée cellulaire de contrôle MDA-231 d intensité 0 (négative à la coloration de la protéine HER2) indique qu il y a eu une coloration non spécifique au cours du dosage. Les résultats du dosage peuvent être non valides en raison d une coloration excessive. 2. Lame de tissu de contrôle positif Une coloration membranaire brune doit être observée. La coloration du cytoplasme et des tissus négatifs ne doit pas être supérieure à Lame de tissu de contrôle négatif L ABSENCE de coloration spécifique sur la lame de tissu de contrôle négatif confirme l absence de réactivité croisée du kit aux cellules/composants cellulaires. Si une coloration spécifique de la membrane se produit sur la lame de tissu de contrôle négatif, les résultats des échantillons de patient doivent être considérés comme non valides. 4. Lame de tissu de patient colorée en utilisant le réactif de contrôle négatif 5. Lame de tissu de patient colorée en utilisant l anticorps primaire L absence de coloration membranaire spécifique permet de vérifier le marquage spécifique de l antigène cible par l anticorps primaire. Toute autre coloration brune ou foncée dans le cytoplasme de l échantillon traité avec le réactif de contrôle négatif, comme dans le tissu conjonctif, les leucocytes, les érythrocytes ou le tissu nécrotique, doit être considérée comme une coloration de fond non spécifique et ne doit pas être rapportée dans la partie Commentaires de la fiche contenant les données. Lorsqu une surexpression de la protéine HER2 est détectée dans l échantillon, un anneau brun apparaît autour de la membrane des cellules tumorales traitées avec l anticorps primaire. 1. Lame de contrôle (fournie) : la lame de contrôle positive au HercepTest doit être examinée en premier lieu pour vérifier que tous les réactifs fonctionnent correctement. La résence d un produit de réaction brun (3,3 -diaminobenzidine, DAB) au niveau de la membrane cellulaire indique une réactivité positive. La présence d une coloration périphérique brune de la membrane cellulaire (anneau) dans la lignée cellulaire de contrôle SK-BR-3 d intensité 3+, une coloration partielle en anneaux bruns dans la lignée cellulaire de contrôle MDA-175 d intensité 1+, et aucune coloration dans la lignée cellulaire de contrôle MDA-231 d intensité 0, tout cela indique que le dosage est valide. Si l une des lignées cellulaires de contrôle est en-dehors de ces critères, tous les résultats obtenus à partir des échantillons de patients doivent être considérés comme non valides. ( ) P04087EFG_01_K / p. 64/152

65 Cancer du sein 2. Lame de tissu de contrôle positif : la lame de tissu de contrôle positif doit être examinée ensuite. Cette lame permet de vérifier que la méthode de fixation et le processus de restauration de l épitope fonctionnent. Utiliser des cellules intactes pour l interprétation des résultats de coloration ; les cellules nécrotiques ou dégénérées se colorent souvent de manière non spécifique (26). Une coloration brune de la membrane cellulaire doit être observée dans les tissus tumoraux. Une coloration brune du cytoplasme et des tissus négatifs dans l échantillon ne doit pas correspondre à un score d intensité de coloration supérieur à Lame de tissu de contrôle négatif : la lame de tissu de contrôle négatif doit être examinée après le tissu de contrôle positif pour vérifier la spécificité du marquage de l antigène cible par l anticorps primaire. L absence de coloration spécifique dans le tissu de contrôle négatif confirme l absence de réactivité croisée du kit aux cellules/composants cellulaires. Si une coloration spécifique se produit dans le tissu de contrôle négatif, les résultats des échantillons de patient doivent être considérés comme non valides. D autre part, les portions négatives du tissu de contrôle positif peuvent servir de tissu de contrôle négatif mais cela doit être vérifié par l utilisateur. Il convient de noter qu une faible réaction (intensité de coloration de 0 à 1+) peut être observée dans la plupart des tissus épithéliaux sains. Parmi les tissus de contrôle susceptibles d être négatifs figurent : le côlon, le foie et la thyroïde. Lorsqu elle est présente, une coloration non spécifique présente une apparence diffuse. Une coloration sporadique du tissu conjonctif peut également être observée dans des coupes provenant de tissus fixés au formol de manière excessive Tissus de patient : examiner les échantillons de patients colorés avec HercepTest en dernier. L intensité de coloration positive doit être évaluée dans le contexte d un bruit de fond non spécifique du réactif de contrôle négatif. Comme pour tout test immunocytochimique, un résultat négatif signifie que l antigène n a pas été détecté, et non pas que l antigène est absent des cellules/tissus testés. Se référer aux sections Résumé et explication, Limites et Caractéristiques de performance pour obtenir des informations spécifiques relatives à l immunoréactivité HercepTest. Recommandations supplémentaires pour l interprétation de la coloration HercepTest La plupart des carcinomes mammaires métastatiques testés en matière de surexpression de la protéine HER2 sont notés 0 ou 3+. Alors que la majorité de ces cas sont clairs, un faible pourcentage des échantillons 1+ et 2+ restants peut être plus difficile à interpréter. Suivre les recommandations suivantes pour l interprétation de la coloration HercepTest dans votre laboratoire. Évaluer les lignées cellulaires de contrôle pour valider les performances du dosage. Évaluer les lames de contrôle positif et négatif. Une coloration hématoxyline et éosine (H&E) de l échantillon de tissu est recommandée pour la première évaluation. (La tumeur peut ne pas être évidente lors de l examen de l échantillon coloré avec HercepTest. Une lame colorée par H&E est nécessaire au pathologiste pour vérifier la présence de la tumeur.) Le HercepTest doit être effectué sur une paire de coupes (coupes en série) provenant du même bloc d échantillon inclus en paraffine. Évaluer les coupes colorées en termes de surexpression de la protéine HER2 à faible puissance en premier lieu. La majorité des cas positifs apparaîtra de manière évidente sous un faible grossissement. Les régions bien conservées et bien colorées de l échantillon doivent être utilisées pour déterminer le pourcentage de cellules tumorales positives. ( ) P04087EFG_01_K / p. 65/152

66 Cancer du sein En général, la notation des cas doit être claire à faible grossissement. Si la distinction entre les cas limites 1+/2+ est difficile à faible grossissement, la note est généralement de 1+. Pour vérifier la coloration membranaire, utiliser un grossissement de 20 à 40x. Si une majorité de cellules tumorales présente une coloration membranaire complète, la coloration est soit de 2+ soit de 3+. Passer à un grossissement de 20 à 40x pour confirmer l évaluation. Dans la majorité des cas notés 3+, au moins 80 % des cellules tumorales sont colorées et la coloration membranaire est intense. Si l échantillon est proche du seuil de 10 % de cellules tumorales positives, il est recommandé de dénombrer au moins 100 cellules tumorales afin de déterminer le pourcentage de cellules colorées. Si on observe une coloration membranaire complète d intensité faible à modérée dans plus de 10 % des cellules tumorales, la note de l échantillon est de 2+. Ce phénomène s accompagne généralement d une coloration membranaire incomplète de la majorité des cellules tumorales restantes. Si moins de 10 % des cellules tumorales présentent une coloration membranaire périphérique complète, et même si d autres cellules tumorales présentent une coloration membranaire incomplète, la note est de 1+. Si moins de 10 % des cellules tumorales présentent une coloration membranaire périphérique complète ou incomplète, la note est de 0. Limites Sein Limites générales 1. L immunocytochimie est un processus diagnostique à plusieurs étapes qui requiert une formation spécialisée pour la sélection des réactifs appropriés ; la sélection, la fixation et le traitement des tissus ; la préparation des lames IHC ; et l interprétation des résultats de coloration. 2. La coloration des tissus dépend de la manipulation et du traitement corrects des tissus avant la coloration. Les fixation, congélation, décongélation, lavage, séchage, chauffage, coupe inadaptés ou une contamination par d autres tissus ou fluides peuvent générer des artéfacts, un piégeage des anticorps ou des faux négatifs. Des résultats non cohérents peuvent être dus à des variations dans les méthodes de fixation et d inclusion ou à des irrégularités inhérentes au tissu. 3. Une contre-coloration excessive ou incomplète peut conduire à une interprétation erronée des résultats. 4. L interprétation clinique de toute coloration positive ou de son absence doit être effectuée dans le contexte de la présentation clinique, de la morphologie et d autres critères histopathologiques. L interprétation clinique de toute coloration, ou de son absence, doit être complétée par des études morphologiques et des contrôles appropriés ainsi que par d autres tests diagnostiques. L interprétation de la coloration est sous la responsabilité d un pathologiste qualifié devant être familiarisé avec les anticorps, les réactifs et les méthodes de coloration utilisés. La coloration doit être réalisée dans un laboratoire autorisé et certifié, sous le contrôle d un pathologiste, responsable de l examen des lames colorées et vérifiant la pertinence des contrôles positif et négatif. ( ) P04087EFG_01_K / p. 66/152

67 Cancer du sein 5. Les tissus de patients infectés par le virus de l hépatite B et porteurs de l antigène de surface de l hépatite B (HBsAg) peuvent présenter une coloration non spécifique avec la peroxydase de raifort (27). 6. Les réactifs peuvent présenter des réactions inattendues dans des types de tissus non testés précédemment. La possibilité de réactions inattendues même dans les types de tissus préalablement testés ne peut pas être complètement écartée, du fait de la variabilité biologique de l expression des antigènes dans les néoplasmes, ou autres tissus pathologiques (28). Contacter les services techniques de Dako et leur faire part de ces réactions inattendues et les documenter. 7. Des faux positifs peuvent être dus à une liaison non immunologique des protéines ou des produits de réaction du substrat. Ils peuvent aussi être causés par une activité pseudoperoxydasique (érythrocytes) ou par une activité peroxydasique endogène (cytochrome C) (28). 8. La procédure de coloration est réalisée à température ambiante, entre 20 et 25 C. Limites spécifiques au produit 1. L antigène présent dans la lignée cellulaire de contrôle MDA-175 d intensité 1+ se dégrade au fil du temps. Évaluer les résultats de la lame de contrôle en fonction de la date de péremption de cette dernière. Une coloration négative de cellules de la lignée MDA-175 peut juste indiquer une dégradation de la lame de contrôle. Les lames de contrôle doivent être conservées entre 2 et 8 C. 2. Des faux négatifs peuvent être dus à une dégradation de l antigène dans les tissus au fil du temps. Les échantillons doivent être colorés dans les 4 à 6 semaines suivant le montage des tissus sur les lames lorsqu ils sont conservés à température ambiante (20 à 25 C) (29). 3. Pour des résultats optimaux et reproductibles, la protéine HER2 exige une restauration de l épitope induite par la chaleur, sur des tissus fixés de la manière habituelle (formol neutre tamponné ou liquide de Bouin) et inclus en paraffine. Le prétraitement doit être effectué au début du processus de coloration. Voir les instructions à la section Préparation des échantillons, Traitement des tissus avant coloration. 4. La restauration de l épitope, induite par la chaleur, de la protéine HER2 ne doit être effectuée que dans un bain-marie étalonné. D autres méthodes de chauffage ont été testées sans générer de résultats reproductibles. 5. Ne pas remplacer les réactifs du kit par des réactifs portant d autres numéros de lot ou par des réactifs provenant d autres fabricants. La seule exception est le tampon de lavage qui peut être remplacé par le Dako Wash Buffer, réf. S Des faux peuvent provenir de l évaluation de la coloration cytoplasmique. Il ne faut tenir compte que de l intensité de la coloration de la membrane cellulaire lors de l interprétation des résultats. 7. Les lames de contrôle colorées doivent être utilisées uniquement pour la validation du cycle de coloration et non pour noter la réaction de coloration dans les coupes de tissus. 8. Une coloration focalisée forte (3+), à savoir des «points très marqués», peut parfois être observée. Cela peut être le résultat d une fixation et/ou d un traitement des tissus non homogènes. Il est recommandé de procéder à la coloration immunologique d un deuxième bloc de tissu provenant du même échantillon. 9. L utilisation d HercepTest sur des échantillons fixés à l aide de fixateurs autres que le formol neutre tamponné ou le liquide de Bouin n a pas été validée. 10. L épithélium sain dans les tissus mammaires doit être coloré entre 0 et 1+. Si une coloration de l épithélium sain supérieure à 1+ est observée, le test doit être répété. Il convient de noter que l épithélium sain de l amygdale et de l œsophage peut présenter une intensité de coloration allant jusqu à 2+. ( ) P04087EFG_01_K / p. 67/152

68 Cancer du sein Caractéristiques de performance Sein Contexte L essai clinique (CTA) utilisé pour identifier les patientes éligibles aux études cliniques Herceptin était conçu à des fins d investigation et n est plus disponible. HercepTest a été développé pour offrir une alternative comparable au CTA. La tolérance et l efficacité d Herceptin ont été évaluées lors d un essai clinique contrôlé et randomisé et lors d un vaste essai ouvert (Voir la notice du Herceptin ). Toutes les patientes sélectionnées pour les essais cliniques Herceptin ont présenté une surexpression de la protéine HER2 lors de tests immunocytochimiques réalisés avec le CTA par un laboratoire central. Les patientes étaient éligibles à un traitement par Herceptin si leur tumeur présentait des niveaux 2+ ou 3+ de surexpression de la protéine HER2 (sur une échelle de 0 à 3+,où 3+ représente le niveau le plus élevé). Une analyse en sous-groupes des résultats provenant de ces études suggère que les patientes dont les tissus sont fortement positifs (3+) à la surexpression de la protéine HER2 peuvent tirer un plus grand avantage de Herceptin que celles dont les tissus sont faiblement positifs (2+). Le degré de surexpression de la protéine HER2 peut s avérer être un indicateur important de l effet du traitement par Herceptin. Aucune des patientes enrôlées dans les essais Herceptin n ayant été sélectionnée à l aide du HercepTest, la corrélation entre le degré de positivité et l éventuel bénéfice clinique d un traitement par Herceptin n est pas connue. Études comparatives Deux études ont été réalisées pour caractériser le HercepTest. 1) Comparaison à l essai clinique (CTA). 2) Précision par rapport à cinq autres essais. Comparaison à l essai clinique (CTA) Le HercepTest a été comparé au CTA utilisé pour identifier les patientes éligibles à un traitement par Herceptin à l aide de 274 échantillons de tissus mammaires cancéreux positifs à la protéine HER2 (2+ ou 3+) et 274 échantillons négatifs à la protéine HER2. Le Tableau 4 présente les résultats dans un diagramme 2 x 2 où 0 et 1+ étaient considérés comme étant négatifs et 2+ et 3+ comme positifs. Tableau 4. Concordance 2 x 2 entre le HercepTest et l essai clinique (nombre d échantillons). Essai clinique Positif Négatif Total HercepTest Positif Négatif Total Concordance : 79 % (76 82%) intervalle de confiance à 95 %. La concordance binaire générale du HercepTest avec le CTA était de 79 % (431/548), avec un intervalle de confiance à 95 % pour les deux méthodes de 76 à 82 %. Ces deux méthodes ont donné 21 % de résultats discordants. Les résultats du HercepTest sont notés sur une échelle de 0 à 3+ et interprétés comme négatifs pour la surexpression de la protéine HER2 (intensité de coloration 0 et de 1+), faiblement positifs (intensité de coloration 2+) et fortement positifs (intensité de coloration 3+). ( ) P04087EFG_01_K / p. 68/152

69 Cancer du sein Tableau 5. Concordance 3 x 3 entre le HercepTest et l essai clinique. Essai clinique Total HercepTest Total Cette présentation 3 x 3 de l étude de concordance indique qu une lecture de 3+ sur le HercepTest correspond très probablement à un résultat positif sur le CTA, ce qui aurait répondu aux critères d enrôlement de l essai Herceptin (2+ ou 3+). Un résultat 2+ avec le test HercepTest ne correspond pas aussi bien aux résultats du CTA. Environ 42 % (53/126) des résultats 2+ avec le HercepTest étaient négatifs avec le CTA (0 1+), ce qui ne permettait pas l enrôlement dans les essais cliniques Herceptin. Précision HercepTest a également été testé sur 2 lames de microscope contenant des coupes de tissus inclus en paraffine provenant de 168 tumeurs mammaires. Ces tumeurs avaient été caractérisées précédemment par cinq méthodes différentes visant à déterminer l amplification du gène HER2 et la surexpression de la protéine HER2, à savoir un Southern blot réalisé en interne, une fluorescence par hybridation in situ (FISH) pour l amplification de l ADN, une analyse de l ARN obtenu par Northern blot, un Western blot, et une immunocytochimie (ICC) sur des tissus congelés (29). Les résultats sont présentés dans le Tableau 6. Tableau 6. Comparaison entre HercepTest et les résultats combinés (OE) provenant des tests d amplification génique et de surexpression de la protéine HER2. Classification OE de référence + - Total HercepTest Total Concordance positive : 43/69 = 62 % Concordance négative : 99/99 = 100 % Les résultats indiquaient un niveau de concordance de 85 % (142/168) (intervalle de confiance à 95 % de 78 à 89 %) entre l intensité de coloration positive (2+ et 3+) et négative (0 et 1+) obtenue avec le HercepTest. Aucun des échantillons négatifs par les 5 méthodes différentes ne s est avéré positif avec le HercepTest, alors que les résultats combinés pour les 5 méthodes différentes présentaient un nombre plus élevé de cas positifs. Reproductibilité Reproductibilité intra-cycle : la reproductibilité intra-cycle a été testée dans un laboratoire sur 5 échantillons présentant des notes d intensité immunocytochimique différentes. Chaque échantillon a été testé en triple lors d une étude randomisée et en aveugle. Ce protocole a été utilisé avec une coloration automatisée. Tous les échantillons ont donné des résultats reproductibles à 100 %. Reproductibilité inter-cycles : la reproductibilité inter-cycles a été testée par trois laboratoires sur 4 jours et 5 échantillons présentant des notes d intensité de coloration immunocytochimique différentes, randomisés et en aveugle, à l aide d une méthode automatisée. Une excellente reproductibilité a été observée pour les résultats positifs par rapport aux résultats négatifs (0 et 1+ contre 2+ et 3+) à l exception de deux échantillons dans un laboratoire, qui variaient entre 1+ et 2+. La reproductibilité était de 100 % pour les échantillons 2+ et 3+. ( ) P04087EFG_01_K / p. 69/152

70 Cancer du sein Reproductibilité inter-laboratoires : la reproductibilité inter-laboratoires a été testée dans trois laboratoires géographiquement éloignés sur 40 échantillons identiques randomisés et masqués présentant diverses notes d intensité de coloration immunocytochimique. Des lames de coupes récentes ont été envoyées à chaque laboratoire d analyse pour coloration automatisée et pour examen par un pathologiste. La concordance inter-laboratoires allait de 83% à 90 % pour une détermination dichotomique positive/négative où 0 et 1+ étaient négatifs et 2+ et 3+ étaient positifs à la surexpression de la protéine HER2. Par rapport aux résultats obtenus par le laboratoire de référence ayant effectué le CTA, 12,5 % (15/120) des résultats comparatifs divergeaient entre les déterminations négatives (0 ou 1+) et positives (2+ ou 3+). Par ailleurs, 10 % (12/120) divergeaient entre des notes de 2+ et 3+. Immunoréactivité Le Tableau 7 résume l immunoréactivité du HercepTest avec le panel de tissus sains recommandé. Tous les tissus ont été fixés au formol et inclus en paraffine puis colorés avec HercepTest, conformément aux instructions de la notice. Tableau 7. Résumé de la réactivité des tissus sains avec HercepTest. Type de tissus (nbre testés) Adrenal (3) Bone marrow (3) Brain/Cerebellum (3) Brain/Cerebrum (3) Breast (3) Cervix uteri (3) Colon (3) Esophagus (3) Heart (3) Kidney (3) Liver (3) Lung (3) Mesothelial cells (3) Ovary (3) Pancreas (3) Parathyroid (3) Peripheral nerve (3) Pituitary (3) Prostate (3) Salivary gland (3) Skeletal muscle (3) Skin (3) Small intestine (3) Spleen (3) Stomach (3) Testis (3) Thymus (3) Thyroid (3) Tonsil (3) Uterus (3) Coloration d éléments tissulaires positifs et schéma de coloration Mammary gland (1 of 3 tissues, 1+ staining intensity) Tubules of renal medulla (3 of 3 tissues, 1 2+ in 5 50% of cells, cytoplasmic) Prostate gland/ducts (3 of 3 tissues, 1+ staining intensity, 50% of cells, cytoplasmic) Sweat glands (1 of 3 tissues, 1+, 30% of cells, cytoplasmic) Columnar epithelium, surface (1 of 3 tissues, 2+ staining intensity, 25% of cells) Epithelium (1 of 3 tissues, 1+ staining intensity, 25% of cells) Squamous epithelium (3 of 3 tissues, 1+ staining intensity, 80% of cells) La coloration indiquée pour tous les tissus était membranaire, sauf indication contraire. Les trois échantillons de chaque type tissulaire présentaient la même intensité de coloration, sauf indication contraire. ( ) P04087EFG_01_K / p. 70/152

71 Cancer du sein Dépannage Sein Se référer à la section Dépannage du Manuel Dako mentionné précédemment (19) pour connaître les actions correctives, ou contacter les services techniques de Dako pour signaler toute coloration inhabituelle. Problème Cause probable Mesure suggérée 1. Coloration d aucune lame 2. Coloration faible des lames. 2. Coloration faible des lames. 1a. Erreur de programmation. Les réactifs n ont pas été utilisés dans l ordre 1b. Les flacons de réactifs n ont pas été chargés à leur emplacement correct dans les portoirs de réactif 1c. Pas assez de réactif dans le lacon 1d. Azide de sodium dans la solution de lavage 1e. Un chauffage excessif des coupes de tissus montées avant déparaffinage et démasquage des antigènes par la chaleur peut entraîner une perte de l immunoréactivité visible de la protéine HER2. 2a. Mauvaise restauration de l épitope 2b. Durées d incubation des réactifs inadéquates 1a. Vérifier la grille de programmation pour s assurer que le cycle de coloration a été programmé correctement 1b. Vérifier la carte des réactifs pour s assurer que les réactifs sont placés correctement 1c. Veiller à charger assez de réactif dans les flacons avant de lancer le cycle. Consulter la carte des réactifs pour les volumes nécessaires. 1d. Utiliser une préparation fraîche de tampon de lavage, fournie dans le kit 1e. Laisser sécher les coupes de tissus à l air libre et à température ambiante pendant au moins 12 heures ou jusqu à ce qu ils soient secs. Autre possibilité : laisser sécher toute une nuit à 37 C ou à 60 C pendant une heure maximum. Le séchage des coupes de tissus à des températures élevées doit être réalisé uniquement dans une étuve étalonnée, offrant une répartition uniforme de la chaleur (17). 2a. Vérifier que la solution de restauration de l épitope atteigne une température de 95 à 99 C durant 40 minutes pleines, et laisser refroidir pendant 20 minutes supplémentaires 2b. Revoir les instructions de la procédure de coloration 2c. Méthode de fixation inappropriée 2c. S assurer que le tissu du patient n est pas fixé de manière excessive et qu un autre fixateur n a pas été utilisé 2d. Un chauffage excessif des coupes de tissus montées avant déparaffinage et démasquage des antigènes par la chaleur peut entraîner une diminution marquée de l immunoréactivité visible de la protéine HER2. 2e. Volume de réactifs appliqué insuffisant. 2d. Laisser sécher les coupes de tissus à l air libre et à température ambiante pendant au moins 12 heures ou jusqu à ce qu ils soient secs. Autre possibilité : laisser sécher toute une nuit à 37 C ou à 60 C pendant une heure maximum. Le séchage des coupes de tissus à des températures élevées doit être réalisé uniquement dans une étuve étalonnée, offrant une répartition uniforme de la chaleur (17) 2e. Vérifier la taille de la coupe de tissu (22 mm x 22 mm) et le volume de réactifs appliqué. ( ) P04087EFG_01_K / p. 71/152

72 3. Coloration de fond excessive des lames 3a. Elimination incomplète de la paraffine Cancer du sein 3a. Utiliser des solutions de rinçage fraîches et suivre la procédure indiquée à la section B.1 4. Le tissu se détache des lames. 5. Coloration spécifique trop forte 6. Faible coloration de la lignée cellulaire de la lame de contrôle 1+ 3b. De l amidon a été utilisé comme additif lors du montage des coupes sur les lames 3c. Les lames ne sont pas bien rincées 3d. Les coupes ont séché au cours de la procédure de coloration 3e. Les coupes ont séché au cours de leur chargement sur l Autostainer 3b. Éviter d utiliser de l amidon comme additif pour faire adhérer les coupes aux lames de verre. De nombreux additifs sont immunoréactifs 3c. Veiller à correctement amorcer l Autostainer avant d exécuter un cycle. S assurer que le tampon approprié est fourni en quantité suffisante pour l ensemble du cycle. Utiliser des solutions fraîchement préparées de tampons et de lavage 3d. Vérifier que le volume de réactif approprié est appliqué sur les lames. S assurer que le capot de l Autostainer est fermé et que le réactif n est pas exposé à une chaleur excessive ou à un tirage 3e. Veiller à ce que les coupes soient humidifiées par du tampon et le restent durant le chargement et avant de lancer le cycle 3f. Méthode de fixation inappropriée 3f. S assurer que le fixateur approuvé a été utilisé. Un autre fixateur peut provoquer une coloration de fond excessive 3g. Liaison non spécifique des réactifs aux tissus 3g. Vérifier la méthode de fixation de l échantillon et la présence de nécrose 4a. Utilisation de lames inadéquates 4a. Utiliser des lames silanisées, telles les Dako Silanized Slides, (réf. S3003), SuperFrost Plus ou des lames enduites de poly-l-lysine 5a. Méthode de fixation inappropriée 5a S assurer que seuls des fixateurs et des méthodes de fixation approuvés ont été utilisés 5b. Utilisation d une source de chaleur inappropriée pour la restauration de l épitope, par ex., autocuiseur, four à microondes ou autoclave 5c. Durées d incubation des réactifs trop longues 5d. Une solution de lavage inappropriée a été utilisée 6a. Mauvais protocole de restauration de l épitope 5b. Veiller à utiliser un bain-marie pour l étape de restauration de l épitope 5c. Revoir les instructions de la procédure de coloration 5d. N utiliser que le tampon de lavage recommandé pour le kit 6a. Immerger les lames dans une solution de restauration de l épitope préchauffée. Ramener la solution de restauration de l épitope à une température de 95 à 99 C et préchauffer durant 40 minutes pleines ( ) P04087EFG_01_K / p. 72/152

73 Cancer du sein 7. Restauration de l épitope La solution est trouble lorsqu elle est chauffée 8. Restauration de l épitope La solution est trouble lors de sa conservation (avant de la chauffer) 6b. Manque de réaction à la solution de substrat chromogène (DAB) 6c. Dégradation de la lame de contrôle 7. Lorsqu elle est chauffée, la solution prend un aspect trouble 8. La solution n a pas été correctement conservée ou bien la date de péremption de la solution est dépassée 6b. Veiller à procéder à une incubation durant 10 minutes pleines. Veiller à n ajouter qu une goutte de chromogène DAB à 1 ml de substrat tamponné DAB 6c. Vérifier la date de péremption et les conditions de conservation du kit indiquées sur la boîte 7. Ceci est normal et n affecte pas la coloration 8. Vérifier la date de péremption et les conditions de conservation du kit indiquées sur la boîte. Jeter la solution de restauration de l épitope REMARQUE : si le problème ne peut pas être attribué à l une des causes ci-dessus, ou si la mesure préconisée ne parvient pas à le résoudre, contacter les services techniques de Dako. Pour plus d informations sur les techniques de coloration et la préparation des échantillons, consulter le Manuel (19) Dako mentionné précédemment (disponible auprès de Dako), et les ouvrages Atlas of Immunohistology (30) et Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04087EFG_01_K / p. 73/152

74 Cancer de l estomac Résumé et explication Estomac Contexte Le gène HER2 humain (également appelé ERBB2 ou NEU) code une protéine souvent appelée protéine HER2 ou p185 HER2. La protéine HER2 est une tyrosine kinase des récepteurs membranaires présentant une homologie avec le récepteur du facteur de croissance épidermique (RFCE ou HER1) (1-8). La protéine HER2 est un composant normal exprimé par un grand nombre de types de cellules épithéliales (8). La surexpression de la protéine HER2 et l amplification du gène HER2 dans le cancer gastrique ont été démontrées dans un grand nombre d études. La positivité à la HER2 peut être détectée dans environ 20% des patients par ICH ou FISH (32). Des études précliniques in vitro et in vivo ont mis en évidence l efficacité du trastuzumab (Herceptin ) dans divers types de cancers de l estomac, conduisant ainsi à la réalisation de plusieurs études cliniques (32-36). Dans une étude de phase III BO18255, l essai ToGA, des patients positifs à la HER2 atteints d adénocarcinomes de l'estomac ou de la jonction gastro-œsophagienne localement avancés, inopérables, récidivants et/ou métastasiques ont reçu de manière aléatoire du 5-FU ou de la capécitabine et de la cisplatine, seuls ou en association avec du trastuzumab. Un accroissement statistiquement significatif de la survie globale (SG) a été observé chez les patients ayant reçu un traitement combiné de trastuzumab et de chimiothérapie (37). Le trastuzumab est un anticorps monoclonal humanisé qui se lie avec une forte affinité à la protéine HER2 et s est avéré inhiber la prolifération des cellules tumorales humaines qui surexpriment la protéine HER2 in vitro et in vivo (33-36). Caractéristiques Le statut de HER2 de 3803 patients a été établi pour inclusion à l'étude ToGA. Dans cette étude, la surexpression de la protéine HER2 (HercepTest, Dako) et l amplification du gène HER2 déterminée par FISH (HER2 FISH pharmdx, Dako) ont été mesurées. Des résultats de test valides ont été obtenus pour 3665 échantillons avec le test IHC ou le test FISH et pour 3280 échantillons avec les deux tests. Les résultats de l étude ToGA ont montré que 22,1 % des patients atteints de cancer gastrique avancé étaient positifs à la HER2 détectée par IHC ou FISH conformément à la définition des critères de sélection ToGA HER2 (38). Concernant l utilisation du test HercepTest dans l évaluation des patients pour qui l on envisage un traitement par trastuzumab, consulter la notice de l Herceptin pour davantage d informations. Principe de la procédure Estomac HercepTest contient les réactifs requis pour effectuer une procédure de coloration immunocytochimique en deux étapes pour des échantillons inclus en paraffine et traités en routine. Après incubation avec l anticorps primaire de lapin dirigé contre la protéine HER2 humaine, ce kit utilise le réactif de visualisation prêt à l emploi à base de dextrane. Ce réactif comporte des molécules d immunoglobuline secondaire de chèvre anti-lapin et des molécules de peroxydase de raifort liées à une chaîne polymère de dextrane commune, ce qui permet d éliminer l application séquentielle d un anticorps de liaison et d un anticorps conjugué à de la peroxydase. La réaction croisée du réactif de visualisation avec les immunoglobulines humaines et le sérum fœtal de veau a été éliminée par absorption en phase solide. La conversion enzymatique du chromogène ajouté par la suite entraîne la formation d un produit de réaction visible sur le site de l antigène. L échantillon peut alors être contre-coloré et recouvert d une lamelle de protection. Un microscope optique est utilisé pour l interprétation ( ) P04087EFG_01_K / p. 74/152

75 Cancer de l estomac des résultats. Des lames de contrôle contenant trois lignées cellulaires de cancer de sein humain fixées au formol et incluses en paraffine avec des notes d intensité de coloration de 0, 1+ et 3+ sont fournies pour valider les cycles de coloration. L intensité de coloration de ces trois lignées cellulaires a été corrélée au nombre de récepteurs par cellule. Le test HercepTest, réf. K5207, peut être utilisé pour la coloration automatisée sur l Autostainer. Réactifs Estomac Matériel fourni Le matériel indiqué permet d effectuer 50 tests (50 lames incubées avec l anticorps primaire dirigé contre la protéine HER2 et 50 lames incubées avec le réactif de contrôle négatif correspondant). Le nombre de tests correspond à l utilisation, pour chaque coupe de tissu (22 mm x 22 mm), de 200 µl des flacons 1, 2, 3 et 4, et de la solution de substrat chromogène (DAB). Le kit fournit la quantité suffisante de matériels pour un maximum de 15 cycles de coloration. Flacon nº Quantité Description 1 2 x 11 ml 2 1 x 12 ml 3 2 x 11 ml 4 1 x 12 ml 5 15 x 11 ml Peroxidase-Blocking Reagent : réactif inhibiteur de la peroxydase constitué de peroxyde d hydrogène à 3 % contenant 15 mmol/l d azide de sodium ((NaN 3 ). Rabbit Anti-Human HER2 Protein : anticorps de lapin antiprotéine HER2 humaine, isolé par affinité prêt à l emploi. Fourni sous forme de tampon Tris/HCl à 0,05 mol/l, de NaCl à 0,1 mol/l, de NaN 3 à 15 mmol/l, de ph 7,2, contenant une protéine stabilisante. Immunogène : le fragment C-terminal de synthèse (partie intracytoplasmique) de la protéine HER2 couplée à de l hémocyanine de patelle. Spécificité : protéine HER2. Méthode de purification : l anticorps est isolé par affinité en utilisant un peptide de protéine HER2 immobilisé. Visualization Reagent : réactif de visualisation constitué de polymère de dextrane conjugué à la peroxydase de raifort et des immunoglobulines anti-lapin de chèvre isolées par affinité. Fourni dans un tampon Tris-HCl contenant une protéine stabilisante et un agent antimicrobien. Negative Control Reagent : réactif de contrôle négatif, constitué d une fraction d immunoglobuline de sérum de lapin normal à une concentration en protéine équivalente comme anticorps dirigé contre la protéine HER2. Fourni sous forme de tampon Tris/HCl à 0,05 mol/l, de NaCl à 0,1 mol/l, de NaN 3 à 15 mmol/l, de ph 7,2, contenant une protéine stabilisante. DAB Buffered Substrate : substrat tamponné DAB, constitué d une solution tampon de substrat, ph 7,5, contenant moins de 0,1 % de peroxyde d hydrogène, des stabilisants, des amplificateurs et un agent antimicrobien. ( ) P04087EFG_01_K / p. 75/152

76 6 3 x 3 ml 7 3 x 500 ml 8 2 x 1 L 3 x 5 lames Cancer de l estomac DAB Chromogen : chromogène DAB constitué d une solution chromogène de 3,3 -diaminobenzidine tétrachlorhydrate à 5 %. Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x) : solution de restauration de l épitope constituée de tampon citrate à 0,1 mol/l contenant un détergent. Wash Buffer (10x) : tampon de lavage constitué d un tampon Tris/HCl contenant un détergent et un agent antimicrobien. Control Slides : chaque lame de contrôle contient des coupes de trois lignées cellulaires de carcinome mammaire fixées au formol et incluses en paraffine représentant différents niveaux d expression de la protéine HER2 : MDA-231 (0), MDA-175 (1+) et SK-BR-3 (3+). Les lames de contrôle ont été traitées à la chaleur pour une meilleure adhérence des coupes aux lames de verre. Tout autre traitement par la chaleur des lames de contrôle effectué en vue d améliorer l adhérence des coupes aux lames de verre peut compromettre les résultats de coloration. REMARQUE : les formules de tous les réactifs, y compris de la solution de restauration de l épitope et du tampon de lavage, sont spécifiques à leur utilisation avec ce test. Pour que le test fonctionne comme indiqué, aucune substitution ne doit être effectuée, sauf pour le tampon de lavage, pour lequel le produit Dako réf. S3006 peut être utilisé. Matériel requis mais non fourni Hydroxyde d ammonium, 15 mol/l dilué à 37 mmol/l Contre-colorant : hématoxyline, comme le produit Mayer s Hematoxylin, Dako réf. S3301 (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, A.4) Lamelles de protection Eau distillée ou dé-ionisée (eau de lavage) Étuve de séchage, capable de conserver une température de 60 C maximum Éthanol, absolu et à 95 % Microscope optique (grossissement de 4x à 40x) Milieu de montage, de type Dako Faramount, réf. S3025 ou Glycergel, réf. C0563 Tissus positifs et négatifs à utiliser comme contrôles du processus (voir la section Contrôle de qualité) Lames, SuperFrost Plus, enduites de poly-l-lysine ou Dako Silanized Slides (réf. S3003), (voir Préparation des échantillons) Cuves ou bains de coloration Minuteur (avec une capacité de 2 à 40 min) Bain-marie avec couvercle (capable de maintenir la température de la solution de restauration de l épitope entre 95 et 99 C) Xylène, toluène ou substituts de xylène ( ) P04087EFG_01_K / p. 76/152

77 Cancer de l estomac Le produit réf. K5207 a été spécialement conçu pour être utilisé avec le système d immunocoloration Autostainer, réf. S3400. Consulter le guide d utilisation de l Autostainer à propos des éléments Autostainer nécessaires. Conservation Estomac Conserver entre 2 et 8 C. Ne pas utiliser après la date de péremption du kit indiquée sur l emballage. Si les réactifs sont conservés dans des conditions autres que celles indiquées, celles-ci doivent être validées par l utilisateur (14a,14b). Les lames de contrôle doivent être conservées entre 2 et 8 C. Aucun signe visible n indique l instabilité du produit. Par conséquent, les contrôles positifs et négatifs doivent être testés en même temps que les échantillons de patient. Si une coloration inattendue est observée, ne pouvant être expliquée par un changement des procédures du laboratoire et en cas de suspicion d un problème lié à HercepTest, contacter immédiatement les services techniques de Dako. Préparation des échantillons Estomac Les échantillons d adénocarcinomes gastriques, notamment de la jonction gastroœsophagienne, issus de biopsies, d excisions ou de résections doivent être correctement manipulés de manière à préserver les tissus en vue d une coloration immunocytochimique. Des méthodes standard de traitement des tissus doivent être utilisées pour tous les échantillons (15). Lors du test de petits échantillons de biopsie, s assurer de disposer de la morphologie tumorale intacte et de la présence de suffisamment de cellules tumorales pour l évaluation IHC. Si l analyse HercepTest est réalisée sur un échantillon issu d une biopsie, il faut, pour assurer une détermination fiable du statut de HER2, analyser plusieurs échantillons de biopsies évaluables (7 à 8) provenant de différentes régions de la tumeur. Coupes incluses en paraffine Seuls les tissus préservés dans du formol tamponné neutre et ceux inclus en paraffine conviennent à cet usage. Les échantillons doivent par exemple être coupés en blocs de 3 à 4 mm d épaisseur et fixés durant 18 à 24 heures dans du formol neutre tamponné. Les échantillons de biopsies ont été fixés pendant 6 à 8 heures lors de l etude ToGA (pour des détails sur l étude, se reporter à la référence (37)). Les tissus sont ensuite déshydratés dans différents bains d alcools et de xylène, puis infiltrés dans de la paraffine fondue conservée à 60 C maximum. Les tissus exprimant la protéine HER 2, inclus et fixés correctement, peuvent être conservés indéfiniment avant la coupe et le montage des lames s ils sont conservés dans un endroit frais (entre 15 et 25 C) (15,16). Aux É tats-unis, le «Clinical Laboratory Improvement Act of 1988» (Loi sur l amélioration des pratiques cliniques en laboratoire de 1988) stipule dans son article 42 CFR (b) que «Le laboratoire doit conserver les lames colorées pendant au moins dix ans après la date de l examen et les blocs d échantillons pendant au moins deux ans à compter de la date d examen» (16). Les échantillons tissulaires doivent être coupés en tranches de 4 à 5 µm, montés sur lame et séchés à l air libre pendant au moins 12 heures (ou jusqu à ce qu ils soient secs) à température ambiante, ou toute une nuit à 37 C ou encore penda nt une heure à 60 C. ATTENTION : un chauffage excessif pendant plus d une heure à 60 C ou plus peut entraîner une perte ou une diminution marquée de l immunoréactivité spécifique de la protéine HER2 associée à la membrane (17). Afin de conserver l antigénicité, les coupes de tissu, montées sur les lames (SuperFrost Plus, lames enduites de poly-l-lysine, lames silanisées), doivent être colorées dans les 4 à 6 semaines suivant la coupe lorsqu elles sont conservées à température ambiante (entre 20 et 25 C) (18). Les lames nécessaires pour l évaluatio n de la protéine HER2 et la vérification de la ( ) P04087EFG_01_K / p. 77/152

78 Cancer de l estomac présence d une tumeur doivent être préparées au même moment. Il est recommandé d utiliser au moins 5 lames : 1 lame pour la présence d une tumeur, 2 lames pour l évaluation de la protéine HER2 (une lame pour incubation avec le flacon nº 2 et une pour incubation avec le flacon nº 4) et 2 lames de secours. L utilisation du HercepTest TM sur des tissus décalcifiés n a pas été validée et n est pas recommandée. Consulter le Manuel Dako «Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods» (Méthodes de coloration immunohistochimique) (19) et les références 15 et 16 pour plus de détails sur la préparation des échantillons. Traitement des tissus avant coloration Une méthode spécifique de restauration de l épitope dans un tampon citrate à 10 mmol/l doit être utilisée pour obtenir des performances de dosage optimales. La solution de restauration de l épitope est fournie dans le kit HercepTest. Cette méthode implique le chauffage des coupes de tissus montées sur les lames et leur immersion dans un tampon citrate à 10 mmol/l (20), dans un bain-marie étalonné, capable de maintenir la température requise de la solution de restauration de l épitope (entre 95 et 99 C). L es laboratoires situés en altitude doivent déterminer la meilleure méthode pour maintenir la température requise dans le bain-marie. La restauration de l épitope doit être réalisée dans un bain-marie. D autres méthodes de chauffage ont été testées sans générer de résultats reproductibles. Commencer la procédure de coloration immédiatement après la restauration de l épitope. Tout écart par rapport à la procédure décrite peut affecter les résultats. Précautions Estomac 1. Pour diagnostic in vitro. 2. Pour utilisateurs professionnels. 3. Le flacon 1 de réactif d inhibition de la peroxydase contient 3 % de peroxyde d hydrogène. La fiche technique de sécurité destinée aux utilisateurs professionnels est disponible sur demande. 4. Le flacon 6 de chromogène DAB contient 5 - <10 % tétrachlorure de biphényle-3,3',4,4'- tétrayltétraammonium et est étiqueté : H350 H341 P201 P280 Danger P308 + P313 P405 P501 Peut provoquer le cancer. Susceptible d'induire des anomalies génétiques. Se procurer les instructions avant utilisation. Porter des gants de protection. Porter un équipement de protection des yeux ou du visage. Porter des vêtements de protection. EN CAS d exposition prouvée ou suspectée: Consulter un médecin. Garder sous clef. Éliminer le contenu et le récipient en conformité avec toutes réglementations locales, régionales, nationales, et internationales. D'une manière générale, les personnes âgées de moins de 18 ans ne sont pas autorisées à utiliser ce produit. Les utilisateurs doivent être formés aux procédures de travail adéquates, aux propriétés dangereuses du produit et aux instructions de sécurité nécessaires. Se reporter à la fiche de données de sécurité pour plus d'informations. ( ) P04087EFG_01_K / p. 78/152

79 Cancer de l estomac 5. Le flacon 8 de tampon de lavage Wash Buffer (10x), contient 5-<10% 2-Amino-2- (hydroxyméthyl) propane-1,3-diol, chlorhydrate et 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxanne. Peut déclencher une réaction allergique. Le flacon 8, Wash buffer (10x), est étiqueté : Attention H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Provoque une sévère irritation des yeux. Porter un équipement de protection des yeux ou du visage. Se laver les mains soigneusement après manipulation. EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX: Rincer avec précaution à l eau pendant plusieurs minutes. Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer. 6. Ce produit contient de l azide de sodium (NaN 3 ), produit chimique hautement toxique dans sa forme pure. Aux concentrations du produit, bien que non classé comme dangereux, l azide de sodium peut réagir avec le cuivre et le plomb des canalisations pour former des azides de métal hautement explosifs. Lors de l élimination, rincer abondamment à l eau pour éviter toute accumulation d azide métallique dans les canalisations (21, 22). 7. Les flacons 2, 3 et 4 contiennent des produits d origine animale. Comme avec tout produit d origine biologique, des procédures de manipulation appropriées doivent être respectées. 8. Les échantillons et les lames de contrôle, avant et après fixation, et tous les matériels en contact avec ceux-ci, doivent être manipulés comme s ils étaient susceptibles de transmettre une infection et jetés en prenant les précautions appropriées (23). Ne pas pipeter les réactifs à la bouche et éviter tout contact de la peau et des muqueuses avec les réactifs et les échantillons. Si les réactifs entrent en contact avec des zones sensibles, laver abondamment à l eau. 9. Minimiser tout risque de contamination microbienne des réactifs afin d éviter une coloration non spécifique. 10. Toute durée, température ou méthode d incubation autres que celles indiquées peuvent entraîner des résultats erronés. Un séchage excessif pendant plus d une heure à 60 C ou plus peut entraîner une perte ou une diminution marquée de l immunoréactivité spécifique de la protéine HER2 associée à la membrane (17). 11. Les réactifs sont à la dilution optimale. Une dilution supplémentaire peut entraîner une perte de coloration des antigènes. 12. Les formules de tous les réactifs, y compris de la solution de restauration de l épitope et du tampon de lavage, sont spécifiques à leur utilisation avec ce test. Pour que le test fonctionne comme indiqué, aucune substitution ne doit être effectuée, sauf pour le tampon de lavage, pour lequel le produit Dako réf. S3006 peut être utilisé. 13. Le réactif de visualisation et le Chromogène DAB peuvent être affectés négativement en cas d exposition à une luminosité élevée. Ne pas stocker les composants du kit ni effectuer de coloration sous une lumière vive, telle la lumière directe du soleil. 14. Porter un équipement de protection approprié pour éviter tout contact avec les yeux et la peau. Se reporter à la fiche des données de sécurité (FDS) pour plus d informations. 15. Les résidus de paraffine peuvent produire des faux négatifs. 16. Pour une interprétation correcte des résultats du test HercepTest sur des échantillons de biopsies provenant d adénocarcinomes de l estomac, y compris de la jonction gastroœsophagienne, il est recommandé de disposer d un groupe d au moins 5 cellules tumorales colorées. Un groupe d'au moins 5 cellules tumorales colorées correspond à 5 cellules tumorales HER2 colorées et reliées. ( ) P04087EFG_01_K / p. 79/152

80 Cancer de l estomac 17. En raison de la nature hétérogène des échantillons de biopsies de cancers gastriques, il est important de réaliser un test IHC HER2 sur plusieurs pièces (7 à 8) de biopsie provenant de différentes régions de la tumeur afin d obtenir un résultat fiable. 18. L emploi de volumes de réactifs autres que ceux recommandés peut entraîner une perte d immunoréactivité visible de la protéine HER2. Les coupes de tissu supérieures à 22 mm x 22 mm nécessitent d appliquer 2 à 3 fois 200 µl de réactifs sur 2 ou 3 zones d application automatisée. 19. Il est recommandé de tester plusieurs blocs de tissu provenant de résections de cancer de l'estomac lorsque l'échantillon présente un haut niveau d'hétérogénéité (41). ( ) P04087EFG_01_K / p. 80/152

81 Cancer de l estomac INSTRUCTIONS D UTILISATION Estomac A. Préparation des réactifs Il est pratique de préparer les réactifs suivants avant la coloration : A.1 Solution de restauration de l épitope À l aide d eau distillée ou dé-ionisée, diluer une quantité suffisante du flacon 7 (solution de restauration de l épitope 10x) au 1:10 pour la procédure de coloration prévue. La solution diluée inutilisée peut être conservée à 2 8 C pend ant un mois. Jeter la solution diluée si elle a un aspect trouble. A.2 Tampon de lavage À l aide d eau distillée ou dé-ionisée, diluer une quantité suffisante du flacon 8 (tampon de lavage 10x) au 1:10, pour les étapes de lavage. Le tampon inutilisé peut être conservé à 2 8 C pendant un mois. Jeter le tampon s il semble trouble. L Autostainer est programmé pour rincer les coupes tissulaires après le réactif d inhibition de la peroxydase et la solution de substrat chromogène. Il convient de noter que l on peut utiliser de l eau distillée (ou dé-ionisée) ou du tampon de lavage pour ces étapes de rinçage. Du tampon de lavage doit être utilisé pour toutes les autres étapes de rinçage. A.3 Solution de substrat chromogène (DAB) Préparer la solution de substrat chromogène en ajoutant 11 gouttes (25 à 30 µl par goutte) de chromogène DAB du flacon 6 dans le flacon 5 contenant le substrat tamponné DAB (11 ml) puis mélanger. La solution de substrat chromogène (DAB) préparée est stable pendant environ 5 jours lorsqu elle est conservée entre 2 et 8 C. Cette solution doit être bien mélangée avant utilisation. La formation d un précipité dans la solution n affecte pas la qualité de la coloration. REMARQUE : la couleur du chromogène DAB du flacon 6 peut varier de transparent à lavandemarron clair. Cela n affecte en rien les performances de ce produit. La dilution doit être effectuée conformément aux instructions de la présente notice. L ajout d une quantité trop importante de chromogène DAB dans le tampon substrat DAB entraîne une détérioration du signal positif. A.4 Contre-colorant Le produit final de la réaction de coloration au DAB n est soluble ni dans l alcool ni dans l eau. Utiliser une contre-coloration à l hématoxyline et ajuster l intensité de la coloration à l hématoxyline au niveau indiqué dans l ouvrage intitulé «HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer» (Manuel d interprétation du test HercepTest Cancer de l estomac) de Dako. Il est possible d utiliser de l hématoxyline, à base d alcool ou d eau, comme la Dako Mayer s Hematoxylin, réf. S3301. Faire suivre la contre-coloration à l hématoxyline par un rinçage abondant à l eau distillée ou dé-ionisée, puis immerger les lames dans un bain de solution aqueuse d ammoniaque à 37 mmol/l (voir section B.2, étape 3). La solution aqueuse d ammoniaque (à 37 mmol/l) est préparée en mélangeant 2,5 ml d hydroxyde d ammonium à 15 mol/l avec 1 litre d eau distillée ou dé-ionisée. La solution aqueuse d ammoniaque à 37 mmol/l inutilisée peut être conservée à température ambiante (entre 20 et 25 C) durant 12 mois, dans un flacon hermétiquement fermé. A.5 Milieu de montage L utilisation d un milieu de montage permanent non aqueux est recommandée. Cependant, un milieu de montage aqueux peut également être utilisé. Les milieux de montage de Dako, Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use, réf. S3025 ou Glycergel Mounting Medium, réf. C0563, sont recommandés pour le montage aqueux. Liquéfier le Glycergel en le chauffant à environ 40 C (±5 C) avant utilisat ion. ( ) P04087EFG_01_K / p. 81/152

82 B. Procédure de coloration sur l Autostainer Cancer de l estomac B.1 Remarques sur la procédure L utilisateur doit lire attentivement les présentes instructions et se familiariser avec tous les composants et instruments avant utilisation (voir la section Précautions). Tous les réactifs doivent être ramenés à température ambiante (entre 20 et 25 C) avant de procéder à l immunocoloration. De la même manière, toutes les incubations doivent être effectuées à température ambiante. Ne pas laisser les coupes tissulaires sécher durant le chargement des lames sur l Autostainer et durant la procédure de coloration. Les coupes tissulaires desséchées peuvent présenter une coloration non spécifique plus importante. Si la procédure de coloration doit être interrompue, les lames peuvent être conservées dans un bain de tampon après incubation de l anticorps primaire, jusqu à une heure à température ambiante (20 25 C), sans que cela affecte les perf ormances de coloration. Déparaffinage et réhydratation : avant la coloration, les lames de tissu doivent être déparaffinées afin d éliminer le milieu de montage, puis réhydratées. Éviter toute élimination incomplète de la paraffine. Les résidus de milieu d inclusion provoquent un accroissement du nombre de colorations non spécifiques. Cette étape doit être exécutée à température ambiante (20 25 C). 1. Placer les lames dans un bain de xylène et laisser incuber pendant 5 (±1) minutes. Changer les bains et répéter l opération une fois. 2. Tapoter afin d éliminer l excès de liquide et placer les lames dans de l éthanol absolu pendant 3 minutes (±1 minute). Changer les bains et répéter l opération une fois. 3. Tapoter afin d éliminer l excès de liquide et placer les lames dans de l éthanol à 95 % pendant 3 minutes (±1 minute). Changer les bains et répéter l opération une fois. 4. Tapoter afin d éliminer l excès de liquide et placer les lames dans de l eau distillée ou dé-ionisée pendant au moins 30 secondes. Commencer la procédure de coloration comme indiqué à la section B.2, Étape 1, restauration de l épitope. Les solutions de xylène et d alcool doivent être renouvelées toutes les 40 lames. Du toluène ou des substituts de xylène, comme l Histoclear, peuvent être utilisés à la place du xylène. REMARQUE : les réactifs et les instructions fournis dans cette trousse ont été conçus pour des performances optimales. Une dilution supplémentaire des réactifs ou une modification des températures d incubation peuvent entraîner des résultats erronés ou discordants. Des différences dans le traitement des tissus et les procédures techniques au sein du laboratoire de l utilisateur peuvent invalider les résultats de l essai utilisés pour la sélection des patients devant être traités par Herceptin. B.2 Protocole de coloration Exécuté à température ambiante entre 20 et 25 C. Étape 1 : restauration de l épitope Remplir les cuves, par ex., cuves de Coplin, de solution de restauration de l épitope diluée (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, section A.1). Placer les cuves de coloration contenant la solution de restauration de l épitope diluée dans un bain-marie. Faire chauffer le bain-marie et la solution de restauration de l épitope entre 95 et 99 C. Lors du chauffage, la solution de restauration de l épitope prend un aspect trouble. Couvrir les cuves pour stabiliser la température et éviter toute évaporation. Immerger les coupes déparaffinées et amenées à température ambiante dans la solution de restauration de l épitope préchauffée dans les cuves de coloration. RAMENER LA TEMPÉRATURE DU BAIN-MARIE ET DE LA SOLUTION DE RESTAURATION DE L ÉPITOPE ENTRE 95 ET 99 C. Incuber pendant 40 (±1) minutes entre 95 et 99 C. ( ) P04087EFG_01_K / p. 82/152

83 Cancer de l estomac Retirer la cuve contenant les lames du bain-marie. Laisser les lames refroidir dans la solution de restauration de l épitope pendant 20 (±1) minutes à température ambiante. Faire décanter la solution de restauration de l épitope et rincer les coupes avec du tampon de lavage (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, Section A.2). Pour des performances optimales, laisser tremper les coupes dans le tampon de lavage pendant 5 à 20 minutes après restauration de l épitope et avant coloration. REMARQUE : la solution de restauration de l épitope est conçue pour une application unique. Ne pas réutiliser. Étape 2 : procédure sur l Autostainer 1. Consulter les durées de programme et les volumes de réactif nécessaires (voir le point 4 ci-dessous pour les volumes spécifiques) sur la carte produite par l Autostainer sur le programme automatique HercepTest. 2. Placer les flacons de réactifs de l Autostainer sur le portoir de réactifs de l automate conformément à la carte des réactifs établie par l ordinateur. 3. Charger les lames sur l Autostainer conformément à la carte des lames, établie par l ordinateur. 4. Paramétrer le programme et lancer le programme HercepTest. Voici une description rapide du cycle de programme : Rincer 200 µl de réactif inhibiteur de la peroxydase 5 minutes Rincer 200 µl d anticorps primaire anti-protéine HER2 (ou réactif de contrôle négatif) 30 minutes Rincer 200 µl de réactif de visualisation 30 minutes Rincer Rincer Transférer 200 µl de solution de substrat chromogène (DAB) 10 minutes Rincer les lames à l eau dé-ionisée après l étape du substrat chromogène REMARQUE : l automate Autostainer version 01 rince les lames dans un tampon. Par conséquent, il faut rincer les lames à l eau dé-ionisée après les avoir sorties de l Autostainer. Étape 3 : contre-coloration (instructions données pour l hématoxyline) Retirer les lames de l Autostainer et effectuer une contre-coloration à l hématoxyline comme indiqué ci-dessous. Immerger les lames dans un bain d hématoxyline. Incuber durant 2 à 5 minutes, en fonction de la concentration de l hématoxyline utilisée. Rincer doucement dans un bain d eau distillée ou dé-ionisée. Veiller à éliminer toute hématoxyline résiduelle. Facultatif : plonger 10 fois les lames dans un bain de solution aqueuse d ammoniaque à 37 mmol/l (voir section a.4). Rincer doucement les lames dans un bain d eau distillée ou dé-ionisée durant 2 à 5 minutes. REMARQUE : en fonction de la durée de l incubation et de la puissance de l hématoxyline utilisée, la contre-coloration entraînera une coloration bleu clair à bleu ( ) P04087EFG_01_K / p. 83/152

84 Cancer de l estomac foncé des noyaux cellulaires. Une contre-coloration excessive ou incomplète peut conduire à une interprétation erronée des résultats. Étape 4 : montage L utilisation d un milieu de montage permanent non aqueux est recommandée. Cependant, un milieu de montage aqueux peut également être utilisé. Les échantillons peuvent être montés en utilisant un milieu de montage aqueux de type Dako Faramount, réf. S3025, ou Glycergel, réf. C0563, puis recouverts d une lamelle. REMARQUE : les lames peuvent être lues à tout moment. Cependant, une atténuation peut se produire si les lames sont recouvertes d un milieu de montage aqueux et exposées à une forte lumière pendant une semaine. Pour limiter cette atténuation, conserver les lames dans l obscurité à température ambiante (20 25 C). Contrôle de qualité Estomac Des différences dans la fixation, le traitement et l inclusion des tissus dans le laboratoire de l utilisateur peuvent générer une variabilité significative des résultats, ce qui requiert des contrôles internes réguliers, en complément des lames de contrôle fournies par Dako. Aux États-Unis, les utilisateurs doivent consulter les consignes de contrôle qualité du College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry, du document CLSI (ancien NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24) et la référence 25 pour plus d informations. Tableau 8. Objectif du contrôle qualité quotidien. Tissu : fixé et traité comme un échantillon de patient Anticorps spécifique et secondaire Anticorps non spécifique* ou tampon avec même anticorps secondaire que celui utilisé avec l anticorps spécifique Contrôle positif : tissu ou cellules contenant l antigène cible à détecter (peut être localisé dans le tissu du patient). Le contrôle idéal est un tissu présentant une faible coloration positive pour être plus sensible à l anticorps ou à une dégradation de l antigène. Contrôle toutes les étapes de l analyse. Valide le réactif et les procédures utilisés pour la coloration de la protéine HER2. Détection d une coloration de fond non spécifique. Contrôle négatif : tissus ou cellules devant être négatifs (peuvent être localisés dans un tissu de patient ou tissu de contrôle positif). Détection d une réactivité croisée inattendue de l anticorps aux cellules/éléments cellulaires. Détection d une coloration de fond non spécifique. Tissus de patient Détection d une coloration spécifique. Détection d une coloration de fond non spécifique. Lame de contrôle fournie par Dako. Procédure de coloration des contrôles uniquement. * Sérum provenant de la même espèce que l anticorps spécifique mais non dirigé contre le même antigène cible. Pour détecter les liaisons de l anticorps non spécifiques, par ex., la liaison de la partie Fc de l anticorps par le tissu. Lame de contrôle (fournie) : chacune des lames de contrôle fournies contient trois lignées cellulaires de cancer du sein humain fixées au formol, incluses en paraffine et enrobées, présentant des notes d intensité de 0, 1+ et 3+. Une lame doit être colorée lors de chaque cycle de coloration. L évaluation des lignées cellulaires de la lame de contrôle fournie par Dako indique la validité du cycle de coloration. Tissu de contrôle positif : les contrôles doivent être des échantillons d autopsie/de biopsie/de chirurgie récents fixés, traités et inclus aussi rapidement que possible de la même manière que le ou les échantillons de patient. Les contrôles de tissu positifs indiquent si les tissus ont été préparés correctement et si des techniques de coloration appropriées ont été utilisées. Un tissu ( ) P04087EFG_01_K / p. 84/152

85 Cancer de l estomac de contrôle positif pour chaque ensemble de conditions d analyse doit être inclus dans chaque cycle de coloration. Les tissus de contrôle positif doivent présenter une faible coloration positive pour pouvoir détecter des changements minimes de sensibilité de l anticorps primaire. Les lames de contrôle fournies avec ce kit ou les échantillons traités différemment du ou des échantillons de patient valident les performances des réactifs uniquement et non la préparation des tissus. Dans l idéal, il est recommandé d utiliser des tissus issus d adénocarcinomes de l estomac, y compris de la jonction gastro-œsophagienne, surexprimant la protéine HER2 (2+), précédemment analysés et déterminés comme tels, comme tissus de contrôle positif. REMARQUE : les tissus de contrôle positif connus ne doivent être utilisés que pour vérifier les bonnes performances des tissus traités et des réactifs de test, et NON pour établir un diagnostic spécifique aux échantillons de patient. Si les tissus de contrôle positifs ne présentent pas la coloration positive appropriée, les résultats des échantillons de patients doivent être considérés comme non valides. Tissu de contrôle négatif : utiliser un tissu de contrôle négatif (connu pour être négatif à la protéine HER2) fixé, traité et inclus de la même manière que le ou les échantillons de patient avec chaque cycle de coloration pour vérifier la spécificité de l anticorps primaire et fournir une indication de la coloration de fond spécifique. Le côlon, le foie ou la thyroïde sont des tissus de contrôle négatif appropriés. La variété des différents types cellulaires présents dans la plupart des coupes de tissu offre des sites de contrôle négatifs internes (cela doit être vérifié par l utilisateur). Si une coloration spécifique se produit dans le tissu de contrôle négatif, les résultats des échantillons de patient doivent être considérés comme non valides et le test exécuté de nouveau. Réactif de contrôle négatif non spécifique : utiliser le réactif de contrôle négatif fourni au lieu de l anticorps primaire avec une coupe de chaque échantillon de patient afin d évaluer la coloration non spécifique et d obtenir une meilleure interprétation de la coloration spécifique au niveau du site de l antigène. La période d incubation du réactif de contrôle négatif doit correspondre à celle de l anticorps primaire. Vérification du dosage : avant toute première utilisation d un système de coloration ou d anticorps lors d une procédure diagnostique, l utilisateur doit vérifier les performances spécifiques de l anticorps en le testant sur une série de tissus en interne dont les caractéristiques de performance immunocytochimique sont connues, représentant des tissus positifs et négatifs connus. Consulter les procédures de contrôle qualité mentionnées ci-dessus dans la présente notice, ainsi que les exigences de contrôle de qualité du Certification Program for Immunohistochemistry du CAP et/ou du document Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline du CLSI (ancien NCCLS) (24). Ces procédures de contrôle qualité doivent être reproduites pour chaque nouveau lot d anticorps ou dès lors qu un changement est apporté aux paramètres du dosage. Les adénocarcinomes de l estomac, y compris de la jonction gastro-œsophagienne, pour lesquels les intensités de coloration de la protéine HER2 connues vont de 0 à 3+ et les tissus négatifs, comme le côlon, le foie ou la thyroïde, conviennent à la vérification du test. Interprétation de la coloration Estomac Pour la détermination de l expression de la protéine HER2, seuls l intensité et le schéma de coloration de la membrane doivent être évalués en utilisant l échelle présentée au Tableau 9. L évaluation des lames doit être réalisée par un pathologiste à l aide d un microscope optique. Pour l évaluation de la coloration immunocytochimique et la notation, un objectif à grossissement de 10X est approprié. L utilisation d un objectif à grossissement de 5 40x permet de confirmer le score. La coloration cytoplasmique doit être considérée comme une coloration non spécifique et ne doit pas être incluse dans l évaluation de l intensité de coloration de la membrane (8). Pour faciliter la différenciation des colorations 0, 1+, 2+ et 3+, se reporter à l ouvrage «HercepTest ( ) P04087EFG_01_K / p. 85/152

86 Cancer de l estomac Interpretation Manual Gastric Cancer» (Manuel d interprétation du test HercepTest Cancer de l estomac) de Dako pour consulter des illustrations des intensités et des schémas de coloration. Seuls les échantillons de patients atteints d un adénocarcinome gastrique, y compris de la jonction gastro-œsophagienne, doivent être évalués. Dans les cas de métaplasie intestinale et d adénocarcinome gastrique dans le même échantillon, seule la composante adénocarcinome gastrique doit être évaluée. Pour l interprétation des biopsies colorées avec le test HercepTest, il est recommandé de disposer d un groupe d au moins 5 cellules tumorales colorées. Un groupe d au moins 5 cellules tumorales colorées correspond à 5 cellules tumorales HER2 colorées et reliées. Tableau 9. Interprétation et évaluation de la coloration immunohistochimique de la HER2 Note Échantillon chirurgical Schéma de coloration Échantillon issu d une biopsie Schéma de coloration Évaluation de la surexpression de la HER2 0 Aucune réactivité ou réactivité membranaire dans moins de 10 % des cellules tumorales Aucune réactivité ou aucune réactivité membranaire dans aucune cellule tumorale (ou dans un groupe de < 5 cellules) Négatif 1+ Réactivité membranaire faible ou à peine perceptible dans au moins 10 % des cellules tumorales : les cellules ne sont réactives que sur une partie de la membrane Groupe de cellules tumorales ( 5 cellules) avec une réactivité membranaire faible ou à peine perceptible quel que soit le pourcentage de cellules tumorales colorées Négatif 2+ Réactivité membranaire faible à modérée complète, basolatérale ou latérale, dans plus de 10 % des cellules tumorales Groupe de cellules tumorales ( 5 cellules) avec une réactivité membranaire faible à modérée, totale, basolatérale ou latérale, quel que soit le pourcentage de cellules tumorales colorées Équivoque 3+ Réactivité membranaire forte, basolatérale ou latérale, dans plus de 10 % des cellules tumorales Groupe de cellules tumorales ( 5 cellules) avec une réactivité membranaire forte, totale, basolatérale ou latérale, quel que soit le pourcentage de cellules tumorales colorées Positif Recommandations d après Hofmann et al. (40). Avec le test HercepTest, la surexpression de la protéine HER2 est déterminée comme négative (évaluation IHC 0 et 1+), équivoque (évaluation IHC 2+) et positive (évaluation IHC 3+). Le HercepTest n est pas conçu pour donner des informations pronostiques au patient et au médecin et n a pas été validé dans ce but. Pour chaque cycle de coloration, les lames doivent être examinées dans l ordre présenté au Tableau 10 pour déterminer la validité du cycle de coloration et permettre une évaluation semi-quantitative de l intensité de coloration du tissu de l échantillon. ( ) P04087EFG_01_K / p. 86/152

87 Cancer de l estomac Tableau 10. Ordre d évaluation des lames. Ordre de lecture des lames Raisonnement 1. Lame de contrôle contenant les trois lignées cellulaires Présence d une coloration 3+ brune de la membrane cellulaire (anneau) dans la lignée cellulaire de contrôle SK-BR-3 d intensité 3+, anneaux bruns partiels dans la lignée cellulaire de contrôle MDA-175 d intensité 1+, et aucune coloration dans la lignée cellulaire de contrôle MDA-231 d intensité 0 : indique que le dosage est valide. Une coloration membranaire ponctuelle et discontinue est présente dans un nombre faible à modéré de cellules de la lignée cellulaire de contrôle MDA-175 faiblement positive d intensité 1+. Une coloration immunologique punctiforme de l appareil de Golgi du cytoplasme peut être observée dans cette lignée cellulaire. La présence d une coloration brune dans la lignée cellulaire de contrôle MDA-231 d intensité 0 (négative à la coloration de la protéine HER2) indique qu il y a une coloration spécifique au cours du dosage. Les résultats du dosage peuvent être non valides en raison d une coloration excessive. 2. Lame de tissu de contrôle positif Une coloration membranaire brune doit être observée. La coloration du cytoplasme et des tissus négatifs ne doit pas être supérieure à Lame de tissu de contrôle négatif L ABSENCE de coloration spécifique sur la lame de tissu de contrôle négatif confirme l absence de réactivité croisée du kit aux cellules/composants cellulaires. Si une coloration spécifique de la membrane se produit sur la lame de tissu de contrôle négatif, les résultats des échantillons de patient doivent être considérés comme non valides. 4. Lame de tissu de patient colorée en utilisant le réactif de contrôle négatif 5. Lame de tissu de patient colorée en utilisant l anticorps primaire L absence de coloration membranaire spécifique permet de vérifier le marquage spécifique de l antigène cible par l anticorps primaire. Toute autre coloration brune ou foncée dans le cytoplasme de l échantillon traité avec le réactif de contrôle négatif, comme dans le tissu conjonctif, les leucocytes, les érythrocytes ou le tissu nécrotique, doit être considérée comme une coloration de fond non spécifique et ne doit pas être rapportée dans la partie Commentaires de la fiche contenant les données. Lorsqu une surexpression de la protéine HER2 est détectée dans l échantillon, un anneau brun apparaît autour de la membrane des cellules tumorales traitées avec l anticorps primaire. 1. Lame de contrôle (fournie) : la lame de contrôle positive au HercepTest doit être examinée en premier lieu pour vérifier que tous les réactifs fonctionnent correctement. La présence d un produit de réaction brun (3,3 -diaminobenzidine, DAB) au niveau de la membrane cellulaire indique une réactivité positive. La présence d une coloration périphérique brune de la membrane cellulaire (anneau) dans la lignée cellulaire de contrôle SK-BR-3 d intensité 3+, une coloration partielle en anneaux bruns dans la lignée cellulaire de contrôle MDA-175 d intensité 1+, et aucune coloration dans la lignée cellulaire de contrôle MDA-231 d intensité 0, tout cela indique que le dosage est valide. Si l une des lignées cellulaires de contrôle est en-dehors de ces critères, tous les résultats obtenus à partir des échantillons de patients doivent être considérés comme non valides. 2. Lame de tissu de contrôle positif : la lame de tissu de contrôle positif doit être examinée ensuite. Cette lame permet de vérifier que la méthode de fixation et le processus de restauration de l épitope fonctionnent. Utiliser des cellules intactes pour l interprétation des résultats de coloration ; les cellules nécrotiques ou dégénérées se colorent souvent de manière non spécifique (26). Une coloration brune de la membrane cellulaire doit être observée dans les tissus tumoraux. Une coloration brune du cytoplasme et des tissus négatifs dans l échantillon ne doit pas correspondre à un score d intensité de coloration supérieur à 1+. ( ) P04087EFG_01_K / p. 87/152

88 Cancer de l estomac 3. Lame de tissu de contrôle négatif : la lame de tissu de contrôle négatif doit être examinée après le tissu de contrôle positif pour vérifier la spécificité du marquage de l antigène cible par l anticorps primaire. L absence de coloration spécifique dans le tissu de contrôle négatif confirme l absence de réactivité croisée du kit aux cellules/composants cellulaires. Si une coloration spécifique se produit dans le tissu de contrôle négatif, les résultats des échantillons de patient doivent être considérés comme non valides. D autre part, les portions négatives du tissu de contrôle positif peuvent servir de tissu de contrôle négatif mais cela doit être vérifié par l utilisateur. Il convient de noter qu une faible réaction (intensité de coloration de 0 à 1+) peut être observée dans la plupart des tissus épithéliaux sains. Parmi les tissus de contrôle susceptibles d être négatifs figurent : le côlon, le foie et la thyroïde. Lorsqu elle est présente, une coloration non spécifique présente une apparence diffuse. Une coloration sporadique du tissu conjonctif peut également être observée dans des coupes provenant de tissus fixés au formol de manière excessive Tissus de patient : examiner les échantillons de patients colorés avec HercepTest en dernier. L intensité de coloration positive doit être évaluée dans le contexte d un bruit de fond non spécifique du réactif de contrôle négatif. Comme pour tout test immunocytochimique, un résultat négatif signifie que l antigène n a pas été détecté, et non pas que l antigène est absent des cellules/tissus testés. Se référer aux sections Résumé et explication, Limites et Caractéristiques de performance pour obtenir des informations spécifiques relatives à l immunoréactivité HercepTest. Recommandations supplémentaires pour l interprétation de la coloration HercepTest Les adénocarcinomes de l estomac, y compris de la jonction gastro-œsophagienne, testés pour la surexpression de la protéine HER2 reçoivent une évaluation allant de 0 à 3+. Alors que la majorité des cas 0 et 3+ sont clairs, un faible pourcentage des échantillons 1+ et 2+ restants peut être plus difficile à interpréter. Suivre les recommandations suivantes pour l interprétation de la coloration HercepTest dans votre laboratoire. Évaluer les lignées cellulaires de contrôle pour valider les performances du dosage. Évaluer les lames de contrôle positif et négatif. Une coloration hématoxyline et éosine (H&E) de l échantillon de tissu est recommandée pour la première évaluation. (La tumeur peut ne pas être évidente lors de l examen de l échantillon coloré avec HercepTest. Une lame colorée par H&E est nécessaire au pathologiste pour vérifier la présence de la tumeur.) Le HercepTest doit être effectué sur une paire de coupes (coupes en série) provenant du même bloc d échantillon inclus en paraffine. Évaluer les coupes colorées en termes de surexpression de la protéine HER2 à faible puissance en premier lieu. La majorité des cas positifs apparaîtra de manière évidente sous un faible grossissement. Pour les cas 1+, utiliser un grossissement 40x pour vérifier la coloration membranaire. Pour les cas 2+, utiliser un grossissement 10x à 20x pour vérifier la coloration membranaire. Échantillon chirurgical Les régions bien conservées et bien colorées de l échantillon doivent être utilisées pour déterminer le pourcentage de cellules tumorales positives. Si une majorité de cellules tumorales présente une coloration membranaire complète, basolatérale ou latérale, la coloration est soit de 2+ soit de 3+. S il existe une forte coloration membranaire complète, basolatérale ou latérale dans au moins 10 % des cellules tumorales des échantillons chirurgicaux, l évaluation de ces échantillons est 3+. ( ) P04087EFG_01_K / p. 88/152

89 Cancer de l estomac S il existe une coloration membranaire complète, basolatérale ou latérale, d intensité faible à modérée, dans au moins 10 % des cellules tumorales des échantillons chirurgicaux, l évaluation de ces échantillons est 2+. S il existe une coloration membranaire partielle, d intensité faible ou à peine perceptible dans au moins 10 % des cellules tumorales des échantillons chirurgicaux, l évaluation de ces échantillons est 1+. Si moins de 10 % des cellules tumorales des échantillons chirurgicaux présentent une coloration, quel que soit le schéma de coloration (par exemple coloration membranaire complète, basolatérale ou latérale, ou partielle), l évaluation est 0. S il n existe aucune coloration, l évaluation de l échantillon chirurgical est 0. Échantillons issus d une biopsie Un groupe d'au moins 5 cellules tumorales colorées correspond à 5 cellules tumorales HER2 colorées et reliées. S il existe un groupe d au moins 5 cellules tumorales présentant une forte coloration membranaire complète, basolatérale ou latérale, l évaluation de l échantillon de biopsie est 3+, quel que soit le pourcentage de cellules tumorales colorées. S il existe un groupe d au moins 5 cellules tumorales présentant une coloration membranaire faible à modérée, complète, basolatérale ou latérale, l évaluation de l échantillon de biopsie est 2+, quel que soit le pourcentage de cellules tumorales colorées. S il existe un groupe d au moins 5 cellules tumorales présentant une coloration membranaire faible ou à peine perceptible, et seulement partielle, l évaluation de l échantillon de biopsie est 1+, quel que soit le pourcentage de cellules tumorales colorées. S il n existe aucune coloration, l évaluation de l échantillon de biopsie est 0. Si une coloration membranaire (indépendamment de l intensité de coloration) est observée sur moins de 5 cellules tumorales regroupées, l évaluation de l échantillon de biopsie est 0. Limites Estomac Limites générales 1. L immunocytochimie est un processus diagnostique à plusieurs étapes qui requiert une formation spécialisée pour la sélection des réactifs appropriés ; la sélection, la fixation et le traitement des tissus ; la préparation des lames IHC ; et l interprétation des résultats de coloration. 2. La coloration des tissus dépend de la manipulation et du traitement corrects des tissus avant la coloration. Les fixation, congélation, décongélation, lavage, séchage, chauffage, coupe inadaptés ou une contamination par d autres tissus ou fluides peuvent générer des artéfacts, un piégeage des anticorps ou des faux négatifs. Des résultats non cohérents peuvent être dus à des variations dans les méthodes de fixation et d inclusion ou à des irrégularités inhérentes au tissu. 3. Une contre-coloration excessive ou incomplète peut conduire à une interprétation erronée des résultats. 4. L interprétation clinique de toute coloration positive ou de son absence doit être effectuée dans le contexte de la présentation clinique, de la morphologie et d autres critères histopathologiques. L interprétation clinique de toute coloration, ou de son absence, doit ( ) P04087EFG_01_K / p. 89/152

90 Cancer de l estomac être complétée par des études morphologiques et des contrôles appropriés ainsi que par d autres tests diagnostiques. L interprétation de la coloration est sous la responsabilité d un pathologiste qualifié devant être familiarisé avec les anticorps, les réactifs et les méthodes de coloration utilisés. La coloration doit être réalisée dans un laboratoire autorisé et certifié, sous le contrôle d un pathologiste, responsable de l examen des lames colorées et vérifiant la pertinence des contrôles positif et négatif. 5. Les tissus de patients infectés par le virus de l hépatite B et porteurs de l antigène de surface de l hépatite B (HBsAg) peuvent présenter une coloration non spécifique avec la peroxydase de raifort (27). Les réactifs peuvent présenter des réactions inattendues dans des types de tissus non testés précédemment. La possibilité de réactions inattendues même dans les types de tissus préalablement testés ne peut pas être complètement écartée, du fait de la variabilité biologique de l expression des antigènes dans les néoplasmes, ou autres tissus pathologiques (28). Contacter les services techniques de Dako et leur faire part de ces réactions inattendues et les documenter. 6. Des faux positifs peuvent être dus à une liaison non immunologique des protéines ou des produits de réaction du substrat. Ils peuvent aussi être causés par une activité pseudoperoxydasique (érythrocytes) ou par une activité peroxydasique endogène (cytochrome C) (28). 7. La procédure de coloration est réalisée à température ambiante, entre 20 et 25 C. Limites spécifiques au produit 1. L antigène présent dans la lignée cellulaire de contrôle MDA-175 d intensité 1+ se dégrade au fil du temps. Évaluer les résultats de la lame de contrôle en fonction de la date de péremption de cette dernière. Une coloration négative de cellules de la lignée MDA-175 peut juste indiquer une dégradation de la lame de contrôle. Les lames de contrôle doivent être stockées entre 2 et 8 C. 2. Des faux négatifs peuvent être dus à une dégradation de l antigène dans les tissus au fil du temps. Les échantillons doivent être colorés dans les 4 à 6 semaines suivant le montage des tissus sur les lames lorsqu ils sont conservés à température ambiante (20 à 25 C) (29). 3. Pour des résultats optimaux et reproductibles, la protéine HER2 exige une restauration de l épitope induite par la chaleur, sur des tissus fixés de la manière habituelle (formol neutre tamponné ou liquide de Bouin) et inclus en paraffine. Le prétraitement doit être effectué au début du processus de coloration. Voir les instructions à la section Préparation des échantillons, Traitement des tissus avant coloration. 4. La restauration de l épitope induite par la chaleur de la protéine HER2 ne doit être effectuée que dans un bain-marie étalonné. D autres méthodes de chauffage ont été testées sans générer de résultats reproductibles. 5. Ne pas remplacer les réactifs du kit par des réactifs portant d autres numéros de lot ou par des réactifs provenant d autres fabricants. La seule exception est le tampon de lavage qui peut être remplacé par le Dako Wash Buffer, réf. S Des faux peuvent provenir de l évaluation de la coloration cytoplasmique. Il ne faut tenir compte que de l intensité de la coloration de la membrane cellulaire lors de l interprétation des résultats. 7. Les lames de contrôle colorées doivent être utilisées uniquement pour la validation du cycle de coloration et non pour noter la réaction de coloration dans les coupes de tissus. 8. Une coloration focalisée forte (3+), à savoir des «points très marqués», peut parfois être observée. Cela peut être le résultat d une fixation et/ou d un traitement des tissus non homogènes. Il est recommandé de procéder à la coloration immunologique d un deuxième bloc de tissu provenant du même échantillon. ( ) P04087EFG_01_K / p. 90/152

91 Cancer de l estomac 9. L utilisation d HercepTest sur des échantillons fixés à l aide de fixateurs autres que le formol neutre tamponné n a pas été validée. 10. Il convient de noter que l épithélium sain de l amygdale et de l œsophage peut présenter une intensité de coloration allant jusqu à L utilisation d'échantillons broyés de cancer gastrique et l interprétation d un artéfact de coloration autour du bord d une biopsie doivent être évitées. Caractéristiques de performance Estomac Contexte L innocuité et l efficacité du trastuzumab (Herceptin ) a été démontrée dans une étude clinique (l essai ToGA) (38, 39). L étude a été conçue comme une étude multicentrique de phase III randomisée, ouverte, incluant des patients positifs à la HER2 et atteints d un adénocarcinome de l estomac ou de la jonction gastro-œsophagienne localement avancé, inopérable, récidivant et/ou métastasique. Dans l essai ToGA, la positivité à la HER2 a été définie comme déterminée par IHC (3+) (HercepTest, Dako) et/ou par HER2 FISH (HER2/CEN17 2,0) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako). Après leur enrôlement dans l étude, les patients recevaient de manière aléatoire une chimiothérapie (5-FU ou capécitabine et cisplatine) ou une chimiothérapie plus du trastuzumab. Le principal résultat final de l étude était la survie globale (SG). Dans cette étude randomisée portant sur 594 patients, 584 ont reçu le médicament expérimental et ont été inclus dans l ensemble d analyse intégral. Concernant le principal résultat final, la combinaison chimiothérapie plus trastuzumab s est avérée statistiquement supérieure à la chimiothérapie seule. La SG médiane est passée de 11,1 à 13,8 mois (p=0,0046) avec un taux de risque de 0,74 (IC à 95 % : 0,60 0,91). Les courbes de Kaplan-Meier pour la SG sont présentées à la Figure 1. Probabilité de survie 1,0 0,9 0,8 0,7 Test de Mantel-Cox P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Durée (mois) Nbre restant Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Groupe de traitement Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figure 1. Courbe de Kaplan-Meier de la SG (n=584). ( ) P04087EFG_01_K / p. 91/152

92 Cancer de l estomac Des analyses exploratoires pré-définies de sous-groupes définis selon le statut de HER2 ont été réalisées une fois les données disponibles. Deux nouveaux sousgroupes HER2 ont été définis post hoc selon l'évaluation IHC : Groupe 1 («groupe à faible expression de la HER2») : Groupe 2 («groupe à forte expression de la HER2») : IHC 0/FISH+ et IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ et IHC 3+ (FISH+ ou FISHou FISH sans résultat (n=446)) Lorsque l analyse primaire de la SG a été répétée post hoc pour le «groupe à forte expression de la HER2» (n=446), l avantage du traitement combiné était encore supérieur. La SG médiane du groupe de patients ayant reçu une chimiothérapie plus du trastuzumab atteignait 16,0 mois contre 11,8 pour les patients sous chimiothérapie seule. Le taux de risque de cette analyse a diminué à 0,65 (IC à 95 % : 0,51 0,83). Les courbes de Kaplan-Meier pour la SG du «groupe à forte expression de la HER2» sont présentées à la Figure 2. Probabilité de survie 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Durée (mois) Nbre restant Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Groupe de traitement Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figure 2. Courbe de Kaplan-Meier pour la SG du «groupe à forte expression de la HER2» (n=446). L essai ToGA a montré que la combinaison des tests IHC et FISH permettent de prédire l effet du traitement combiné chimiothérapie plus trastuzumab, mais les analyses exploratoires post hoc semblent toutefois indiquer que ce sont les patients présentant le niveau d'expression de la protéine HER2 le plus élevé (IHC2+/FISH+ et IHC3+) qui en tirent le plus grand bénéfice. Ceci peut s expliquer par le fait que la protéine est la cible du trastuzumab. Pour plus d informations sur l essai ToGA, voir la notice de l Herceptin. Reproductibilité Reproductibilité intra-cycle : la reproductibilité intra-cycle a été testée dans un laboratoire sur 3 échantillons présentant des évaluations de coloration IHC différentes. Chaque échantillon a été traité en triple exemplaire. Ce protocole a été utilisé avec une coloration automatisée. Tous les échantillons ont donné des résultats reproductibles à 100 %. La reproductibilité intra-cycle a ( ) P04087EFG_01_K / p. 92/152

93 Cancer de l estomac été testée dans un laboratoire sur 11 échantillons présentant des évaluations de coloration IHC différentes. Chaque échantillon a été traité en triple exemplaire. Ce protocole a été utilisé pour la coloration manuelle. Tous les échantillons ont donné des résultats reproductibles à 100 %. Reproductibilité inter-cycles et inter-laboratoires : l analyse HercepTest de 60 échantillons différents de cancer de l estomac, obtenus à partir d estomac ou de zones de la jonction gastro-œsophagienne représentant des résections chirurgicales et des biopsies, a été réalisée sur cinq jours non consécutifs dans trois sites d étude. Les 60 échantillons de l étude étaient répartis de manière égale dans les trois catégories du statut de HER2. Au total, évaluations de HER2 ont été réalisées par six pathologistes. Les concordances d un jour à l autre (négative, équivoque, positive) allaient de 83,1 % à 98,3 %. Dans 47 des 60 comparaisons possibles, les concordances étaient supérieures ou égales à 90,0 %. Dans le Table 1, des exemples spécifiques des comparaisons d un jour à l autre sont présentés avec des concordances moyennes de 91,2 %, 92,5 % et 92,5 % pour les trois sites. Les concordances d un site à l autre étaient de 82,7 %, 75,0 % et 88,0 %, respectivement pour la comparaison des sites par paire (Voir le Table 12). D après le test exact de Fisher, les résultats n étaient pas différents entre les sites. Les concordances d un observateur à l autre entre pathologistes à chaque site étaient de 88,0 %, 83,6 % et 81,0 % pour les trois sites de l étude, respectivement (Tableau 13). En conclusion, l analyse HercepTest d échantillons de cancer de l estomac dans trois sites d étude a mis en évidence une bonne concordance entre les observations quant aux jours, aux sites et aux observateurs. Tableau 11. Concordances globales d un jour à l autre en pourcentage - Un sous-ensemble de 12 comparaisons sur 60 Site 1 Site 2 Site 3 Observateur 1 Observateur 2 Concordance Concordance LI IC95 1 Concordance LI IC95 1 moyenne Jour 1 vs. Jour 2 85,0 74,4 93,3 84,9 Jour 3 vs. Jour 4 93,3 84,9 93,3 84,9 Jour 1 vs. Jour 2 95,0 87,3 83,1 72,0 Jour 3 vs. Jour 4 96,7 89,7 95,0 87,3 Jour 1 vs. Jour 2 90,0 80,5 91,7 82,7 Jour 3 vs. Jour 4 96,7 89,7 91,7 82,7 1 LI IC95 : limite inférieure de l intervalle de confiance à 95 %. Tableau 12. Concordances globales d un site à l autre en pourcentage 91,2 92,5 92,5 Concordance LI IC95 1 Concordance moyenne Site 1 vs. Site 2 Site 1 vs. Site 3 Site 2 vs. Site 3 Jour 1 vs. Jour 1 83,3 72,4 Jour 2 vs. Jour 2 85,0 74,4 Jour 3 vs. Jour 3 85,0 74,4 Jour 4 vs. Jour 4 81,7 70,5 Jour 5 vs. Jour 5 78,3 66,7 Jour 1 vs. Jour 1 80,0 68,6 Jour 2 vs. Jour 2 73,3 61,2 Jour 3 vs. Jour 3 78,3 66,7 Jour 4 vs. Jour 4 68,3 55,9 Jour 5 vs. Jour 5 75,0 63,0 Jour 1 vs. Jour 1 88,3 78,5 Jour 2 vs. Jour 2 86,7 76,4 Jour 3 vs. Jour 3 90,0 80,5 Jour 4 vs. Jour 4 86,7 76,4 Jour 5 vs. Jour 5 88,3 78,5 1 LI IC95 : limite inférieure de l intervalle de confiance à 95 %. 82,7 75,0 88,0 ( ) P04087EFG_01_K / p. 93/152

94 Cancer de l estomac Tableau 13. Concordances globales d un observateur à l autre en pourcentage Concordance LI IC95 1 Concordance moyenne Site 1 Site 2 Site 3 Jour 1 91,7 82,7 Jour 2 91,7 82,7 Jour 3 93,3 84,9 Jour 4 83,3 72,4 Jour 5 80,0 68,6 Jour 1 86,4 76,0 Jour 2 83,3 72,4 Jour 3 83,3 72,4 Jour 4 83,3 72,4 Jour 5 81,7 70,5 Jour 1 80,0 68,6 Jour 2 78,3 66,7 Jour 3 80,0 68,6 Jour 4 78,3 66,7 Jour 5 90,0 80,5 1 LI IC95 : limite inférieure de l intervalle de confiance à 95 %. 88,0 83,6 81,0 ( ) P04087EFG_01_K / p. 94/152

95 Cancer de l estomac Immunoréactivité Le Tableau 14 résume l immunoréactivité du HercepTest avec le panel de tissus sains recommandé. Tous les tissus ont été fixés au formol et inclus en paraffine puis colorés avec HercepTest, conformément aux instructions de la notice. Tableau 14. Résumé de la réactivité des tissus sains avec HercepTest. Type de tissus (nbre testés) Adrenal (3) Bone marrow (3) Brain/Cerebellum (3) Brain/Cerebrum (3) Breast (3) Cervix uteri (3) Colon (3) Esophagus (3) Heart (3) Kidney (3) Liver (3) Lung (3) Mesothelial cells (3) Ovary (3) Pancreas (3) Parathyroid (3) Peripheral nerve (3) Pituitary (3) Prostate (3) Salivary gland (3) Skeletal muscle (3) Skin (3) Small intestine (3) Spleen (3) Stomach (3) Testis (3) Thymus (3) Thyroid (3) Tonsil (3) Uterus (3) Coloration d éléments tissulaires positifs et schéma de coloration Mammary gland (1 of 3 tissues, 1+ staining intensity) Tubules of renal medulla (3 of 3 tissues, 1 2+ in 5 50% of cells, cytoplasmic) Prostate gland/ducts (3 of 3 tissues, 1+ staining intensity, 50% of cells, cytoplasmic) Sweat glands (1 of 3 tissues, 1+, 30% of cells, cytoplasmic) Columnar epithelium, surface (1 of 3 tissues, 2+ staining intensity, 25% of cells) Epithelium (1 of 3 tissues, 1+ staining intensity, 25% of cells) Squamous epithelium (3 of 3 tissues, 1+ staining intensity, 80% of cells) La coloration indiquée pour tous les tissus était membranaire, sauf indication contraire. Les trois échantillons de chaque type tissulaire présentaient la même intensité de coloration, sauf indication contraire. ( ) P04087EFG_01_K / p. 95/152

96 Cancer de l estomac Dépannage Estomac Se référer à la section Dépannage du Manuel Dako mentionné précédemment (19) pour connaître les actions correctives, ou contacter les services techniques de Dako pour signaler toute coloration inhabituelle. Problème Cause probable Mesure suggérée 1. Coloration d aucune lame 2. Coloration faible des lames. 1a. Erreur de programmation. Les réactifs n ont pas été utilisés dans l ordre 1b. Les flacons de réactifs n ont pas été chargés à leur emplacement correct dans les portoirs de réactif 1a. Vérifier la grille de programmation pour s assurer que le cycle de coloration a été programmé correctement 1b. Vérifier la carte des réactifs pour s assurer que les réactifs sont placés correctement 1c. Pas assez de réactif dans le flacon 1c. Veiller à charger assez de réactif dans les flacons avant de lancer le cycle. Consulter la carte des réactifs pour les volumes nécessaires. 1d. Azide de sodium dans la solution de lavage 1e. Un chauffage excessif des coupes de tissus montées avant déparaffinage et démasquage des antigènes par la chaleur peut entraîner une perte de l immunoréactivité visible de la protéine HER2. 1d. Utiliser une préparation fraîche de tampon de lavage, fournie dans le kit 1e. Laisser sécher les coupes de tissus à l air libre et à température ambiante pendant au moins 12 heures ou jusqu à ce qu ils soient secs. Autre possibilité : laisser sécher toute une nuit à 37 C ou à 60 C pendant une heure maximum. Le séchage des coupes de tissus à des températures élevées doit être réalisé uniquement dans une étuve étalonnée, offrant une répartition uniforme de la chaleur (17). 2a. Mauvaise restauration de l épitope 2a. Vérifier que la solution de restauration de l épitope atteigne une température de 95 à 99 C durant 40 minutes pleines, et laisser refroidir pendant 20 minutes supplémentaires 2b. Durées d incubation des réactifs inadéquates 2b. Revoir les instructions de la procédure de coloration 2c. Méthode de fixation inappropriée 2c. S assurer que le tissu du patient n est pas fixé de manière excessive et qu un autre fixateur n a pas été utilisé 2d. Un chauffage excessif des coupes de tissus montées avant déparaffinage et démasquage des antigènes par la chaleur peut entraîner une diminution marquée de l immunoréactivité visible de la protéine HER2 2e. Volume de réactifs appliqué insuffisant. 2d. Laisser sécher les coupes de tissus à l air libre et à température ambiante pendant au moins 12 heures ou jusqu à ce qu ils soient secs. Autre possibilité : laisser sécher toute une nuit à 37 C ou à 60 C pendant une heure maximum. Le séchage des coupes de tissus à des températures élevées doit être réalisé uniquement dans une étuve étalonnée, offrant une répartition uniforme de la chaleur (17). 2e. Vérifier la taille de la coupe de tissu (22 mm x 22 mm) et le volume de réactifs appliqué. ( ) P04087EFG_01_K / p. 96/152

97 Cancer de l estomac 3. Coloration de fond excessive des lames 3a. Elimination incomplète de la paraffine 3b. De l amidon a été utilisé comme additif lors du montage des coupes sur les lames 3a. Utiliser des solutions de rinçage fraîches et suivre la procédure indiquée à la section B.1 3b. Éviter d utiliser de l amidon comme additif pour faire adhérer les coupes aux lames de verre. De nombreux additifs sont immunoréactifs 3b. Éviter d utiliser de l amidon comme additif pour faire adhérer les coupes aux lames de verre. De nombreux additifs sont immunoréactifs 3c. Les lames ne sont pas bien rincées 3c. Veiller à correctement amorcer l Autostainer avant d exécuter un cycle. S assurer que le tampon approprié est fourni en quantité suffisante pour l ensemble du cycle. Utiliser des solutions fraîchement préparées de tampons et de lavage 3d. Les coupes ont séché au cours de la procédure de coloration 3e. Les coupes ont séché au cours de leur chargement sur l Autostainer 3d. Vérifier que le volume de réactif approprié est appliqué sur les lames. S assurer que le capot de l Autostainer est fermé et que le réactif n est pas exposé à une chaleur excessive ou à un tirage 3e. Veiller à ce que les coupes soient humidifiées par du tampon et le restent durant le chargement et avant de lancer le cycle 3f. Méthode de fixation inappropriée 3f. S assurer que le fixateur approuvé a été utilisé. Un autre fixateur peut provoquer une coloration de fond excessive 3g. Liaison non spécifique des réactifs aux tissus 3g. Vérifier la méthode de fixation de l échantillon et la présence de nécrose 4. Le tissu se détache des lames. 5. Coloration spécifique trop forte 4a. Utilisation de lames inadéquates 4a. Utiliser des lames silanisées, telles les Dako Silanized Slides, (réf. S3003), SuperFrost Plus ou des lames enduites de poly-l-lysine 5a. Méthode de fixation inappropriée 5a S assurer que seuls des fixateurs et des méthodes de fixation approuvés ont été utilisés 6. Faible coloration de la lignée cellulaire de la lame de contrôle 1+ 5b. Utilisation d une source de chaleur inappropriée pour la restauration de l épitope, par ex., autocuiseur, four à microondes ou autoclave 5c. Durées d incubation des réactifs trop longues 5d. Une solution de lavage inappropriée a été utilisée 6a. Mauvais protocole de restauration de l épitope 5b. Veiller à utiliser un bain-marie pour l étape de restauration de l épitope 5c. Revoir les instructions de la procédure de coloration 5d. N utiliser que le tampon de lavage recommandé pour le kit 6a. Immerger les lames dans une solution de restauration de l épitope préchauffée. Ramener la solution de restauration de l épitope à une température de 95 à 99 C et préchauffer durant 40 minutes pleines ( ) P04087EFG_01_K / p. 97/152

98 Cancer de l estomac 7. Restauration de l épitope La solution est trouble lorsqu elle est chauffée 8. Restauration de l épitope La solution est trouble lors de sa conservation (avant de la chauffer) 6b. Manque de réaction à la solution de substrat chromogène (DAB) 6c. Dégradation de la lame de contrôle 7. Lorsqu elle est chauffée, la solution prend un aspect trouble 8. La solution n a pas été correctement conservée ou bien la date de péremption de la solution est dépassée 6b. Veiller à procéder à une incubation durant 10 minutes pleines. Veiller à n ajouter qu une goutte de chromogène DAB à 1 ml de substrat tamponné DAB 6c. Vérifier la date de péremption et les conditions de conservation du kit indiquées sur la boîte 7. Ceci est normal et n affecte pas la coloration 8. Vérifier la date de péremption et les conditions de conservation du kit indiquées sur la boîte. Jeter la solution de restauration de l épitope REMARQUE : si le problème ne peut pas être attribué à l une des causes ci-dessus, ou si la mesure préconisée ne parvient pas à le résoudre, contacter les services techniques de Dako. Pour plus d informations sur les techniques de coloration et la préparation des échantillons, consulter le Manuel (19) Dako mentionné précédemment (disponible auprès de Dako), et les ouvrages Atlas of Immunohistology (30) et Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04087EFG_01_K / p. 98/152

99 DEUTSCH Verwendungszweck Zur In-vitro-Diagnostik. HercepTest ist ein halbquantitativer immunzytochemischer Assay zum Nachweis der Überexpression des HER2-Proteins in routinemäßig für die histologische Auswertung verarbeiteten Brustkrebsgewebeproben und formalinfixierten, paraffineingebetteten Krebsgewebeproben von Patienten mit Magen-Adenokarzinom, einschließlich des ösophagogastralen Übergangs. HercepTest ist als Hilfsmittel bei der Auswahl von Patientinnen indiziert, für die eine Therapie mit Herceptin (Trastuzumab) in Betracht gezogen wird (siehe Packungsbeilage Herceptin ). HINWEIS nur für Brustkrebs: Alle Patientinnen, die an den klinischen Versuchen mit Herceptin teilgenommen haben, wurden anhand eines immunzytochemischen Investigational-Clinical-Trial-Assays (CTA) ausgewählt. Keine der in diese Studien aufgenommenen Patientinnen wurde anhand der HercepTest Ergebnisse ausgewählt. HercepTest wurde an einer gesonderten Zusammenstellung von Proben mit dem CTA verglichen und ergab annehmbar übereinstimmende Befunde. Die tatsächliche Korrelation zwischen HercepTest und dem klinischen Ergebnis mit Herceptin wurde noch nicht ermittelt. HINWEIS nur für Magenkrebs: Alle Patienten der von Hoffmann-La Roche gesponserten Phase III BO18255 (ToGA) Studie wurden mit dem Dako HercepTest (IHC) und dem Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH) ausgewählt. Die Studie zeigte den klinischen Nutzen beider Tests für die Bewertung des HER2-Status in Patienten mit inoperablem lokal fortgeschrittenem, rezidivierendem und/oder metastatischem Adenokarzinom des Magens bzw. ösophagogastralen Übergangs. Für den vorliegenden Kit, Code-Nr. K5207, wurden die Reagenzienvolumina spezifisch für die Anwendung zusammen mit dem Autostainer eingestellt. Das Magen-Adenokarzinom, einschließlich des ösophagogastralen Übergangs, wird in diesem Dokument auch als Magenkrebs bezeichnet. Für Anwendungen bei einem Mammakarzinom siehe Seite 100 bis 121. Für Anwendungen bei Magenkrebs siehe Seite 122 bis 148. Wichtig: Bei der Auswertung von angefärbten Gewebeschnitten bitte besonders die Unterschiede zwischen Brustkrebsgewebe und Magenkrebsgewebe beachten. ( ) P04087EFG_01_K / p. 99/152

100 Brustkrebs Zusammenfassung und Erläuterung - Brustkrebs Hintergrund Das humane HER2-Gen (auch ERBB2 oder NEU genannt) kodiert ein oft als HER2-Protein oder p185 HER2 bezeichnetes Protein. Das HER2-Protein ist eine Membranrezeptor- Tyrosinkinase, die strukturell dem epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor entspricht (EGFR oder HER1) (1-8). Es stellt eine normale, von zahlreichen Epithelzelltypen exprimierte Komponente dar (8). Bei manchen Brustkrebspatientinnen wird das HER2-Protein im Rahmen des Prozesses der malignen Transformation und Tumorprogression exprimiert (9). Aufgrund der Überexpression des HER2-Proteins auf der Oberfläche von Brustkrebszellen wird vermutet, dass es sich als Ziel für ein Antikörper-Therapeutikum eignen könnte. Herceptin (Trastuzumab) ist ein humanisierter monoklonaler Antikörper (10), der sich mit hoher Affinität an das HER2-Protein bindet und die Proliferation von menschlichen, das HER2-Protein überexprimierenden Tumorzellen nachweislich in vitro und in vivo hemmt (11 13). Eigenschaften HercepTest wurde als Alternative zu dem in den klinischen Studien über Herceptin verwendeten Investigational-CTA entwickelt. Die Eignung von HercepTest für den Nachweis der Überexpression des HER2-Proteins wurde in einer unabhängigen Studie durch Vergleich der Ergebnisse von HercepTest mit denen des CTAs an 548 Brustkrebsgewebeproben ausgewertet, die nicht von Patientinnen stammten, die an den klinischen Studien über Herceptin teilnahmen. Die Ergebnisse deuteten auf eine 79 %ige Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen der beiden Testverfahren bei diesen Gewebeproben hin. Die Konkordanzdaten legten weiter nahe, dass ein Ergebnis von 3+ mit HercepTest höchstwahrscheinlich einem positiven Ergebnis mit dem CTA entspricht, das die Einschlusskriterien für die Studie erfüllt hätte (2+ oder 3+). Allerdings bestand bei einem Befund von 2+ mit HercepTest keine vergleichbar gute Korrelation zu den CTA-Ergebnissen. Ungefähr 42 % (53/126) der 2+-Ergebnisse mit HercepTest waren mit CTA negativ (0-1+) und hätten nicht zur Aufnahme in die klinischen Studien über Herceptin geführt. Die Überexpression des HER2-Proteins wird mit HercepTest als negativ (Färbungsintensität 0 und 1+), schwach positiv (Färbungsintensität 2+) und stark positiv (Färbungsintensität 3+) bewertet. HercepTest ist für Patientinnen oder den behandelnden Arzt nicht als prognostisches Hilfsmittel vorgesehen und für diesen Zweck auch nicht validiert. Prinzip des Testverfahrens - Brustkrebs HercepTest enthält die erforderlichen Reagenzien, um ein zwei Schritte umfassendes immunzytochemisches Färbeverfahren an routinemäßig verarbeiteten, paraffineingebetteten Gewebeproben durchzuführen. Im Anschluss an die Inkubation mit dem primären Kaninchen- Antikörper gegen humanes HER2-Protein verwendet dieses Kit ein gebrauchsfertiges Visualization Reagent auf Basis der Dextrantechnologie. Das Reagenz enthält sowohl sekundäre Ziegen-Anti- Kaninchen-Immunglobulinmoleküle als auch mit einem gemeinsamen Dextranpolymer-Backbone verknüpfte Meerrettichperoxidasemoleküle, wodurch die sequenzielle Anwendung von Link- Antikörper und peroxidasekonjugiertem Antikörper überflüssig wird. Kreuzreaktivität des Visualization Reagent mit humanen Immunglobulinen und fötalem Rinderserum wurde durch Festphasen-Absorption ausgeschlossen. Die enzymatische Umwandlung des anschließend zugegebenen Chromogens führt zur Ausbildung eines sichtbaren Reaktionsprodukts an der Antigenstelle. Danach können die Proben gegengefärbt und eingedeckt werden. Ergebnisse werden mithilfe eines Lichtmikroskops ausgewertet. Zur Validierung der Färbedurchgänge werden Kontrollschnitte mit drei formalinfixierten, paraffineingebetteten Brustkrebszelllinien mit Färbungsintensitätswerten von 0, 1+ und 3+ mitgeliefert. Die Färbungsintensität dieser Zelllinien korreliert mit der Anzahl der Rezeptoren pro Zelle. ( ) P04087EFG_01_K / p. 100/152

101 Brustkrebs HercepTest, Code-Nr. K5207, dient für die automatisierte Verarbeitung unter Nutzung des Autostainer. Reagenzien - Brustkrebs Mitgelieferte Materialien Die unten aufgeführten Materialien reichen für 50 Tests (50 mit primärem Antikörper gegen das HER2-Protein inkubierte Objektträger und 50 mit dem entsprechenden negativen Kontrollreagenz inkubierte Objektträger). Die Anzahl der Tests basiert für jedes Reagenz auf einer Menge von 200 µl je Gewebeschnitt (22 mm x 22 mm) aus den Fläschchen. 1, 2, 3 und 4 sowie von der Substrat-Chromogen-Lösung (DAB). Die im Kit gelieferten Materialien sind ausreichend für höchstens 15 Färbevorgänge. Fläschchen Nr. Menge 1 2 x 11 ml 2 1 x 12 ml 3 2 x 11 ml 4 1 x 12 ml 5 15 x 11 ml 6 3 x 3 ml 7 3 x 500 ml Beschreibung Peroxidase-Blocking Reagent: 3 % Wasserstoffperoxid, enthält 15 mmol/l Natriumazid (NaN 3 ). Rabbit Anti-Human HER2 Protein: Gebrauchsfertiger affinitätsisolierter Antikörper. Geliefert in 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, mit Stabilisatorprotein. Immunogen: An Keyhole Limpet Hämocyanin gekoppeltes synthetisches C-terminales Fragment (intrazytoplasmatischer Teil) des HER2-Proteins. Spezifität: HER2-Protein Reinigungsverfahren: Der Antikörper wird durch ein trägerfixiertes Peptid des HER2-Proteins affinitätsisoliert. Visualization Reagent: Mit Meerrettichperoxidase und affinitätsisolierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulinen konjugiertes Dextranpolymer. Geliefert in Tris/HCI-Puffer mit Stabilisatorprotein und einer antimikrobiellen Substanz. Negative Control Reagent: Immunglobulinfraktion normalen Kaninchenserums in einer dem Antikörper gegen das HER2- Protein äquivalenten Proteinkonzentration. Geliefert in 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, mit Stabilisatorprotein. DAB Buffered Substrate: Substratpufferlösung, ph 7,5, enthält < 0,1 % Wasserstoffperoxid, Stabilisatoren, Beschleuniger und eine antimikrobielle Substanz. DAB Chromogen: 5 % 3,3'-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid in Chromogenlösung. Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): 0,1 mol/l Zitratpuffer mit Detergenz. ( ) P04087EFG_01_K / p. 101/152

102 8 2 x 1 L 3 x 5 Objektträger Wash Buffer (10x): Tris/HCl-Puffer mit Detergenz und antimikrobiellem Wirkstoff. Brustkrebs Control Slides: Jeder Objektträger enthält Schnitte von drei formalinfixierten, paraffineingebetteten Brustkrebszelllinien, die unterschiedliche Stufen der HER2-Proteinexpression darstellen. MDA-231 (0), MDA-175 (1+) und SK-BR-3 (3+). Die Kontrollobjektträger wurden zur besseren Haftung der Schnitte an den Glasobjektträger einer Wärmebehandlung unterzogen. Jede weitere, zur besseren Anhaftung der Schnitte an den Glas-Objektträger durchgeführte Wärmebehandlung der Kontrollobjektträger kann die Färbungsergebnisse beeinträchtigen. HINWEIS: Alle Reagenzien, einschließlich Epitope Retrieval Solution und Wash Buffer, wurden spezifisch für die Anwendung bei diesem Assay konzipiert. Damit der Test spezifikationsgemäß durchgeführt werden kann, dürfen keine Substitutionen vorgenommen werden. Hiervon ausgenommen ist der Waschpuffer, anstelle dessen Dako Code-Nr. S3006 genutzt werden kann. Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs) Ammoniumhydroxid, 15 mol/l, verdünnt auf 37 mmol/l Gegenfärbung: Hämatoxylin, wie beispielsweise wasserbasierendes Mayer's Hematoxylin, Dako Code-Nr. S3301 (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, A.4) Deckgläser Destilliertes oder entionisiertes Wasser (Waschflüssigkeit) Trockenofen, der imstande ist, eine Temperatur von maximal 60 C aufrechtzuerhalten. Ethanol, absolut und 95 % Lichtmikroskop (4-fache bis 40-fache Vergrößerung) Eindeckmedium, z. B. Dako Faramount, Code-Nr. S3025, oder Dako Glycergel, Code-Nr. C0563. Positive und negative Gewebe zur Verfahrenskontrolle (siehe Abschnitt Qualitätskontrolle) Objektträger, SuperFrost Plus, mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger oder Dako Silanized Slides, Code-Nr. S3003 (siehe Abschnitt zur Probenvorbereitung) Färbeschalen oder -bäder Kurzzeitwecker (auf Zeitabstände zwischen 2-40 Minuten ausgelegt) Wasserbad mit Deckel (darauf ausgelegt, die Epitope Retrieval Solution auf einer Temperatur von C zu halten) Xylol, Toluol oder Xylolersatz K5207 wurde spezifisch ausgelegt für die Anwendung zusammen mit dem Autostainer Immunostaining System, Code-Nr. S3400. Die für den Autostainer benötigten Komponenten können der Autostainer-Bedienungsanleitung entnommen werden. Aufbewahrung - Brustkrebs Bei 2-8 C lagern. Das Kit nach Ablauf des auf der Verpackung aufgedruckten Verfalldatums nicht mehr verwenden. Werden die Reagenzien anders als entsprechend den in der Packungsbeilage angegebenen Bedingungen aufbewahrt, muss deren Verwendung vom Benutzer bestätigt werden (14a,14b). Die Kontrollobjektträger sind ebenfalls bei 2-8 C zu lagern. ( ) P04087EFG_01_K / p. 102/152

103 Brustkrebs Es gibt keine offensichtlichen Anzeichen für eine eventuelle Produktinstabilität. Es sollten daher die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitgeführt werden. Wenn unerwartete Anfärbung beobachtet wird, welche durch Änderungen in den Labormethoden nicht erklärt werden kann und falls Verdacht auf ein Problem mit dem HercepTest besteht, ist bitte Kontakt mit unserem technischen Kundendienst aufzunehmen. Probenvorbereitung - Brustkrebs Mit Biopsieproben muss so umgegangen werden, dass sich das Gewebe noch für die immunzytochemische Färbung eignet. Bei allen Proben sind Standardverfahren der Gewebeverarbeitung anzuwenden (15). Paraffineingebettete Schnitte Geeignet sind in neutral gepuffertem Formalin oder Fixiergemisch nach Bouin für die routinemäßige Verarbeitung und Paraffineinbettung fixierte Gewebe. Biopsieproben beispielsweise sollten auf eine Dicke von 3 oder 4 mm geschnitten und in neutral gepuffertem Formalin Stunden lang fixiert werden. Die Dehydrierung der Gewebeschnitte erfolgt dann in einer Reihe von Alkoholen und in Xylen, gefolgt von der Infiltration mit geschmolzenem Paraffin, das auf einer Temperatur von nicht mehr als 60 C g ehalten wird. Sachgemäß fixierte und eingebettete Gewebe, die das HER2-Protein exprimieren, sind vor dem Anfertigen der histologischen Schnitte und dem Aufziehen auf Objektträgern bei kühler Lagerung (15-25 C) unbegrenzt haltbar (15, 16). Für Anwender in den USA wird gemäß dem Clinical Laboratory Improvement Act of 1988 (Clinical Laboratory Improvement Act aus dem Jahr 1988), Abschnitt 42 CFR (b) vorgeschrieben, dass das Labor gefärbte Objektträger mindestens zehn Jahre und Probenblöcke mindestens zwei Jahre ab Untersuchungsdatum aufbewahren muss (16). Die Gewebeproben sollten in Schnitte von 4-5 µm Stärke geschnitten und auf Objektträger gezogen werden und bei Raumtemperatur mindestens 12 Stunden (oder bis zur vollständigen Trockenheit) bzw. bei 37 C über Nacht oder bei 60 C eine Stund e lang an der Luft trocknen. VORSICHT: Übermäßiges Erwärmen für mehr als 1 Stunde bei 60 C kann zu einem erheblichen Abfall oder Verlust der spezifischen membranständigen HER2-Immunreaktionsfähigkeit führen (17). Um die Antigenizität aufrechtzuerhalten, sollten die auf Objektträger gezogenen Schnitte (SuperFrost/Plus, Poly-L-Lysin oder mit Silan behandelte Objektträger) innerhalb 4-6 Wochen nach dem Aufschneiden gefärbt werden, wenn sie bei Raumtemperatur (20-25 C) aufbewahrt werden (18). Die für die Evaluation des HER2-Proteins und für die Verifikation des Vorliegens des Tumors benötigten Objektträger werden zur gleichen Zeit vorbereitet. Es wird ein Minimum von 5 Objektträgern empfohlen: 1 Objektträger für die Tumorpräsenz, 2 Objektträger für die Evaluation des HER2-Proteins (1 für die Inkubation mit Fläschchen Nr. 2 und 1 für die Inkubation mit Fläschchen Nr. 4) und 2 Objektträger zu Reservezwecken. Die Verwendung des HercepTest TM bei dekalzifizierten Geweben wurde nicht validiert und wird nicht empfohlen. Weitere Informationen zur Probenvorbereitung finden Sie im Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19) von Dako und unter den Literaturhinweisen 15 und 16. Gewebebehandlung vor der Färbung Für optimale Assay-Leistung muss ein spezifisches Verfahren für die Epitopdemaskierung eingesetzt werden, und zwar das Kochen in 10 mmol/l Citratpuffer. Die Epitope Retrieval Solution ist im HercepTest -Kit enthalten. Für dieses Verfahren werden die auf Objektträgern aufgezogenen Gewebeschnitte erwärmt, während sie in 10 mmol/l Citratpuffer eingetaucht sind (20). Hierzu wird ein kalibriertes Wasserbad verwendet, mit dem die Demaskierungslösung auf der benötigten Temperatur (95-99 C) gehalten w ird. Labors in bestimmten Höhenlagen sollten das beste Verfahren für die Beibehaltung der erforderlichen Wasserbad-Temperatur selbst ermitteln. Die Demaskierung muss in einem Wasserbad erfolgen. Andere Erwärmungsverfahren wurden getestet, haben aber keine reproduzierbaren Resultate erbracht. Das Färbeverfahren unmittelbar im Anschluss an die Demaskierung durchführen. Abweichungen vom beschriebenen Vorgehen können die Ergebnisse beeinträchtigen. ( ) P04087EFG_01_K / p. 103/152

104 Vorsichtsmaßnahmen - Brustkrebs 1. Zur In-vitro-Diagnostik. 2. Nur für Fachpersonal bestimmt. Brustkrebs 3. Fläschchen 1, Peroxidase-Blocking Reagent, enthält 3 % Wasserstoffperoxid. Auf Anfrage ist ein Sicherheitsdatenblatt für Fachpersonal erhältlich. 4. Fläschchen 6, DAB Chromogen, enthält 5-<10% Biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammoniumtetrachlorid und ist wie folgt gekennzeichnet: H350 H341 P201 P280 Gefahr P308 + P313 P405 P501 Kann Krebs erzeugen. Kann vermutlich genetische Defekte verursachen. Vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen Schutzhandschuhe tragen. Augenschutz oder Gesichtsschutz tragen. Schutzkleidung tragen. BEI Exposition oder falls betroffen Ärztliche Hilfe anfordern. Unter Verschluss aufbewahren. Inhalt und Behälter in Übereinstimmung mit allen lokalen, regionalen, nationalen und internationalen Gesetzen entsorgen. Als Hauptregel ist die Arbeit mit diesem Produkt Personen unter 18 Jahren untersagt. Der Benutzer ist in der Ausführung der Arbeit den gefährlichen Eigenschaften dieses Produktes sowie den notwendigen Sicherheitsmaßnahmen gründlich zu unterweisen. Weitere Informationen entnehmen Sie dem Sicherheitsdatenblatt (SDB). 5. Fläschchen 8, Wash Buffer (10x), enthält 5-<10% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propan-1,3- diolhydrochlorid und 0.1-<0.2% 5-Brom-5-nitro-1,3-dioxan. Kann allergische Reaktionen hervorrufen. Fläschchen 8, Wash Buffer (10x), ist gekennzeichnet: Achtung H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Verursacht schwere Augenreizung. Augenschutz oder Gesichtsschutz tragen. Nach Gebrauch Hände gründlich waschen. BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. 6. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN 3 ), eine in reiner Form äußerst giftige Chemikalie. Ansammlungen von NaN 3 können auch in Konzentrationen, die nicht als gefährlich klassifiziert sind, mit Blei- und Kupferabflussrohren reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung muss mit reichlich Wasser nachgespült werden, um Metall-Azid-Anreicherung zu vermeiden (21, 22). 7. Die Fläschchen 2, 3 und 4 enthalten Material tierischen Ursprungs. Wie alle Produkte biologischen Ursprungs müssen auch diese entsprechend gehandhabt werden. 8. Sowohl vor dem Fixieren als auch danach sind Kontrollobjektträger und Proben sowie alle damit in Berührung kommenden Materialien so zu handhaben, als könnten sie Krankheiten übertragen. Bei der Entsorgung sind angemessene Vorsichtsmaßnahmen zu beachten (23). Reagenzien nie mit dem Mund pipettieren und Haut- bzw. Schleimhautkontakt mit ( ) P04087EFG_01_K / p. 104/152

105 Reagenzien und Proben vermeiden. Empfindliche Bereiche nach Kontakt mit den Reagenzien mit reichlich Wasser waschen. Brustkrebs 9. Die mikrobielle Kontamination der Reagenzien muss so gering wie möglich gehalten werden, um eine unspezifische Färbung zu vermeiden. 10. Inkubationszeiten, Temperaturen oder Methoden, die hier nicht ausdrücklich beschrieben sind, können die Ergebnisse beeinträchtigen. Übermäßig starkes Trocknen bei 60 C für mehr als eine Stunde kann zu einem erheblichen Abfall oder Verlust der spezifischen membranständigen HER2-Immunreaktionsfähigkeit führen (17). 11. Die Reagenzien wurden zur Verwendung mit dem Eridan Staining System optimal verdünnt. Weitere Verdünnung kann zu einer geringeren Antigenfärbung führen. 12. Alle Reagenzien, einschließlich Epitope Retrieval Solution und Wash Buffer, wurden spezifisch für die Anwendung bei diesem Assay konzipiert. Damit der Test spezifikationsgemäß durchgeführt werden kann, dürfen keine Substitutionen vorgenommen werden. Hiervon ausgenommen ist der Waschpuffer, anstelle dessen Dako Code-Nr. S3006 genutzt werden kann. 13. Zu starke Lichteinstrahlung kann für das Visualisierungsreagenz und das DAB-Chromogen schädlich sein. Systemkomponenten nicht bei starker Lichteinwirkung lagern und keine Färbungen bei hellem Licht, wie z. B. direktem Sonnenlicht, vornehmen. 14. Um einen Kontakt mit Augen und Haut zu vermeiden, ist angemessene persönliche Schutzausrüstung zu tragen. Weitere Informationen bitte dem Material- Sicherheitsdatenblatt (SDB) entnehmen. 15. Paraffinüberreste können zu falsch-negativen Ergebnissen führen. 16. Andere als die empfohlenen Reagenzienmengen können zu einem Verlust der sichtbaren HER2-Immunreaktivität führen. Gewebeschnitte mit einer Größe von mehr als 22 mm x 22 mm erfordern 2 3 Mal 200 µl Reagenz auf 2 3 automatischen Applikationsbereichen. GEBRAUCHSANWEISUNG - Brustkrebs A. Reagenzienvorbereitung Es wird empfohlen, die folgenden Reagenzien vor der Färbung anzusetzen: A.1 Epitopdemaskierungslösung Für das geplante Färbeverfahren eine ausreichende Menge des Inhalts von Fläschchen 7 (Epitope Retrieval Solution x 10) mit destilliertem oder entionisiertem Wasser im Verhältnis 1:10 verdünnen. Nicht verbrauchte angesetzte Lösung kann einen Monat lang bei 2-8 C aufbewahrt werden. Getrübte verdünnte Lösung entsorgen. A.2 Waschpuffer Eine für die Wasch-Schritte ausreichende Menge Waschpuffer (Wash Buffer x 10), Fläschchen 8, mit destilliertem oder entionisiertem Wasser im Verhältnis 1:10 ansetzen. Nicht verbrauchter angesetzter Puffer kann einen Monat lang bei 2-8 C aufbewahrt werden. Getrübten Puffer entsorgen. Die Programmierung des Autostainer sieht vor, dass Gewebeschnitte nach dem Auftrag des Peroxidase-Blocking Reagent und der Substrate-Chromogen Solution gespült werden. Es sollte beachtet werden, dass für diese Spülschritte entweder destilliertes (oder entionisiertes) Wasser oder Waschpuffer genutzt werden können. Alle anderen Spülschritte sind mit Waschpuffer durchzuführen. ( ) P04087EFG_01_K / p. 105/152

106 Brustkrebs A.3 Substrat-Chromogenlösung (DAB) Die Substratchromogenlösung durch Zugabe von 11 Tropfen (25 30 µl pro Tropfen) DAB Chromogen aus Fläschchen 6 in das DAB-gepuffertes Substrat (11 ml) enthaltende Fläschchen 5 ansetzen und mischen. Angesetzte Substrate-Chromogen Solution (DAB) ist bei der Lagerung bei 2-8 C circa 5 Tage lang stabil. D ie angesetzte Lösung muss vor der Verwendung gründlich vermischt werden. In der Lösung auftretendes Präzipitat beeinträchtigt die Qualität der Färbung nicht. HINWEIS: Die Farbe des in Fläschchen 6 enthaltenen DAB Chromogen kann von durchsichtig bis hin zu einer hellen lavendelbraunen Schattierung reichen. Die Leistung dieses Produkts wird hierdurch nicht beeinträchtigt. Bitte entsprechend den Richtlinien in dieser Packungsbeilage verdünnen. Eine Zugabe von zu viel DAB Chromogen zum DAB gepufferten Substrat führt zur Abschwächung des positiven Signals. A.4 Gegenfärbung Das gefärbte Endprodukt der DAB-Färbungsreaktion ist sowohl in Wasser als auch in Alkohol unlöslich. Es ist ein Hämatoxylin-Gegenfärbemittel zu verwenden und die Hämatoxylin- Färbungsintensität ist auf einen ähnlichen Ausprägungsgrad einzustellen, wie er im von Dako herausgegebenen HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer angeführt ist. Es kann entweder alkohol- oder wasserbasierendes Hämatoxylin verwendet werden, wie z. B. Dako Mayer's Hematoxylin, Code-Nr. S3301. Nach der Hämatoxylin-Gegenfärbung wird eine gründliche Spülung mit destilliertem oder entionisiertem Wasser durchgeführt, woraufhin die Objektträger mit Gewebeproben in ein Bad mit 37 mmol/l NH 3 -Wasser eingetaucht werden (siehe Abschnitt B.2, Schritt 3). Ammoniakwasser (37 mmol/l) wird wie folgt angesetzt: 2,5 ml (konzentriertes) Ammoniakhydrat, 15 mol/l, mit 1L destilliertem oder entionisiertem Wasser vermischen. Nicht verwendetes 37 mmol/l Ammoniakwasser kann bei Raumtemperatur (20-25 C) in einer gut verschlossenen Flasche bis zu 1 2 Monate aufbewahrt werden. A.5 Fixiermittel Empfohlen wird ein nichtwässriges Mittel zur permanenten Fixierung. Es kann aber auch eine wässrige Fixierung verwendet werden. Hierfür werden Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use, Code-Nr. S3025, oder Glycergel Mounting Medium, Code-Nr. C0563, empfohlen. Vor dem Gebrauch wird Glycergel durch Erwärmen auf circa 40 (±5) C verflüssigt. B. Färbeprozedur auf dem Autostainer B.1 Hinweise Vor der Verwendung sind alle diese Anleitungen durchzuarbeiten und Benutzer sollten sich mit allen Kit- und Gerätekomponenten vertraut machen (siehe Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen ). Vor dem immunhistochemischen Anfärben müssen alle Reagenzien Raumtemperatur (20-25 C) annehmen. Auch alle Inkubationen sind bei Ra umtemperatur durchzuführen. Während des Einsetzens in den Autostainer und während der Färbeprozedur dürfen die Gewebeschnitte nicht austrocknen. Trockene Gewebeschnitte können unspezifische Färbungen aufweisen. Bei einer Unterbrechung des Färbeverfahrens können die Objektträger nach Inkubation mit dem primären Antikörper bis zu einer Stunde lang bei Raumtemperatur (20-25 C) im Pufferbad belassen werden. Das Färbungsergebnis wird hierdurch nicht beeinträchtigt. Entparaffinieren und Rehydrierung: Zur Entfernung des Einbettungsmediums müssen die Gewebeschnitte vor der Färbung entparaffiniert und anschließend rehydriert werden. Das Paraffin muss vollständig entfernt werden. Überreste des Einbettungsmediums können eine stärkere unspezifische Färbung zur Folge haben. Diesen Schritt bei Raumtemperatur (20-25 C) durchführen. 1. Objektträger in ein Xylolbad einlegen und 5 (±1) Minuten lang inkubieren. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. ( ) P04087EFG_01_K / p. 106/152

107 Brustkrebs 2. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und Objektträger 3 (±1) Minuten lang in absolutes Ethanol geben. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. 3. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und Objektträger 3 (±1) Minuten lang in 95%iges Ethanol geben. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. 4. Überschüssige Flüssigkeit durch Abklopfen entfernen und Objektträger mindestens 30 Sekunden in destilliertes oder entionisiertes Wasser eintauchen. Die Färbeprozedur wie in Abschnitt B.2, Schritt 1, Epitopdemaskierung, erläutert beginnen. Xylol- und Alkohollösungen nach 40 Objektträgern auswechseln. Toluen oder Xylen-Ersatz wie beispielsweise Histoclear können anstelle von Xylen verwendet werden. HINWEIS: Die in diesem Kit enthaltenen Anweisungen und Reagenzien wurden für eine optimale Leistung konzipiert. Weitere Verdünnungen der Kit-Reagenzien oder Abänderungen der Inkubationstemperaturen können zu fehlerhaften oder unstimmigen Ergebnissen führen. Unterschiede bei Gewebeverarbeitung und technischen Verfahren im Labor des Anwenders können die Assayergebnisse ungültig machen, sodass sie sich nicht für die Herceptin - Therapieauswahl eignen. B.2 Färbeprotokoll Durchführung bei Raumtemperatur, C. Schritt 1: Epitopdemaskierung Färbebehältnisse wie z. B. Coplin-Färbetröge mit verdünnter Epitopdemaskierungslösung (Epitope Retrieval Solution) befüllen (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.1). Epitopdemaskierungslösung enthaltende Färbetröge in ein Wasserbad stellen. Wasserbad und Epitopdemaskierungslösung auf C erwärmen. Bei Erwärmung trübt sich die Epi topdemaskierungslösung. Tröge mit Deckeln versehen, um eine Temperaturstabilisierung zu erreichen und um Verdunsten zu vermeiden. Die entparaffinierten, auf Raumtemperatur gebrachten Gewebeschnitte in die vorgewärmte Epitope Retrieval Solution in den Färbeschalen eintauchen. TEMPERATUR DES WASSERBADS UND DER EPITOPDEMASKIERUNGSLÖSUNG WIEDER AUF C BRINGEN. 40 (±1) Minuten bei C inkubieren. Gesamte Färbeschale samt Objektträger aus dem Wasserbad heben. Objektträger bei Raumtemperatur in der Epitopdemaskierungslösung 20 (±1) Minuten lang abkühlen lassen. Epitopdemaskierungslösung abgießen und Schnitte mit Waschpuffer spülen (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.2). Um optimale Leistungen zu erzielen, werden die Schnitte nach der Epitopdemaskierung und vor dem Färben 5-20 Minuten lang in Waschpuffer eingeweicht. HINWEIS: Die Epitope Retrieval Solution ist nur für den einmaligen Gebrauch bestimmt. Nicht wiederverwenden. Schritt 2: Autostainer-Verfahren 1. Die erforderlichen Programm-Laufzeiten und Reagenzienvolumina (spezifische Volumina siehe unter Punkt 4 unten) sind dem vom Autostainer generierten Diagramm zum automatischen Programm für den HercepTest zu entnehmen. 2. Autostainer -Reagenzieneinsätze in der Reagenzienaufnahme des Autostainer nach den Reagenzien-Informationen des computergenerierten Diagramms in Position bringen. 3. Objektträger nach den Objektträger-Informationen des computergenerierten Diagramms in den Autostainer einsetzen. ( ) P04087EFG_01_K / p. 107/152

108 4. Programm einstellen und das HercepTest -Programm laufen lassen. Nachstehend eine Übersicht über die Durchführung des Programms: Spülen 200 µl Peroxidase-Blocking Reagent - 5 Minuten Spülen 200 µl Primary Anti-HER2 Protein (oder Negative Control Reagent) - 30 Minuten Spülen 200 µl Visualization Reagent - 30 Minuten Spülen Spülen Wechseln 200 µl Substrate-Chromogen Solution (DAB) - 10 Minuten Brustkrebs Die Objektträger nach dem Substratchromogen-Schritt in entionisiertem Wasser spülen. HINWEIS: Die Autostainer-Hardwareversion 01 spült Objektträger in Puffer. Daher müssen die Objektträger nach Entnahme aus dem Autostainer mit entionisiertem Wasser gespült werden. Schritt 3: Gegenfärbung (Anweisungen für Hämatoxylin) Objektträger aus dem Autostainer nehmen und wie unten beschrieben mit Hämatoxylin gegenfärben. Objektträger in ein Hämatoxylin-Bad eintauchen. In Abhängigkeit von der genutzten Hämatoxylin-Konzentration 2-5 Minuten lang inkubieren. Vorsichtig in einem Bad mit destilliertem oder entionisiertem Wasser spülen. Alle Hämatoxylinreste müssen vollständig entfernt worden sein. Wahlweise: Objektträger 10 Mal in ein Bad mit 37 mmol/l Ammoniakwasser eintauchen (siehe Abschnitt A.4). Objektträger 2-5 Minuten vorsichtig in einem Bad mit destilliertem oder entionisiertem Wasser spülen. HINWEIS: In Abhängigkeit von der Länge der Inkubationszeit und der Wirkungsintensität des genutzten Hämatoxylins resultiert die Gegenfärbung in einer blass- bis dunkelblauen Anfärbung der Zellkerne. Übermäßige oder unvollständige Gegenfärbung kann die sachgemäße Auswertung der Ergebnisse beeinträchtigen. Schritt 4: Fixierung Empfohlen wird ein nichtwässriges Mittel zur permanenten Fixierung. Es kann aber auch ein wässriges Fixiermittel verwendet werden. Proben können unter Verwendung eines wasserbasierenden Eindeckmediums wie z. B. Dako Faramount, Code-Nr. S3025, oder Glycergel, Code-Nr. C0563, aufgezogen und mit Deckglas versehen werden. HINWEIS: Objektträger können zu einem beliebigen Zeitpunkt abgelesen werden. Werden die Objektträger jedoch mit einem wässrigen Medium fixiert und eine Woche lang hellem Licht ausgesetzt, kann die Farbe etwas verblassen. Objektträger im Dunkeln bei Raumtemperatur (20-25 C) aufbewahren, um Verblassen zu vermeiden. ( ) P04087EFG_01_K / p. 108/152

109 Brustkrebs Qualitätskontrolle - Brustkrebs Unterschiede in der Fixierung, Verarbeitung und Einbettung der Gewebeschnitte im Labor des Benutzers können erhebliche Unterschiede bei den Ergebnissen zur Folge haben. Aus diesem Grund müssen zusätzlich zu den von Dako gelieferten Kontrollobjektträgern regelmäßig auch Kontrollen vor Ort durchgeführt werden. In den USA ist auf die Leitlinien für die Qualitätskontrolle Bezug zu nehmen, die vom College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry herausgegeben wurden. Weitere Informationen finden sich auch in: CLSI (früher NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24) und Literaturangabe 25. Tabelle 1. Zweck der täglichen Qualitätskontrolle Gewebe: Fixiert und verarbeitet wie die Patientenprobe Positivkontrollen: Gewebe oder Zellen mit nachzuweisendem Zielantigen (kann sich im Patientengewebe befinden). Als ideal gilt eine Kontrolle aus schwach positiv färbendem Gewebe, da dieses gegenüber einem Antikörper- oder Antigenabbau sehr empfindlich ist. Spezifischer Antikörper und sekundärer Antikörper Kontrolliert alle Analyseschritte. Validiert Reagenz und Verfahrensweisen für die HER2-Protein-Färbung. Nicht spezifischer Antikörper* oder Puffer und der gleiche sekundäre Antikörper, der mit dem spezifischen Antikörper genutzt wurde Nachweis unspezifischer Hintergrundfärbung. Negativkontrolle: Vermutlich negative Gewebe oder Zellen (im Patientengewebe oder im Gewebe der positiven Kontrollprobe). Nachweis unbeabsichtigter Antikörper- Kreuzreaktivität mit Zellen und Zellbestandteilen. Nachweis unspezifischer Hintergrundfärbung. Patientengewebe. Nachweis spezifischer Färbung. Nachweis unspezifischer Hintergrundfärbung. Kontrollobjektträger, von Dako mitgeliefert. Kontrolliert nur den Färbevorgang. * Serum von der gleichen Tierart wie der spezifische Antikörper, aber nicht gegen dasselbe Zielantigen gerichtet. Zum Nachweis unspezifischer Bindung, z. B. Bindung des Fc-Fragments des Antikörpers an das Gewebe. Kontrollobjektträger (mitgeliefert): Jeder der mitgelieferten Kontrollobjektträger enthält drei pelletierte, formalinfixierte, paraffineingebettete humane Brustkrebs-Zelllinien mit Färbungsintensitätswerten von 0, 1+ und 3+. Bei jedem Färbeverfahren sollte ein Objektträger gefärbt werden. Durch Auswertung der Zelllinien auf dem von Dako mitgelieferten Kontrollobjektträger wird der Färbedurchlauf validiert. Positives Kontrollgewebe: Als Kontrollen dienen frische, durch Autopsie, Biopsie oder einen operativen Eingriff gewonnene Proben, die so schnell wie möglich und auf die gleiche Weise fixiert, verarbeitet und eingebettet werden wie die Patientenprobe(n). Positive Kontrollgewebe deuten auf sachgemäß vorbereitete Gewebe und geeignete Färbetechniken hin. In jedem Färbedurchlauf sollte für jede Gruppe von Testbedingungen ein positives Kontrollgewebe mitgeführt werden. Die für die positiven Gewebekontrollen verwendeten Gewebe sollten eine schwache, positive Färbung aufweisen, sodass geringe Veränderungen der primären Antikörpersensitivität nachweisbar sind. Die in diesem Kit mitgelieferten Kontrollobjektträger und Proben, die abweichend von der(n) Patientenprobe(n) verarbeitet werden, validieren nur die Leistung der Reagenzien, bestätigen jedoch nicht die Gewebevorbereitung. Idealerweise sollte als positives Kontrollgewebe humanes Brustkrebsgewebe aus invasiven (infiltrierenden) Karzinomen dienen, für das bereits eine Überexpression des HER2-Proteins mit einem Score von 2+ bestimmt wurde. HINWEIS: Bekanntermaßen positives Kontrollgewebe sollte nur zur Überprüfung der korrekten Funktionsweise der verarbeiteten Gewebe und Testreagenzien verwendet werden, NICHT ( ) P04087EFG_01_K / p. 109/152

110 Brustkrebs aber zur Unterstützung der spezifischen Diagnose anhand von Patientenproben. Wenn das positive Kontrollgewebe keine Färbung aufweist, müssen die Ergebnisse der Patientenproben für ungültig erklärt werden. Negative Kontrollgewebe: Bei jedem Färbedurchlauf eine negative Kontrollgewebeprobe (als HER2-Protein-negativ bekannt) einsetzen, die auf die gleiche Weise wie die Patientenprobe fixiert, verarbeitet und eingebettet wurde, um die Spezifität des primären Antikörpers zu verifizieren und Hinweise auf eine spezifische Hintergrundfärbung zu erhalten. Als Negativkontrolle eignet sich Gewebe aus Darm, Leber oder Schilddrüse. Die in den meisten Gewebeschnitten anzutreffende Vielzahl verschiedener Zelltypen ermöglicht interne negative Kontrollstellen (vom Benutzer zu verifizieren). Normales Brustganggewebe kann als interne Negativkontrolle dienen. Falls das negative Kontrollgewebe oder die interne Negativkontrolle Färbungen aufweisen, sollten die Ergebnisse der Patientenproben für ungültig erklärt werden. Nicht spezifisches Negativkontrollreagenz (Negative Control Reagent): Zur Beurteilung unspezifischer Färbung und im Hinblick auf eine bessere Interpretation der spezifischen Färbung an der Antigenstelle sollte bei einem Teil jeder Patientenprobe das mitgelieferte negative Kontrollreagenz anstelle des primären Antikörpers benutzt werden. Die Inkubationszeit für das negative Kontrollreagenz sollte mit der für den primären Antikörper übereinstimmen. Verifizierung des Assays: Bevor bei einem diagnostischen Verfahren ein Antikörper oder ein Färbesystem zum ersten Mal genutzt wird, muss vom Benutzer die Spezifizität des Antikörpers verifiziert werden. Hierzu wird dieser an einer Reihe laborinterner Gewebe mit bekannten immunzytochemischen Leistungsmerkmalen getestet, die bekanntermaßen positive und negative Gewebe repräsentieren. Siehe die zuvor in diesem Abschnitt der Packungsbeilage dargestellten Qualitätskontrollmaßnahmen und die Qualitätskontrollanforderungen des CAP Certification Program for Immunohistochemistry und/oder CLSI (früher NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24). Diese Maßnahmen sind für jede neue Antikörpercharge bzw. bei jeder Veränderung der Assayparameter zu wiederholen. Für die Assay-Verifizierung geeignet sind Mammakarzinome mit erwiesenen HER2-Protein- Färbungsintensitäten von 0 bis 3+ sowie negative Gewebe wie z. B. Colon, Leber oder Schilddrüse. Interpretation des Anfärbens - Brustkrebs Zur Bestimmung der Überexpression des HER2-Proteins sollten anhand der Skala in Tabelle 2 nur die Färbungsintensität und das Färbemuster der Membran zugrunde gelegt werden. Die Auswertung der Objektträger ist von einem Pathologen mittels Lichtmikroskop vorzunehmen. Zur Auswertung der immunzytochemischen Färbung und zur Bestimmung der Färbungsintensität ist ein Objektiv mit 10facher Vergrößerung ausreichend. Für die Bestätigung der Gradeinteilung ist die Verwendung eines Objektivs mit 20-40facher Vergrößerung nützlich. Eine zytoplasmatische Färbung ist als nichtspezifisch zu betrachten und bei der Bewertung der Färbungsintensität der Membran nicht zu berücksichtigen (8). Zur Unterstützung der Klassifizierung von Färbungen mit den Werten 0, 1+, 2+ bzw. 3+ repräsentative Abbildungen der Färbungsintensität und Muster bitte dem HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer von Dako entnehmen. Es sollten nur Proben von Patientinnen mit invasivem Mammakarzinom ausgewertet werden. Sind in einer Probe sowohl Karzinome in situ als auch invasive Karzinome vorhanden, so ist nur die invasive Komponente zu bewerten. ( ) P04087EFG_01_K / p. 110/152

111 Brustkrebs Tabelle 2. Kriterien für die Intensität der Anfärbung der Zellmembran Färbungsmuster Es kommt zu keiner Färbung bzw. zu einer Membranfärbung bei weniger als 10 % der Tumorzellen. Bei mehr als 10 % der Tumorzellen tritt eine schwache bzw. kaum wahrnehmbare Membranfärbung auf. Es kommt nur zu einer teilweisen Färbung der Zellmembran. Bei mehr als 10 % der Tumorzellen tritt eine schwache bis mäßige, vollständige Membranfärbung auf. Bei mehr als 10 % der Tumorzellen tritt eine starke, vollständige Membranfärbung auf. Score (Scoring) (Mitteilung an den behandelnden Arzt) HER2-Protein Überexpression Bewertung (Mitteilung an den behandelnden Arzt) Negativ Negativ Schwach positiv Stark positiv Die Überexpression des HER2-Proteins wird mit HercepTest als negativ (Färbungsintensität 0 und 1+), schwach positiv (Färbungsintensität 2+) und stark positiv (Färbungsintensität 3+) bewertet. HercepTest ist für Patientinnen oder den behandelnden Arzt nicht als prognostisches Hilfsmittel vorgesehen und für diesen Zweck auch nicht validiert. Für jeden Färbedurchlauf sollten die Objektträger zur Bestimmung der Validität des Färbedurchlaufs und zur halbquantitativen Bewertung der Färbungsintensität der Gewebeprobe in der in Tabelle 3 angegebenen Reihenfolge untersucht werden. ( ) P04087EFG_01_K / p. 111/152

112 Brustkrebs Tabelle 3. Reihenfolge der Objektträgerauswertung Reihenfolge der Ablesung der Objektträger Grundprinzip 1. Kontrollobjektträger mit den drei Zelllinien Auf einen validen Assay verweisen: Vorhandensein einer Grad 3+ entsprechenden braunen Membrananfärbung (vollständige Ringform) bei der 3+ Kontroll-Zelllinie SK-BR-3; partielle ringförmige braune Anfärbung bei der 1+ Kontroll-Zelllinie MDA- 175 und keine Anfärbung bei der 0 Kontroll-Zelllinie MDA-231. Punktförmige und diskontinuierliche Membrananfärbung liegt bei einer kleinen bis moderaten Anzahl von Zellen in der schwach-positiven 1+ Kontroll-Zelllinie MDA-175 vor. Außerdem kann bei dieser Zelllinie eine punktförmige Immunfärbung des Golgi-Felds des Zytoplasmas beobachtet werden. Das Auftreten einer braunen Färbung bei der 0 Kontroll-Zelllinie MDA-231 (negativ für die Färbung mit HER2-Protein) ist ein Anzeichen für eine unspezifische Färbung während des Assays. Die Assay-Resultate können wegen übermäßigen Anfärbens ungültig sein. 2. Objektträger mit positivem Kontrollgewebe. Es sollte eine Braunfärbung der Membran zu beobachten sein. Anfärben des Zytoplasmas und negativer Gewebeproben sollte nicht mehr als 1+ betragen. 3. Objektträger mit negativem Kontrollgewebe Die ABWESENHEIT einer spezifischen Färbung in den Negativkontrollproben bestätigt das Fehlen einer Kreuzreaktivität des Kits mit Zellen und Zellkomponenten. Tritt bei dem Objektträger mit als Negativkontrolle dienendem Gewebe spezifische Membranfärbung auf, müssen die mit der Patientenprobe gewonnenen Resultate als ungültig angesehen werden. 4. Färbung des Patientengewebes trat bei Verwendung der Negativkontrolle auf. 5. Färbung des Patientengewebes trat bei Verwendung des primären Antikörpers auf. Fehlen einer spezifischen Membrananfärbung verifiziert die spezifische Markierung des Target-Antigens durch den primären Antikörper. Andere als gelb-braune oder braune Färbung im Zytoplasma der mit Negativkontrollreagenz behandelten Probe wie Bindegewebe, Leukozyten, Erythrozyten oder nekrotisches Gewebe sind als nicht spezifische Hintergrundfärbung zu bewerten und auf dem Datenblatt unter der Spalte für Kommentare mitzuteilen. Wird in der Probe eine Überexpression des HER2-Proteins nachgewiesen, erscheint diese als braune Ringform, die auf der Zellmembran der mit primärem Antikörper behandelten Tumorzellen auftritt. 1. Kontrollobjektträger (mitgeliefert): Der mit HercepTest gefärbte Kontrollobjektträger sollte zuerst untersucht werden, damit gewährleistet ist, dass alle Reagenzien korrekt funktionieren. Ein braunes (3,3 -Diaminobenzidin, DAB) Reaktionsprodukt auf der Zellmembran zeigt eine positive Reaktivität an. Bei Auftreten einer peripheren Braunfärbung der Zellmembran (Randbildung) in der 3+ Kontroll-Zelllinie SK-BR-3, einer teilweisen braunen Randbildung in der 1+ Kontroll-Zelllinie MDA-175 und keiner Färbung der 0 Kontroll-Zelllinie MDA-231 ist der Assay gültig. Falls in einer der Kontrollzelllinien andere Ergebnisse als die hier genannten auftreten, sollten die Ergebnisse der Patientenproben für ungültig erklärt werden. 2. Positives Kontrollgewebe: Als nächstes sollte der Objektträger mit dem positiven Kontrollgewebe untersucht werden. Dieser Objektträger verifiziert die Wirksamkeit des Fixierungsverfahrens und der Epitopdemaskierung. Zur Auswertung der Ergebnisse müssen intakte Zellen verwendet werden, da nekrotische oder degenerierte Zellen oft eine unspezifische Färbung aufweisen (26). Die Färbung sollte im Tumorgewebe als Braunfärbung der Zellmembran zu beobachten sein. Eine Braunfärbung des Zytoplasmas und der Negativgewebe innerhalb der Probe sollte nicht stärker ausgeprägt sein, als dem Färbungsintensitätswert 1+ entspricht. ( ) P04087EFG_01_K / p. 112/152

113 Brustkrebs 3. Negative Kontrollgewebe: Der Objektträger mit als Negativkontrolle dienendem Gewebe sollte nach der Positivkontrolle untersucht werden, um die Spezifität der Markierung des Target-Antigens durch den primären Antikörper zu verifizieren. Das Fehlen einer spezifischen Färbung in den Negativkontrollproben bestätigt, dass das Kit nicht mit Zellen und Zellkomponenten kreuzreagiert hat. Falls das negative Kontrollgewebe Färbungen aufweist, sollten die Ergebnisse der Patientenprobe für ungültig erklärt werden. Alternativ können auch negative Bereiche des positiven Kontrollgewebes als Negativkontrolle dienen, dieses ist jedoch vom Anwender zu verifizieren. Es ist zu beachten, dass bei den meisten normalen Epithelgeweben eine schwache Reaktion (Färbungsintensität 0-1+) beobachtet werden kann. Mögliche Negativkontrollgewebe sind: Darm, Leber und Schilddrüse. Eine eventuelle unspezifische Färbung erscheint diffus. Bei übermäßig formalinfixierten Gewebeschnitten kann es gelegentlich zur Einfärbung des Bindegewebes kommen Patientengewebe: Mit HercepTest gefärbte Patientenproben zuletzt auswerten. Die Intensität der positiven Färbung ist im Kontext einer eventuellen unspezifischen Hintergrundfärbung der Negativkontrolle zu bewerten. Wie bei allen immunzytochemischen Tests bedeutet ein negatives Ergebnis, dass das Antigen nicht nachgewiesen wurde, nicht aber, dass das Antigen in den getesteten Zellen/Geweben nicht vorhanden war. Spezielle Angaben zur Immunreaktivität von HercepTest den Abschnitten Zusammenfassung und Erklärung, Einschränkungen und Leistungsmerkmale entnehmen. Zusätzliche Empfehlungen für die Auswertung der Färbung mit HercepTest Die meisten auf HER2-Überexpression getesteten metastasierenden Mammakarzinome werden mit 0 oder 3+ bewertet. Die Mehrheit dieser Fälle ist eindeutig, allerdings kann ein geringer Prozentsatz der restlichen, mit 1+ bzw. 2+ bewerteten, Proben schwieriger auszuwerten sein. Bitte bei der Auswertung von Färbungen mit HercepTest in Ihrem Labor nach folgenden Richtlinien vorgehen. Auswerten der Kontrollzelllinien zur Validierung der Leistung des Assays. Auswerten der Objektträger mit der Positiv- bzw. Negativkontrolle. Für die erste Auswertung wird eine Färbung der Gewebeprobe mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) empfohlen. (Beim Auswerten der mit HercepTest gefärbten Probe ist der Tumor möglicherweise nicht deutlich sichtbar. Zum Verifizieren der Tumorpräsenz benötigt der Pathologe einen H- und E-angefärbten Objektträger.) Der HercepTest TM ist an einem paarig vorliegenden Schnitte (Serienschnitt) durchzuführen, der vom gleichen paraffineingebetteten Präparatblock angefertigt wurde. Die für die Überexpression von HER2-Protein gefärbten Schnitte zunächst mit geringer Vergrößerung auswerten. Die meisten positiven Fälle sind bei geringer Vergrößerung deutlich sichtbar. Für die Bestimmung des prozentualen Anteils positiver Tumorzellen sollten gut erhaltene und gut gefärbte Bereiche der Probe verwendet werden. Im Allgemeinen sollte der Score positiver Fälle bei geringer Vergrößerung deutlich sichtbar sein. Ist die Bestimmung von Grenzfällen zwischen 1+/2+ bei geringer Vergrößerung schwierig, so beträgt der Wert normalerweise 1+. Mit der Vergrößerung 20-40x wird die Membrananfärbung verifiziert. Weist die Mehrzahl der Tumorzellen eine vollständige Membranfärbung auf, so beträgt die Färbungsintensität entweder 2+ oder 3+. Zur Bestätigung der Gradeinstufung wird zu einer Vergrößerung von 20-40x übergegangen. Bei den meisten 3+-Fällen werden mindestens 80 % der Tumorzellen gefärbt und weisen eine intensive Membranfärbung auf. ( ) P04087EFG_01_K / p. 113/152

114 Brustkrebs Liegt das Ergebnis in der Nähe des Cut-offs von 10 % positiven Tumorzellen, so wird empfohlen, zur Bestimmung des prozentualen Anteils gefärbter Zellen mindestens 100 Tumorzellen zu zählen. Tritt bei mehr als 10 % der Tumorzellen eine vollständige Membranfärbung von schwacher bis mäßiger Intensität auf, so ist die Probe mit 2+ zu bewerten. Dieses ist gewöhnlich von einer unvollständigen Membranfärbung der Mehrzahl der übrigen Tumorzellen begleitet. Weisen weniger als 10 % der Tumorzellen eine vollständige periphere Membranfärbung auf, obwohl andere Tumorzellen eine unvollständige Membranfärbung zeigen, so beträgt der Wert 1+. Zeigen weniger als 10 % der Tumorzellen eine vollständige oder unvollständige periphere Membranfärbung, so beträgt der Wert 0. Beschränkungen - Brustkrebs Allgemeine Beschränkungen 1. Immunzytochemie ist ein diagnostisches Mehrfachschritt-Verfahren, das hinsichtlich der Auswahl der geeigneten Reagenzien, der Auswahl, Fixierung und Verarbeitung von Geweben sowie der Vorbereitung des Objektträgers für die Immunzytochemie und der Auswertung der Färbungsergebnisse ein Spezialtraining erfordert. 2. Gewebefärbungen hängen von der sachgemäßen Handhabung und Verarbeitung des Gewebes vor der Färbung ab. Unsachgemäßes Fixieren, Einfrieren, Auftauen, Waschen, Trocknen, Erhitzen, Schneiden oder Verunreinigung durch andere Gewebe oder Flüssigkeiten kann zu Artefakten, Antikörper-Trapping oder falsch negativen Ergebnissen führen. Widersprüchliche Ergebnisse können auf Unterschiede bei den Fixierungs- und Einbettungsmethoden oder auf Unregelmäßigkeiten innerhalb des Gewebes zurückzuführen sein. 3. Übermäßige oder unvollständige Gegenfärbung kann die sachgemäße Auswertung der Ergebnisse beeinträchtigen. 4. Die klinische Auswertung jeder positiven Färbung oder deren Ausbleiben muss im Rahmen des klinischen Bildes, der Morphologie und anderer histopathologischer Kriterien erfolgen. Die klinische Auswertung einer Färbung oder deren Ausbleiben muss durch morphologische Studien und geeignete Kontrollen sowie durch andere diagnostische Tests ergänzt werden. Für die Auswertung der gefärbten Präparate ist ein qualifizierter Pathologe zuständig, der mit Antikörpern, Reagenzien und den zur Auswertung der gefärbten Präparate angewandten Methoden vertraut ist. Die Färbung muss in einem offiziell zugelassenen, lizenzierten Labor unter Aufsicht eines Pathologen erfolgen, dessen Aufgabe es ist, die gefärbten Objektträger zu überprüfen und die Eignung der positiven und negativen Kontrollen zu gewährleisten. 5. Gewebe von mit dem Hepatitis-B-Virus infizierten Personen und Gewebe mit Hepatitis-B- Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) können mit Meerrettichperoxidase eine unspezifische Färbung aufweisen (27). 6. Reagenzien können in zuvor nicht getesteten Gewebetypen unerwartete Reaktionen zeigen. Selbst in getesteten Gewebetypen kann aufgrund von biologischen Unterschieden bei der Antigen-Expression in Neoplasmen oder anderen pathologischen Geweben die Möglichkeit unerwarteter Reaktionen nicht völlig ausgeschlossen werden (28). Es wird gebeten, dokumentierte unerwartete Reaktionen dem Technischen Kundendienst von Dako mitzuteilen. 7. Aufgrund der nicht-immunologischen Bindung von Proteinen oder Substrat- Reaktionsprodukten können falsch-positive Ergebnisse auftreten. Sie können ebenfalls ( ) P04087EFG_01_K / p. 114/152

115 durch Pseudoperoxidaseaktivität (Erythrozyten) und endogene Peroxidaseaktivität (Zytochrom C) hervorgerufen werden (28). Brustkrebs 8. Das Färbeverfahren ist bei Umgebungstemperaturen zwischen C durchzuführen. Produktspezifische Beschränkungen 1. Das in der 1+ Kontroll-Zelllinie MDA-175 vorhandene Antigen zersetzt sich mit der Zeit. Die Ergebnisse der Kontrollobjektträger im Zusammenhang mit dem Verfalldatum des Kontrollobjektträgers bewerten. Eine negative Färbung der MDA-175 Zellen zeigt möglicherweise nur an, dass der Kontrollobjektträger untauglich ist. Die Kontrollobjektträger sind bei 2-8 C zu lagern. 2. Falsch-negative Ergebnisse können die Folge eines mit der Zeit stattfindenden Antigenabbaus in den Geweben sein. Proben sollten innerhalb von 4-6 Wochen nach dem Einschließen der Präparate auf Objektträgern angefärbt werden, wenn die Lagerung bei Raumtemperatur (20-25 C) erfolgte (29). 3. Für optimale und reproduzierbare Ergebnisse ist es bei dem HER2-Protein erforderlich, die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung durchzuführen, wenn Gewebe nach Routineverfahren fixiert (neutrales gepuffertes Formalin oder Bouin-Lösung) und in Paraffin eingebettet wurden. Diese Vorbehandlung muss zu Beginn der gesamten Färbeprozedur abgeschlossen worden sein. Anleitungen sind dem Abschnitt über die Probenvorbereitung und die Behandlung von Geweben vor dem Abfärben zu entnehmen. 4. Die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung des HER2-Proteins darf nur in einem kalibrierten Wasserbad durchgeführt werden. Andere Erwärmungsverfahren wurden getestet, haben aber keine reproduzierbaren Resultate erbracht. 5. Kit-Reagenzien dürfen nicht gegen Reagenzien mit anderen Chargennummern oder gegen Reagenzien anderer Hersteller ausgetauscht werden. Hiervon ausgenommen ist lediglich der Waschpuffer (Wash Buffer), anstelle dessen der Dako Wash Buffer, Code-Nr. S3006 genutzt werden kann. 6. Die Auswertung der zytoplasmatischen Färbung könnte zu falschen Ergebnissen führen. Bei der Auswertung der Ergebnisse nur die Färbungsintensität der Zellmembran berücksichtigen. 7. Gefärbte Kontrollzelllinien sind nur zur Validierung des Färbedurchlaufs und nicht als Richtlinie für die Auswertung der Färbereaktion in Gewebeschnitten heranzuziehen. 8. Gelegentlich kann es zu einer ausgeprägten fokalen Färbung (3+), sogenannten Hot Spots kommen. Diese können die Folge einer ungleichmäßigen Gewebefixierung und/oder -verarbeitung sein. In diesen Fällen wird die Immunfärbung eines zweiten Gewebeblocks derselben Probe empfohlen. 9. Die Verwendung von HercepTest mit Proben, die mit anderen Fixiermitteln als neutral gepuffertem Formalin oder Fixiergemisch nach Bouin fixiert wurden, ist nicht validiert. 10. Normales Epithel in Brustgewebe sollte Färbungswerte zwischen 0 und 1+ aufweisen. Tritt bei normalem Epithel ein höherer Färbungswert als 1+ auf, sollte der Test wiederholt werden. Bitte beachten, dass aus Mandeln und Speiseröhre entnommenes, normales Epithelgewebe eine Färbungsintensität von bis zu 2+ aufweisen kann. Leistungsmerkmale - Brustkrebs Hintergrund Der für die Auswahl geeigneter Patientinnen für die klinischen Studien zu Herceptin verwendete CTA diente nur Versuchszwecken und ist nicht länger verfügbar. HercepTest wurde als Alternative zu dem CTA entwickelt. Sicherheit und Wirksamkeit von Herceptin wurden in einer randomisierten kontrollierten klinischen Studie und einer umfangreichen open-labelled -Studie untersucht (siehe Herceptin - Packungsbeilage). Alle Patientinnen, die in die klinischen Studien über Herceptin ( ) P04087EFG_01_K / p. 115/152

116 Brustkrebs aufgenommen wurden, wiesen eine in einem zentralen Labor durch immunzytochemische Tests mit dem CTA nachgewiesene Überexpression des HER2-Proteins auf. Patientinnen entsprachen den Einschlusskriterien für die Herceptin -Therapie, wenn ihr Tumor eine Grad 2+ oder 3+ entsprechende HER2-Überexpression zeigte (basierend auf einer Skala von 0-3+, wobei 3+ den höchsten Exprimierungsgrad repräsentierte). Eine Analyse einer Untergruppe der Ergebnisse dieser Studien legt nahe, dass Herceptin bei Patientinnen, deren Gewebe eine stark positive (3+) Überexpression des HER2-Proteins aufweist, wirksamer ist als bei Patientinnen mit nur schwach positivem Gewebe (2+). Der Grad der Überexpression von HER2-Protein ist hinsichtlich der voraussichtlichen Wirksamkeit der Herceptin -Therapie von potenziell signifikanter Aussagekraft. Da keine der Patientinnen in den Herceptin -Studien mit dem HercepTest ausgewählt wurde, liegen keine Daten über die Korrelation zwischen dem Positivitätsgrad und der Wahrscheinlichkeit des klinischen Nutzens einer Herceptin -Behandlung vor. Vergleichsstudien Zur Charakterisierung von HercepTest wurden zwei Studien durchgeführt. 1) Vergleich mit dem Clinical Trial Assay (CTA). 2) Genauigkeit im Vergleich mit fünf weiteren Assays. Vergleich mit dem Clinical Trial Assay (CTA) HercepTest wurde anhand von 274 HER2-Protein-positiven (2+ oder 3+) und der gleichen Anzahl HER2-Protein-negativer Brustkrebsgewebeproben mit dem zur Auswahl der Patientinnen für die Herceptin -Therapie verwendeten CTA verglichen. Tabelle 4 gibt die Ergebnisse in einer 2 x 2 Grafik wieder, wobei 0 und 1+ als negativ, 2+ und 3+ dagegen als positiv gelten. Tabelle 4. 2 x 2-Konkordanz des HercepTest mit dem Clinical Trial Assay (Anzahl der Proben) Clinical Trial Assay Positiv Negativ Gesamt HercepTest Positiv Negativ Gesamt Konkordanz: 79 % (76 82%) 95 % Konfidenzintervall. Die binäre Gesamtkonkordanz von HercepTest zum CTA lag bei 79 % (431/548), mit einem zweiseitigen 95 %igen Konfidenzintervall von 76 82%. Bei einundzwanzig Prozent (21 %) der Fälle führten die beiden Methoden nicht zu übereinstimmenden Ergebnissen. Die im HercepTest erhaltenen Resultate wurden auf einer von 0 bis 3+ reichenden Skala und mit folgenden Interpretationsbereichen hinsichtlich der Überexpression von HER2 mitgeteilt: negativ (Intensität der Farbreaktion: 0 und 1+), schwach positiv (Intensität der Farbreaktion: 2+) und stark positiv (Intensität der Farbreaktion: Tabelle 5. 3 x 3-Konkordanz für HercepTest und Clinical Trial Assay. Clinical Trial Assay Gesamt HercepTest Gesamt Diese 3 x 3-Darstellung der Konkordanzuntersuchung zeigt an, dass ein Messergebnis von 3+ mit HercepTest höchstwahrscheinlich einem positiven Ergebnis mit CTA entspricht, das die Kriterien für die Herceptin -Studie erfüllt hätte (2+ oder 3+). Allerdings bestand bei einem ( ) P04087EFG_01_K / p. 116/152

117 Brustkrebs Befund von 2+ mit HercepTest keine vergleichbar gute Korrelation zu den CTA-Ergebnissen. Ungefähr 42 % (53/126) der 2+-Ergebnisse mit HercepTest waren mit CTA negativ (0 1+) und hätten nicht zur Aufnahme in die klinischen Studien über Herceptin geführt. Genauigkeit HercepTest wurde ferner an je zwei Mikroskop-Objektträgern mit paraffineingebetteten Gewebeschnitten von 168 Mammatumoren getestet. Für diese Tumore war zuvor mit fünf verschiedenen Nachweisverfahren die Amplifikation des HER2-Gens und die Überexpression des HER2-Proteins ermittelt worden, z. B. mit internem Southern Blot, in situ Fluoreszenz- Hybridisierung (FISH) zur DNA-Amplifikation, Northern Blot RNA-Analyse, Western Blot und Immunzytochemie (ICC) an Gefrierschnitten (29). Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 erfasst. Tabelle 6. Vergleich des HercepTest mit den kombinierten Ergebnissen (OE) anhand von Untersuchungen der Genamplifikation und der Überexpression des HER2-Proteins OE-Klassifikation - Referenz + - Gesamt HercepTest Gesamt Positive Übereinstimmung: 43/69 = 62 % Negative Übereinstimmung: 99/99 = 100% Die Ergebnisse zeigten eine Übereinstimmungsrate von 85 % (142/168) an (95 % Konfidenzintervall von 78-89%) zwischen den mit HercepTest erzielten positiven (2+ und 3+) bzw. negativen (0 und 1+) Färbungsintensitäten. Keine der nach den 5 verschiedenen Verfahren negativ befundeten Proben war mit HercepTest positiv, dagegen ergaben die kombinierten Ergebnisse der 5 Verfahren eine höhere Anzahl positiver Fälle. Reproduzierbarkeit Reproduzierbarkeit innerhalb eines Testdurchgangs: Die Reproduzierbarkeit innerhalb eines Durchlaufs wurde in einem Labor mit 5 Proben anhand verschiedener immunzytochemischer Intensitäts-Scores untersucht. Jede Probe wurde dreimal in einem maskierten randomisierten Format getestet. Dieses Protokoll wurde für die automatisierte Färbung verwendet. Bei allen Proben waren die Ergebnisse zu 100 % reproduzierbar. Reproduzierbarkeit zwischen Testdurchgängen: Die Reproduzierbarkeit bei verschiedenen Durchläufen wurde in drei Labors mittels automatisierter Methodologie 4 Tage lang an 5 randomisierten und maskierten Proben mit unterschiedlichen Intensitäts-Scores untersucht. Mit Ausnahme von zwei Proben in einem Labor, die Schwankungen zwischen 1+ und 2+ aufwiesen, war die Reproduzierbarkeit der positiven im Vergleich zu den negativen Ergebnissen (0 und 1+ gegen 2+ und 3+) hervorragend. Die Reproduzierbarkeit für die mit 2+ und 3+ bewerteten Proben betrug 100 %. Reproduzierbarkeit zwischen Labors: Die Reproduzierbarkeit bei verschiedenen Labors wurde in drei geografisch getrennten Labors mit 40 identischen randomisierten und maskierten Proben mit unterschiedlichen ICC-Färbungsintensitätswerten getestet. An jedes Testlabor wurden Objektträger mit frischen Schnitten zur automatisierten Färbung und zur Untersuchung durch einen Pathologen weitergeleitet. Die prozentuale Übereinstimmung der Labors lag für eine dichotome Positiv-/Negativ-Bestimmung zwischen 83% und 90 %. Dabei waren 0 und 1+ negativ, 2+ und 3+ dagegen positiv auf HER2-Überexpression. Im Vergleich zu den Ergebnissen, die im Referenzlabor mit CTA erzielt worden waren, traten Diskrepanzen zwischen den als negativ (0 oder 1+) und positiv (2+ oder 3+) bewerteten Bestimmungen im Bereich von 12,5 % (15/120) der Vergleichsergebnisse auf. Bei weiteren 10 % (12/120) kam es zu Diskrepanzen zwischen den 2+- und 3+-Scores. ( ) P04087EFG_01_K / p. 117/152

118 Brustkrebs Immunreaktivität Tabelle 7 gibt einen Überblick über die Immunreaktivität von HercepTest mit den empfohlenen normalen Geweben. Alle Gewebe waren mit Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet worden und wurden in Übereinstimmung mit den Anleitungen der Packungsbeilage mit dem HercepTest angefärbt. Tabelle 7. Zusammenfassung der Reaktivität normaler Gewebe mit dem HercepTest Gewebetyp (Anz. getestet) Positive Gewebeelementfärbung und Färbungsmuster Nebenniere (3) Knochenmark (3) Hirn/Zerebellum (3) Hirn/Zerebrum (3) Mamma (3) Cervix uteri (3) Colon (3) Ösophagus (3) Herz (3) Niere (3) Leber (3) Lunge (3) Mesothelzellen (3) Ovar (3) Pankreas (3) Parathyroida (3) Peripherer Nerv (3) Hypophyse (3) Prostata (3) Speicheldrüse (3) Skelettmuskel (3) Haut (3) Dünndarm (3) Milz (3) Magen (3) Testes (3) Thymus (3) Thyroida (3) Tonsille (3) Uterus (3) Keine Keine Keine Keine Brustdrüse (1 von 3 Geweben, Färbungsintensität: 1+) Keine Keine Keine Keine Tubuli des Nierenmarks (3 von 3 Geweben, 1 2+ bei 5 50% der Zellen, zytoplasmisch) Keine Keine Keine Keine Keine Keine Keine Keine Prostatadrüse/-gänge (3 von 3 Geweben, Färbungsintensität: 1+, 50 % der Zellen, zytoplasmisch) Keine Keine Schweißdrüsen (1 von 3 Geweben, 1+, 30% der Zellen, zytoplasmisch) Zylinderepithel, Oberfläche (1 von 3 Geweben, Färbungsintensität: 2+, 25% der Zellen) Keine Epithel (1 von 3 Geweben, Färbungsintensität: 1+, 25% der Zellen) Keine Keine Keine Plattenepithelien (3 von 3 Geweben, Färbungsintensität: 1+, 80% der Zellen) Keine Sofern nicht anders angegeben, war die beschriebene Färbung in allen Geweben membranös. Alle drei Proben jedes Gewebetyps wiesen außer anders lautend angegeben die gleiche Färbungsintensität auf. ( ) P04087EFG_01_K / p. 118/152

119 Brustkrebs Fehlersuche - Brustkrebs Es ist auf den Abschnitt zur Störungsbeseitigung in dem unter (19) angegebenen Handbuch Bezug zu nehmen. Ungewöhnliche Anfärbungen können dem Technischen Kundendienst von Dako zur Kenntnis gebracht werden. Problem Wahrscheinliche Ursache Empfohlene Maßnahme 1. Keine Färbung der Objektträger 1a. Programmierfehler. Reagenzien in falscher Reihenfolge verwendet 1b. Reagenzieneinsätze wurden nicht in den korrekten Lokationen in den Reagenzienaufnahmen untergebracht 1c. Unzureichende Reagenzienmenge in Reagenzieneinsatz 1a. Programmierungsraster überprüfen, um das korrekte Programmieren des Färbedurchgangs zu verifizieren 1b. Reagenzien-Diagramm überprüfen, um die korrekte Lokation der Reagenzieneinsätze zu verifizieren 1c. Vor Beginn des Testdurchlaufs überprüfen, ob genügend Reagenz in die Reagenzgläser eingefüllt wurde. Die benötigten Volumina dem Positionsschema für Reagenzien entnehmen. 1d. Natrim-Azid in der Waschlösung 1d. Frischen Ansatz des im Kit enthaltenen Waschpuffers (Wash Buffer) verwenden 1e. Übermäßig starkes Erwärmen der eingebetteten Gewebeschnitte vor der Entparaffinierung und wärmeinduzierten Antigendemaskierung kann zu einem Verlust der sichtbaren HER2- Immunreaktionsfähigkeit führen. 1e. Sie trocknen die Gewebeschnitte an der Luft bei Raumtemperatur mindestens 12 Stunden lang oder bis zur vollständigen Trockenheit. Oder bei 37 C über Nacht oder bei 60 C maximal 1 Stunde. Die Trocknung der Gewebeschnitte bei erhöhten Temperaturen darf nur in einem kalibrierten Ofen mit gleichförmiger Wärmeverteilung erfolgen (17). 2. Schwache Färbung der Objektträger 2a. Inadäquate Epitopdemaskierung 2a. Überprüfen, ob die Epitope Retrieval Solution 40 Minuten lang eine Temperatur von C aufgewiesen hat und weitere 20 Minuten Zeit zum Abkühlen hatte 2b. Unzureichende Inkubationszeiten der Reagenzien 2c. Ungeeignete Fixiermethode angewendet. 2d. Übermäßig starkes Erwärmen der aufgezogenen Gewebeschnitte vor der Entparaffinierung und wärmeinduzierten Antigen- Demaskierung kann zu einem erheblichen Abfall der sichtbaren HER2-Immunreaktionsfähigkeit führen. 2b. Anleitungen für die Färbeprozedur erneut überprüfen 2c. Sicherstellen, dass das Patientengewebe nicht übermäßig fixiert oder kein alternatives Fixiermittel verwendet wurde 2d. Sie trocknen die Gewebeschnitte an der Luft bei Raumtemperatur mindestens 12 Stunden lang oder bis zur vollständigen Trockenheit. Oder bei 37 C über Nacht oder bei 60 C maximal 1 Stunde. Die Trocknung der Gewebeschnitte bei erhöhten Temperaturen darf nur in einem kalibrierten Ofen mit gleichförmiger Wärmeverteilung erfolgen (17). ( ) P04087EFG_01_K / p. 119/152

120 Brustkrebs 3. Zu starke Hintergrundfärbung der Objektträger 2e. Ungenügende Reagenzienmenge hinzugegeben. 2e. Größe (22 mm x 22 mm) des Gewebeschnitts und hinzugegebene Reagenzienmenge überprüfen. 3a. Paraffin nicht vollständig entfernt 3a. Frische Reinigungslösungen verwenden und die im Abschnitt B.1 beschriebenen Verfahren befolgen 3b. Beim Aufbringen der Schnitte auf die Objektträger wurden Stärkezusätze verwendet 3b. Keinerlei Stärkezusätze zur Haftung der Schnitte an der Glasoberfläche verwenden. Viele Additive sind immunreaktiv 4. Gewebe lösen sich vom Objektträger ab 5. Übermäßig starke spezifische Anfärbung 6. Schwaches Anfärben der 1+ Zelllinie des Kontrollobjektträgers 3c. Objektträger wurden unzureichend gespült 3d. Schnitte sind während der Färbung ausgetrocknet 3e. Schnitte trockneten während des Einsetzens in den Autostainer aus 3f. Ungeeignete Fixiermethode angewendet. 3g. Unspezifische Bindung der Reagenzien an Gewebe 4a. Verwendung ungeeigneter Objektträger 5a. Ungeeignete Fixiermethode angewendet. 5b. Nutzung einer unangemessenen Wärmequelle für die Epitopdemaskierung, z. B. Dampfapparat, Mikrowelle oder Autoklav 3c. Autostainer muss vor dem Durchlauf vorschriftsmäßig vorgefüllt sein. Prüfen, ob ausreichend Puffer für den gesamten Durchlauf vorhanden ist. Frisch angesetzte Puffer- und Waschlösungen verwenden. 3d. Überprüfen, ob den Schnitten das korrekte Reagenzvolumen zugegeben wurde. Sicherstellen, dass der Testdurchgang bei geschlossener Abdeckung des Autostainer durchgeführt wird und keine Aussetzung zu starker Wärme oder Zug erfolgt. 3e. Sicherstellen, dass die Schnitte während des Ladens in das Gerät und vor Starten des Durchgangs mit Puffer befeuchtet bleiben 3f. Korrektes Fixiermittel benutzen. Alternative Fixiermittel können übermäßige Hintergrundfärbung verursachen 3g. Die Proben auf vorschriftsmäßige Fixierung und eventuelle Nekrose überprüfen 4a. Silanisierte Objektträger wie z. B. Dako Silanized Slides, Code-Nr. S3003, SuperFrost Plus oder mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger verwenden 5a Sicherstellen, dass nur zugelassene Fixative und Fixiermethoden verwendet werden 5b. Sicherstellen, dass für den Schritt der Epitopdemaskierung ausschließlich ein Wasserbad genutzt wird 5c. Reagenzien zu lange inkubiert 5c. Anleitungen für die Färbeprozedur erneut überprüfen 5d. Falsche Waschlösung verwendet 5d. Nur den für das Kit empfohlenen Waschpuffer verwenden 6a. Falsches Protokoll für die Epitopdemaskierung 6a. Objektträger in die vorgewärmte Epitopdemaskierungslösung eintauchen. Temperatur der Lösung wieder auf C bringen und Vorbehandlung ganze 40 Minuten lang durchführen ( ) P04087EFG_01_K / p. 120/152

121 Brustkrebs 7. Epitopdemaskierungslösung trübt sich bei Erwärmung 8. Epitopdemaskierungslösung ist bei Aufbewahrung getrübt (vor der Erwärmung) 6b. Mangelnde Reaktion mit Substrat- Chormogen-Lösung (Substrate- Chromogen Solution, DAB) 6c. Degradation des Kontrollobjektträgers 7. Bei Erwärmung trübt sich die Lösung 8. Die Lösung wurde falsch aufbewahrt oder das Verfallsdatum der Lösung ist abgelaufen 6b. Sicherstellen, dass die gesamte Inkubationszeit von 10 Minuten genutzt wird. Sicherstellen, dass dem DAB-gepufferten Substrat lediglich 1mL DAB Chromogen zugesetzt wurde 6c. Verfallsdatum und Lagerungsbedingungen des Kits überprüfen (siehe Aufdruck auf Außenverpackung) 7. Dies ist normal und beeinträchtigt die Färbung nicht 8. Das auf der Verpackung aufgedruckte Verfallsdatum des Kits sowie dessen Lagerungsbedingungen überprüfen. Epitopdemaskierungslösung entsorgen HINWEIS: Sollte das Problem nicht auf eine oder mehrere der oben angeführten Ursachen zurückzuführen sein oder wenn das Problem durch die vorgeschlagene Abhilfemaßnahme nicht ausgeräumt werden kann, wird gebeten, den Technischen Kundendienst von Dako zu verständigen. Weitere Informationen über Färbeverfahren und Probenvorbereitung finden sich in dem bereits genannten Handbuch von Dako (19) (kann von Dako bezogen werden), im Atlas of Immunohistology (30) und in Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04087EFG_01_K / p. 121/152

122 Magenkrebs Zusammenfassung und Erläuterung - Magenkarzinom Hintergrund Das humane HER2-Gen (auch ERBB2 oder NEU genannt) kodiert ein oft als HER2-Protein oder p185 HER2 bezeichnetes Protein. Das HER2-Protein ist eine Membranrezeptor- Tyrosinkinase, die strukturell dem epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor entspricht (EGFR oder HER1) (1-8). Es stellt eine normale, von zahlreichen Epithelzelltypen exprimierte Komponente dar (8). Bei einer großen Anzahl von Studien wurde eine Überexpression des HER2-Proteins und Amplifikation des HER2-Gens bei Magenkrebs nachgewiesen. HER2-Positivität kann entweder durch das IHC- oder das FISH-Verfahren bei etwa 20 % der Patienten nachgewiesen werden (32). Vorklinische In-vitro- und In-vivo-Studien haben erwiesen, dass Trastuzumab (Herceptin ) bei verschiedenen Magenkrebsmodellen wirksam ist, was zur Einleitung mehrerer klinischer Studien geführt hat (32-36). In einer Phase III BO18255 Studie, der ToGA-Studie, wurden HER2-positive Patienten mit inoperablem lokal fortgeschrittenem, rezidivierendem und/oder metastatischem Adenokarzinom des Magens bzw. ösophagogastralen Übergangs randomisiert, und ihnen wurde 5-FU oder Capecitabine und Cisplatin entweder allein oder in Verbindung mit Trastuzumab verabreicht. Bei den Patienten, die die kombinierte Behandlung aus Trastuzumab und Chemotherapie erhalten haben, wurde eine statistisch signifikante Erhöhung des Gesamt-Überlebens (OS) festgestellt (37). Trastuzumab ist ein humanisierter monoklonaler Antikörper, der sich mit hoher Affinität an das HER2-Protein bindet und die Proliferation von menschlichen, das HER2-Protein überexprimierenden Tumorzellen nachweislich in vitro und in vivo hemmt (10-13). Eigenschaften Im Rahmen der ToGA-Studie wurde der HER2-Status von 3803 Patienten untersucht. In dieser Studie wurden sowohl die HER2-Überexpression durch IHC (HercepTest, Dako) als auch die Amplifikation des HER2-Gens durch FISH (HER2 FISH pharmdx, Dako) ermittelt. Es wurden gültige Testergebnisse von 3665 Proben mit entweder IHC- oder FISH-Tests ermittelt; bei 3280 Proben mit beiden Tests. Im Ergebnis der ToGA-Studie wurde nachgewiesen, dass 22,1 % der Patienten mit fortgeschrittenem Magenkrebs sich per Definition der ToGA-HER2-Auswahlkriterien entweder im IHC- oder im FISH-Verfahren als HER2-positiv erwiesen (38). Weitere Informationen bezüglich der Verwendung des HercepTest bei der Bewertung von Patienten, für die eine Behandlung mit Trastuzumab in Erwägung gezogen wird, finden Sie in der Packungsbeilage für Herceptin. Prinzip des Testverfahrens - Magenkarzinom HercepTest enthält die erforderlichen Reagenzien, um ein zwei Schritte umfassendes immunzytochemisches Färbeverfahren an routinemäßig verarbeiteten, paraffineingebetteten Gewebeproben durchzuführen. Im Anschluss an die Inkubation mit dem primären Kaninchen- Antikörper gegen humanes HER2-Protein verwendet dieses Kit ein gebrauchsfertiges Visualization Reagent auf Basis der Dextrantechnologie. Das Reagenz enthält sowohl sekundäre Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulinmoleküle als auch mit einem gemeinsamen Dextranpolymer-Backbone verknüpfte Meerrettichperoxidasemoleküle, wodurch die sequenzielle Anwendung von Link-Antikörper und peroxidasekonjugiertem Antikörper überflüssig wird. Kreuzreaktivität des Visualization Reagent mit humanen Immunglobulinen und fötalem Rinderserum wurde durch Festphasen-Absorption ausgeschlossen. Die enzymatische Umwandlung des anschließend zugegebenen Chromogens führt zur Ausbildung eines sichtbaren Reaktionsprodukts an der Antigenstelle. Danach können die Proben gegengefärbt ( ) P04087EFG_01_K / p. 122/152

123 Magenkrebs und eingedeckt werden. Ergebnisse werden mithilfe eines Lichtmikroskops ausgewertet. Zur Validierung der Färbedurchgänge werden Kontrollschnitte mit drei formalinfixierten, paraffineingebetteten Brustkrebszelllinien mit Färbungsintensitätswerten von 0, 1+ und 3+ mitgeliefert. Die Färbungsintensität dieser Zelllinien korreliert mit der Anzahl der Rezeptoren pro Zelle. HercepTest, Code-Nr. K5207, dient für die automatisierte Verarbeitung unter Nutzung des Autostainer". Reagenzien - Magenkarzinom Mitgelieferte Materialien Die unten aufgeführten Materialien reichen für 50 Tests (50 mit primärem Antikörper gegen das HER2-Protein inkubierte Objektträger und 50 mit dem entsprechenden negativen Kontrollreagenz inkubierte Objektträger). Die Anzahl der Tests basiert für jedes Reagenz auf einer Menge von 200 µl je Gewebeschnitt (22 mm x 22 mm) aus den Fläschchen. 1, 2, 3 und 4 sowie von der Substrat-Chromogen-Lösung (DAB). Die im Kit gelieferten Materialien sind ausreichend für höchstens 15 Färbevorgänge. Fläschchen Nr. Menge 1 2 x 11 ml 2 1 x 12 ml 3 2 x 11 ml 4 1 x 12 ml 5 15 x 11 ml 6 3 x 3 ml Beschreibung Peroxidase-Blocking Reagent: 3 % Wasserstoffperoxid, enthält 15 mmol/l Natriumazid (NaN 3 ). Rabbit Anti-Human HER2 Protein: Gebrauchsfertiger affinitätsisolierter Antikörper. Geliefert in 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, mit Stabilisatorprotein. Immunogen: An Keyhole Limpet Hämocyanin gekoppeltes synthetisches C-terminales Fragment (intrazytoplasmatischer Teil) des HER2-Proteins. Spezifität: HER2-Protein Reinigungsverfahren: Der Antikörper wird durch ein trägerfixiertes Peptid des HER2-Proteins affinitätsisoliert. Visualization Reagent: Mit Meerrettichperoxidase und affinitätsisolierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulinen konjugiertes Dextranpolymer. Geliefert in Tris/HCI-Puffer mit Stabilisatorprotein und einer antimikrobiellen Substanz. Negative Control Reagent: Immunglobulinfraktion normalen Kaninchenserums in einer dem Antikörper gegen das HER2- Protein äquivalenten Proteinkonzentration. Geliefert in 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, mit Stabilisatorprotein. DAB Buffered Substrate: Substratpufferlösung, ph 7,5, enthält < 0,1 % Wasserstoffperoxid, Stabilisatoren, Beschleuniger und eine antimikrobielle Substanz. DAB Chromogen: 5 % 3,3'-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid in ( ) P04087EFG_01_K / p. 123/152

124 7 3 x 500 ml 8 2 x 1 L 3 x 5 Objektträger Chromogenlösung. Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): 0,1 mol/l Zitratpuffer mit Detergenz. Wash Buffer (10x): Tris/HCl-Puffer mit Detergenz und antimikrobiellem Wirkstoff. Magenkrebs Control Slides: Jeder Objektträger enthält Schnitte von drei formalinfixierten, paraffineingebetteten Brustkrebszelllinien, die unterschiedliche Stufen der HER2-Proteinexpression darstellen. MDA-231 (0), MDA-175 (1+) und SK-BR-3 (3+). Die Kontrollobjektträger wurden zur besseren Haftung der Schnitte an den Glasobjektträger einer Wärmebehandlung unterzogen. Jede weitere, zur besseren Anhaftung der Schnitte an den Glas-Objektträger durchgeführte Wärmebehandlung der Kontrollobjektträger kann die Färbungsergebnisse beeinträchtigen. HINWEIS: Alle Reagenzien, einschließlich Epitope Retrieval Solution und Wash Buffer, wurden spezifisch für die Anwendung bei diesem Assay konzipiert. Damit der Test spezifikationsgemäß durchgeführt werden kann, dürfen keine Substitutionen vorgenommen werden. Hiervon ausgenommen ist der Waschpuffer, anstelle dessen Dako Code-Nr. S3006 genutzt werden kann. Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs) Ammoniumhydroxid, 15 mol/l, verdünnt auf 37 mmol/l Gegenfärbung: Hämatoxylin, wie beispielsweise wasserbasierendes Mayer's Hematoxylin, Dako Code-Nr. S3301 (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, A.4) Deckgläser Destilliertes oder entionisiertes Wasser (Waschflüssigkeit) Trockenofen, der imstande ist, eine Temperatur von maximal 60 C aufrechtzuerhalten. Ethanol, absolut und 95 % Lichtmikroskop (4-fache bis 40-fache Vergrößerung) Eindeckmedium, z. B. Dako Faramount, Code-Nr. S3025, oder Dako Glycergel, Code-Nr. C0563. Positive und negative Gewebe zur Verfahrenskontrolle (siehe Abschnitt Qualitätskontrolle) Objektträger, SuperFrost Plus, mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger oder Dako Silanized Slides, Code-Nr. S3003 (siehe Abschnitt zur Probenvorbereitung) Färbeschalen oder -bäder Kurzzeitwecker (auf Zeitabstände zwischen 2 40 Minuten ausgelegt) Wasserbad mit Deckel (darauf ausgelegt, die Epitope Retrieval Solution auf einer Temperatur von C zu halten) Xylol, Toluol oder Xylolersatz K5207 wurde spezifisch ausgelegt für die Anwendung zusammen mit dem Autostainer Immunostaining System, Code-Nr. S3400. Die für den Autostainer benötigten Komponents können der Autostainer-Bedienungsanleitung entnommen werden. ( ) P04087EFG_01_K / p. 124/152

125 Magenkrebs Aufbewahrung - Magenkarzinom Bei 2-8 C lagern. Das Kit nach Ablauf des auf der Verpackung aufgedruckten Verfalldatums nicht mehr verwenden. Werden die Reagenzien anders als entsprechend den in der Packungsbeilage angegebenen Bedingungen aufbewahrt, muss deren Verwendung vom Benutzer bestätigt werden (14a, 14b). Die Kontrollobjektträger sind ebenfalls bei 2-8 C zu lagern. Es gibt keine offensichtlichen Anzeichen für eine eventuelle Produktinstabilität. Es sollten daher die Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitgeführt werden. Wenn unerwartete Anfärbung beobachtet wird, welche durch Änderungen in den Labormethoden nicht erklärt werden kann und falls Verdacht auf ein Problem mit dem HercepTest besteht, ist bitte Kontakt mit unserem technischen Kundendienst aufzunehmen. Probenvorbereitung - Magenkarzinom Magen-Adenokarzinomproben, einschließlich des ösophagogastralen Übergangs aus Biopsien, Exzisionen oder Resektionen müssen korrekt gehandhabt werden, damit das Gewebe für die immunzytochemische Färbung erhalten bleibt. Bei allen Proben sind Standardverfahren der Gewebeverarbeitung anzuwenden (15). Bei der Untersuchung von Biopsieproben mit sehr wenig Gewebe muss eine intakte Tumormorphologie und das Vorliegen einer ausreichenden Anzahl an Tumorzellen für die IHC-Bewertung gewährleistet sein. Um eine zuverlässige Bestimmung des HER2-Status zu gewährleisten, wenn die Analyse einer Biopsieprobe mit dem HercepTest durchgeführt wird, ist es erforderlich, mehrere (7-8) auswertbare Biopsien aus verschiedenen Regionen des Tumors zu analysieren. Paraffineingebettete Schnitte Geeignet sind in neutral gepuffertem Formalin fixierte und paraffineingebettete Gewebe. Die Proben sollten in 3 oder 4 mm dicke Blöcke geschnitten und in neutral gepuffertem Formalin Stunden lang fixiert werden Biopsieproben wurden in der ToGA-Studie 6 8 Stunden fixiert (Literaturhinweise zur Studie siehe (37)). Die Dehydrierung der Gewebeschnitte erfolgt dann in einer Reihe von Alkoholen und in Xylen, gefolgt von der Infiltration mit geschmolzenem Paraffin, das auf einer Temperatur von nicht mehr als 60 C gehalten wird. Sachgemäß fixierte und eingebettete Gewebe, die das HER2-Protein exprimieren, sind vor dem Anfertigen der histologischen Schnitte und dem Aufziehen auf Objektträgern bei kühler Lagerung (15-25 C) unbegrenzt haltbar (15, 16). Für Anwender in den USA wird gemäß dem Clinical Laboratory Improvement Act of 1988 (Clinical Laboratory Improvement Act aus dem Jahr 1988), Abschnitt 42 CFR (b) vorgeschrieben, dass das Labor gefärbte Objektträger mindestens zehn Jahre und Probenblöcke mindestens zwei Jahre ab Untersuchungsdatum aufbewahren muss (16). Die Gewebeproben sollten in Schnitte von 4 5 µm Stärke geschnitten und auf Objektträger gezogen werden und bei Raumtemperatur mindestens 12 Stunden (oder bis zur vollständigen Trockenheit) bzw. bei 37 C über Nacht oder bei 60 C eine Stunde lang an der Luft trocknen. VORSICHT: Übermäßiges Erwärmen für mehr als 1 Stunde bei 60 C kann zu einem erheblichen Abfall oder Verlust der spezifischen membranständigen HER2- Immunreaktionsfähigkeit führen (17). Um die Antigenizität aufrechtzuerhalten, sollten die auf Objektträger gezogenen Schnitte (SuperFrost/Plus, Poly-L-Lysin oder mit Silan behandelte Objektträger) innerhalb 4-6 Wochen nach dem Aufschneiden gefärbt werden, wenn sie bei Raumtemperatur (20-25 C) aufbewahrt werden (18). Die für die Evaluation des HER2-Proteins und für die Verifikation des Vorliegens des Tumors benötigten Objektträger werden zur gleichen Zeit vorbereitet. Es wird ein Minimum von 5 Objektträgern empfohlen: 1 Objektträger für die Tumorpräsenz, 2 Objektträger für die ( ) P04087EFG_01_K / p. 125/152

126 Evaluation des HER2-Proteins (1 für die Inkubation mit Fläschchen Nr. 2 und 1 für die Inkubation mit Fläschchen Nr. 4) und 2 Objektträger zu Reservezwecken. Magenkrebs Die Verwendung des HercepTest TM bei dekalzifizierten Geweben wurde nicht validiert und wird nicht empfohlen. Weitere Informationen zur Probenvorbereitung finden Sie im Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19) von Dako und unter den Literaturhinweisen 15 und 16. Gewebebehandlung vor der Färbung Für optimale Assay-Leistung muss ein spezifisches Verfahren für die Epitopdemaskierung eingesetzt werden, und zwar das Kochen in 10 mmol/l Citratpuffer. Die Epitope Retrieval Solution ist im HercepTest -Kit enthalten. Für dieses Verfahren werden die auf Objektträgern aufgezogenen Gewebeschnitte erwärmt, während sie in 10 mmol/l Citratpuffer eingetaucht sind (20). Hierzu wird ein kalibriertes Wasserbad verwendet, mit dem die Demaskierungslösung auf der benötigten Temperatur (95-99 C) gehalten w ird. Labors in bestimmten Höhenlagen sollten das beste Verfahren für die Beibehaltung der erforderlichen Wasserbad-Temperatur selbst ermitteln. Die Demaskierung muss in einem Wasserbad erfolgen. Andere Erwärmungsverfahren wurden getestet, haben aber keine reproduzierbaren Resultate erbracht. Das Färbeverfahren unmittelbar im Anschluss an die Demaskierung durchführen. Abweichungen vom beschriebenen Vorgehen können die Ergebnisse beeinträchtigen. Vorsichtsmaßnahmen - Magenkarzinom 1. Zur In-vitro-Diagnostik. 2. Nur für Fachpersonal bestimmt. 3. Fläschchen 1, Peroxidase-Blocking Reagent, enthält 3 % Wasserstoffperoxid. Auf Anfrage ist ein Sicherheitsdatenblatt für Fachpersonal erhältlich. 4. Fläschchen 6, DAB Chromogen, enthält 5-<10% Biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammoniumtetrachlorid und ist wie folgt gekennzeichnet: H350 H341 P201 P280 Gefahr P308 + P313 P405 P501 Kann Krebs erzeugen. Kann vermutlich genetische Defekte verursachen. Vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen Schutzhandschuhe tragen. Augenschutz oder Gesichtsschutz tragen. Schutzkleidung tragen. BEI Exposition oder falls betroffen Ärztliche Hilfe anfordern. Unter Verschluss aufbewahren. Inhalt und Behälter in Übereinstimmung mit allen lokalen, regionalen, nationalen und internationalen Gesetzen entsorgen. Als Hauptregel ist die Arbeit mit diesem Produkt Personen unter 18 Jahren untersagt. Der Benutzer ist in der Ausführung der Arbeit den gefährlichen Eigenschaften dieses Produktes sowie den notwendigen Sicherheitsmaßnahmen gründlich zu unterweisen. Weitere Informationen entnehmen Sie dem Sicherheitsdatenblatt (SDB). 5. Fläschchen 8, Wash Buffer (10x), enthält 5-<10% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propan-1,3- diolhydrochlorid und 0.1-<0.2% 5-Brom-5-nitro-1,3-dioxan. Kann allergische Reaktionen hervorrufen. Fläschchen 8, Wash Buffer (10x), ist gekennzeichnet: ( ) P04087EFG_01_K / p. 126/152

127 Magenkrebs Achtung H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Verursacht schwere Augenreizung. Augenschutz oder Gesichtsschutz tragen. Nach Gebrauch Hände gründlich waschen. BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. 6. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN 3 ), eine in reiner Form äußerst giftige Chemikalie. Ansammlungen von NaN 3 können auch in Konzentrationen, die nicht als gefährlich klassifiziert sind, mit Blei- und Kupferabflussrohren reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung muss mit reichlich Wasser nachgespült werden, um Metall-Azid-Anreicherung zu vermeiden (21, 22). 7. Die Fläschchen 2, 3 und 4 enthalten Material tierischen Ursprungs. Wie alle Produkte biologischen Ursprungs müssen auch diese entsprechend gehandhabt werden. 8. Sowohl vor dem Fixieren als auch danach sind Kontrollobjektträger und Proben sowie alle damit in Berührung kommenden Materialien so zu handhaben, als könnten sie Krankheiten übertragen. Bei der Entsorgung sind angemessene Vorsichtsmaßnahmen zu beachten (23). Reagenzien nie mit dem Mund pipettieren und Haut- bzw. Schleimhautkontakt mit Reagenzien und Proben vermeiden. Empfindliche Bereiche nach Kontakt mit den Reagenzien mit reichlich Wasser waschen. 9. Die mikrobielle Kontamination der Reagenzien muss so gering wie möglich gehalten werden, um eine unspezifische Färbung zu vermeiden. 10. Inkubationszeiten, Temperaturen oder Methoden, die hier nicht ausdrücklich beschrieben sind, können die Ergebnisse beeinträchtigen. Übermäßig starkes Trocknen bei 60 C für mehr als eine Stunde kann zu einem erheblichen Abfall oder Verlust der spezifischen membranständigen HER2-Immunreaktionsfähigkeit führen (17). 11. Die Reagenzien wurden zur Verwendung mit dem Eridan Staining System optimal verdünnt. Weitere Verdünnung kann zu einer geringeren Antigenfärbung führen. 12. Alle Reagenzien, einschließlich Epitope Retrieval Solution und Wash Buffer, wurden spezifisch für die Anwendung bei diesem Assay konzipiert. Damit der Test spezifikationsgemäß durchgeführt werden kann, dürfen keine Substitutionen vorgenommen werden. Hiervon ausgenommen ist der Waschpuffer, anstelle dessen Dako Code-Nr. S3006 genutzt werden kann. 13. Zu starke Lichteinstrahlung kann für das Visualisierungsreagenz und das DAB-Chromogen schädlich sein. Systemkomponenten nicht bei starker Lichteinwirkung lagern und keine Färbungen bei hellem Licht, wie z. B. direktem Sonnenlicht, vornehmen. 14. Um einen Kontakt mit Augen und Haut zu vermeiden, ist angemessene persönliche Schutzausrüstung zu tragen. Weitere Informationen bitte dem Material- Sicherheitsdatenblatt (SDB) entnehmen. 15. Paraffinüberreste können zu falsch-negativen Ergebnissen führen. 16. Zur korrekten Auswertungder HercepTest -Ergebnisse gefärbter Biopsieproben von Magen-Adenokarzinomgewebe, einschließlich des ösophagogastralen Übergangs, wird ein Cluster von mindestens 5 gefärbten Tumorzellen empfohlen. Ein Cluster von mindestens 5 gefärbten Tumorzellen enthält 5 verbundene HER2-gefärbte Tumorzellen. 17. Aufgrund der Heterogenität von Magenkrebsproben müssen HER2 IHC-Tests unbedingt an mehreren (7-8) Biopsieproben aus verschiedenen Bereichen des Tumors durchgeführt werden, um ein zuverlässiges Ergebnis zu erzielen. ( ) P04087EFG_01_K / p. 127/152

128 Magenkrebs 18. Andere als die empfohlenen Reagenzienmengen können zu einem Verlust der sichtbaren HER2-Immunreaktivität führen. Gewebeschnitte mit einer Größe von mehr als 22 mm x 22 mm erfordern 2 3 Mal 200 µl Reagenz auf 2 3 automatischen Applikationsbereichen. 19. Es wird empfohlen, mehr als einen Gewebeblock von Magenkrebs-Resektionen zu testen, wenn die Probe einen hohen Grad an Heterogenität aufweist (41). ( ) P04087EFG_01_K / p. 128/152

129 Magenkrebs GEBRAUCHSANWEISUNG - Magenkarzinom A. Reagenzienvorbereitung Es wird empfohlen, die folgenden Reagenzien vor der Färbung anzusetzen: A.1 Epitopdemaskierungslösung Für das geplante Färbeverfahren eine ausreichende Menge des Inhalts von Fläschchen 7 (Epitope Retrieval Solution 10x) mit destilliertem oder entionisiertem Wasser im Verhältnis 1:10 verdünnen. Nicht verbrauchte angesetzte Lösung kann einen Monat lang bei 2-8 C aufbewahrt werden. Getrübte verdünnte Lösung entsorgen. A.2 Waschpuffer Eine für die Wasch-Schritte ausreichende Menge Waschpuffer (Wash Buffer 10x), Fläschchen 8, mit destilliertem oder entionisiertem Wasser im Verhältnis 1:10 ansetzen. Nicht verbrauchter angesetzter Puffer kann einen Monat lang bei 2-8 C aufbewahrt werden. Getrübten Puffer entsorgen. Die Programmierung des Autostainer sieht vor, dass Gewebeschnitte nach dem Auftrag des Peroxidase-Blocking Reagent und der Substrate-Chromogen Solution gespült werden. Es sollte beachtet werden, dass für diese Spülschritte entweder destilliertes (oder entionisiertes) Wasser oder Waschpuffer genutzt werden können. Alle anderen Spülschritte sind mit Waschpuffer durchzuführen. A.3 Substrat-Chromogenlösung (DAB) Die Substratchromogenlösung durch Zugabe von 11 Tropfen (25-30 µl pro Tropfen) DAB Chromogen aus Fläschchen 6 in das DAB-gepuffertes Substrat (11 ml) enthaltende Fläschchen 5 ansetzen und mischen. Angesetzte Substrate-Chromogen Solution (DAB) ist bei der Lagerung bei 2-8 C circa 5 Tage lang stabil. Die angesetzte Lösung muss vor der Verwendung gründlich vermischt werden. In der Lösung auftretendes Präzipitat beeinträchtigt die Qualität der Färbung nicht. HINWEIS: Die Farbe des in Fläschchen 6 enthaltenen DAB Chromogen kann von durchsichtig bis hin zu einer hellen lavendelbraunen Schattierung reichen. Die Leistung dieses Produkts wird hierdurch nicht beeinträchtigt. Bitte entsprechend den Richtlinien in dieser Packungsbeilage verdünnen. Eine Zugabe von zu viel DAB Chromogen zum DAB gepufferten Substrat führt zur Abschwächung des positiven Signals. A.4 Gegenfärbung Das gefärbte Endprodukt der DAB-Färbungsreaktion ist sowohl in Wasser als auch in Alkohol unlöslich. Es ist ein Hämatoxylin-Gegenfärbemittel zu verwenden und die Hämatoxylin- Färbungsintensität ist auf einen ähnlichen Ausprägungsgrad einzustellen, wie er im von Dako herausgegebenen HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer angeführt ist. Es kann entweder alkohol- oder wasserbasierendes Hämatoxylin verwendet werden, wie z. B. Dako Mayer's Hematoxylin, Code-Nr. S3301. Nach der Hämatoxylin-Gegenfärbung wird eine gründliche Spülung mit destilliertem oder entionisiertem Wasser durchgeführt, woraufhin die Objektträger mit Gewebeproben in ein Bad mit 37 mmol/l NH 3 -Wasser eingetaucht werden (siehe Abschnitt B.2, Schritt 3). Ammoniakwasser (37 mmol/l) wird wie folgt angesetzt: 2,5 ml (konzentriertes) Ammoniakhydrat, 15 mol/l, mit 1L destilliertem oder entionisiertem Wasser vermischen. Nicht verwendetes 37 mmol/l Ammoniakwasser kann bei Raumtemperatur (20-25 C) in einer gut verschlossenen Flasche bis zu 12 Mon ate aufbewahrt werden. A.5 Fixiermittel Empfohlen wird ein nichtwässriges Mittel zur permanenten Fixierung. Es kann aber auch eine wässrige Fixierung verwendet werden. Hierfür werden Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use, Code-Nr. S3025, oder Glycergel Mounting Medium, Code-Nr. C0563, empfohlen. Vor dem Gebrauch wird Glycergel durch Erwärmen auf circa 40 (±5) C verflüssigt. ( ) P04087EFG_01_K / p. 129/152

130 B. Färbeprozedur auf dem Autostainer Magenkrebs B.1 Hinweise Vor der Verwendung sind alle diese Anleitungen durchzuarbeiten und Benutzer sollten sich mit allen Kit- und Gerätekomponenten vertraut machen (siehe Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen ). Vor dem immunhistochemischen Anfärben müssen alle Reagenzien Raumtemperatur (20-25 C) annehmen. Auch alle Inkubationen sind bei Raum temperatur durchzuführen. Während des Einsetzens in den Autostainer und während der Färbeprozedur dürfen die Gewebeschnitte nicht austrocknen. Trockene Gewebeschnitte können unspezifische Färbungen aufweisen. Bei einer Unterbrechung des Färbeverfahrens können die Objektträger nach Inkubation mit dem primären Antikörper bis zu einer Stunde lang bei Raumtemperatur (20-25 C) im Pufferbad belassen werden. Das Färbungsergebnis wird hierdurch nicht beeinträchtigt. Entparaffinieren und Rehydrierung: Zur Entfernung des Einbettungsmediums müssen die Gewebeschnitte vor der Färbung entparaffiniert und anschließend rehydriert werden. Das Paraffin muss vollständig entfernt werden. Überreste des Einbettungsmediums können eine stärkere unspezifische Färbung zur Folge haben. Diesen Schritt bei Raumtemperatur (20-25 C) durchführen. 1. Objektträger in ein Xylolbad einlegen und 5 (±1) Minuten lang inkubieren. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. 2. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und Objektträger 3 (±1) Minuten lang in absolutes Ethanol geben. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. 3. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und Objektträger 3 (±1) Minuten lang in 95%iges Ethanol geben. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. 4. Überschüssige Flüssigkeit durch Abklopfen entfernen und Objektträger mindestens 30 Sekunden in destilliertes oder entionisiertes Wasser eintauchen. Die Färbeprozedur wie in Abschnitt B.2, Schritt 1, Epitopdemaskierung, erläutert beginnen. Xylol- und Alkohollösungen nach 40 Objektträgern auswechseln. Toluen oder Xylen-Ersatz wie beispielsweise Histoclear können anstelle von Xylen verwendet werden. HINWEIS: Die in diesem Kit enthaltenen Anweisungen und Reagenzien wurden für eine optimale Leistung konzipiert. Weitere Verdünnungen der Kit-Reagenzien oder Abänderungen der Inkubationstemperaturen können zu fehlerhaften oder unstimmigen Ergebnissen führen. Unterschiede bei Gewebeverarbeitung und technischen Verfahren im Labor des Anwenders können die Assayergebnisse ungültig machen, sodass sie sich nicht für die Herceptin - Therapieauswahl eignen. B.2 Färbeprotokoll Durchführung bei Raumtemperatur, C. Schritt 1: Epitopdemaskierung Färbebehältnisse wie z. B. Coplin-Färbetröge mit verdünnter Epitopdemaskierungslösung (Epitope Retrieval Solution) befüllen (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.1). Epitopdemaskierungslösung enthaltende Färbetröge in ein Wasserbad stellen. Wasserbad und Epitopdemaskierungslösung auf C erwärmen. Bei Erwärmung trübt sich die Epito pdemaskierungslösung. Tröge mit Deckeln versehen, um eine Temperaturstabilisierung zu erreichen und um Verdunsten zu vermeiden. Die entparaffinierten, auf Raumtemperatur gebrachten Gewebeschnitte in die vorgewärmte Epitope Retrieval Solution in den Färbeschalen eintauchen. TEMPERATUR DES WASSERBADS UND DER EPITOPDEMASKIERUNGSLÖSUNG WIEDER AUF C BRINGEN. 40 (±1) Minuten bei C inkubieren. ( ) P04087EFG_01_K / p. 130/152

131 Magenkrebs Gesamte Färbeschale samt Objektträger aus dem Wasserbad heben. Objektträger bei Raumtemperatur in der Epitopdemaskierungslösung 20 (±1) Minuten lang abkühlen lassen. Epitopdemaskierungslösung abgießen und Schnitte mit Waschpuffer spülen (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.2). Um optimale Leistungen zu erzielen, werden die Schnitte nach der Epitopdemaskierung und vor dem Färben 5-20 Minuten lang in Waschpuffer eingeweicht. HINWEIS: Die Epitope Retrieval Solution ist nur für den einmaligen Gebrauch bestimmt. Nicht wiederverwenden. Schritt 2: Autostainer-Verfahren 1. Die erforderlichen Programm-Laufzeiten und Reagenzienvolumina (spezifische Volumina siehe unter Punkt 4 unten) sind dem vom Autostainer generierten Diagramm zum automatischen Programm für den HercepTest zu entnehmen. 2. Autostainer -Reagenzieneinsätze in der Reagenzienaufnahme des Autostainer nach den Reagenzien-Informationen des computergenerierten Diagramms in Position bringen. 3. Objektträger nach den Objektträger-Informationen des computergenerierten Diagramms in den Autostainer einsetzen. 4. Programm einstellen und das HercepTest -Programm laufen lassen. Nachstehend eine Übersicht über die Durchführung des Programms: Spülen 200 µl Peroxidase-Blocking Reagent - 5 Minuten Spülen 200 µl Primary Anti-HER2 Protein (oder Negative Control Reagent) - 30 Minuten Spülen 200 µl Visualization Reagent - 30 Minuten Spülen Spülen Wechseln 200 µl Substrate-Chromogen Solution (DAB) - 10 Minuten Die Objektträger nach dem Substratchromogen-Schritt in entionisiertem Wasser spülen. HINWEIS: Die Autostainer-Hardwareversion 01 spült Objektträger in Puffer. Daher müssen die Objektträger nach Entnahme aus dem Autostainer mit entionisiertem Wasser gespült werden. Schritt 3: Gegenfärbung (Anweisungen für Hämatoxylin) Objektträger aus dem Autostainer nehmen und wie unten beschrieben mit Hämatoxylin gegenfärben. Objektträger in ein Hämatoxylin-Bad eintauchen. In Abhängigkeit von der genutzten Hämatoxylin-Konzentration 2-5 Minuten lang inkubieren. Vorsichtig in einem Bad mit destilliertem oder entionisiertem Wasser spülen. Alle Hämatoxylinreste müssen vollständig entfernt worden sein. Wahlweise: Objektträger 10 Mal in ein Bad mit 37 mmol/l Ammoniakwasser eintauchen (siehe Abschnitt A.4). ( ) P04087EFG_01_K / p. 131/152

132 Magenkrebs Objektträger 2-5 Minuten vorsichtig in einem Bad mit destilliertem oder entionisiertem Wasser spülen. HINWEIS: In Abhängigkeit von der Länge der Inkubationszeit und der Wirkungsintensität des genutzten Hämatoxylins resultiert die Gegenfärbung in einer blass- bis dunkelblauen Anfärbung der Zellkerne. Übermäßige oder unvollständige Gegenfärbung kann die sachgemäße Auswertung der Ergebnisse beeinträchtigen. Schritt 4: Fixierung Empfohlen wird ein nichtwässriges Mittel zur permanenten Fixierung. Es kann aber auch ein wässriges Fixiermittel verwendet werden. Proben können unter Verwendung eines wasserbasierenden Eindeckmediums wie z. B. Dako Faramount, Code- Nr. S3025, oder Glycergel, Code-Nr. C0563, aufgezogen und mit Deckglas versehen werden. HINWEIS: Objektträger können zu einem beliebigen Zeitpunkt abgelesen werden. Werden die Objektträger jedoch mit einem wässrigen Medium fixiert und eine Woche lang hellem Licht ausgesetzt, kann die Farbe etwas verblassen. Objektträger im Dunkeln bei Raumtemperatur (20-25 C) aufbewahren, um Verblassen zu vermeiden. Qualitätskontrolle - Magenkarzinom Unterschiede in der Fixierung, Verarbeitung und Einbettung der Gewebeschnitte im Labor des Benutzers können erhebliche Unterschiede bei den Ergebnissen zur Folge haben. Aus diesem Grund müssen zusätzlich zu den von Dako gelieferten Kontrollobjektträgern regelmäßig auch Kontrollen vor Ort durchgeführt werden. In den USA ist auf die Leitlinien für die Qualitätskontrolle Bezug zu nehmen, die vom College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry herausgegeben wurden. Weitere Informationen finden sich auch in: CLSI (früher NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24) und Literaturangabe 25. Tabelle 8. Zweck der täglichen Qualitätskontrolle Gewebe: Fixiert und verarbeitet wie die Patientenprobe Positivkontrollen: Gewebe oder Zellen mit nachzuweisendem Zielantigen (kann sich im Patientengewebe befinden). Als ideal gilt eine Kontrolle aus schwach positiv färbendem Gewebe, da dieses gegenüber einem Antikörper- oder Antigenabbau sehr empfindlich ist. Spezifischer Antikörper und sekundärer Antikörper Kontrolliert alle Analyseschritte. Validiert Reagenz und Verfahrensweisen für die HER2-Protein-Färbung. Nicht spezifischer Antikörper* oder Puffer und der gleiche sekundäre Antikörper, der mit dem spezifischen Antikörper genutzt wurde Nachweis unspezifischer Hintergrundfärbung. Negativkontrolle: Vermutlich negative Gewebe oder Zellen (im Patientengewebe oder im Gewebe der positiven Kontrollprobe). Nachweis unbeabsichtigter Antikörper- Kreuzreaktivität mit Zellen und Zellbestandteilen. Nachweis unspezifischer Hintergrundfärbung. Patientengewebe. Nachweis spezifischer Färbung. Nachweis unspezifischer Hintergrundfärbung. Kontrollobjektträger, von Dako mitgeliefert. Kontrolliert nur den Färbevorgang. * Serum von der gleichen Tierart wie der spezifische Antikörper, aber nicht gegen dasselbe Zielantigen gerichtet. Zum Nachweis unspezifischer Bindung, z. B. Bindung des Fc-Fragments des Antikörpers an das Gewebe. Kontrollobjektträger (mitgeliefert): Jeder der mitgelieferten Kontrollobjektträger enthält drei pelletierte, formalinfixierte, paraffineingebettete humane Brustkrebs-Zelllinien mit Färbungsintensitätswerten von 0, 1+ und 3+. Bei jedem Färbeverfahren sollte ein Objektträger ( ) P04087EFG_01_K / p. 132/152

133 gefärbt werden. Durch Auswertung der Zelllinien auf dem von Dako mitgelieferten Kontrollobjektträger wird der Färbedurchlauf validiert. Magenkrebs Positives Kontrollgewebe: Als Kontrollen dienen frische, durch Autopsie, Biopsie oder einen operativen Eingriff gewonnene Proben, die so schnell wie möglich und auf die gleiche Weise fixiert, verarbeitet und eingebettet werden wie die Patientenprobe(n). Positive Kontrollgewebe deuten auf sachgemäß vorbereitete Gewebe und geeignete Färbetechniken hin. In jedem Färbedurchlauf sollte für jede Gruppe von Testbedingungen ein positives Kontrollgewebe mitgeführt werden. Die für die positiven Gewebekontrollen verwendeten Gewebe sollten eine schwache, positive Färbung aufweisen, sodass geringe Veränderungen der primären Antikörpersensitivität nachweisbar sind. Die in diesem Kit mitgelieferten Kontrollobjektträger und Proben, die abweichend von der(n) Patientenprobe(n) verarbeitet werden, validieren nur die Leistung der Reagenzien, bestätigen jedoch nicht die Gewebevorbereitung. Als ideale Positivkontrolle ist Magen-Adenokarzinomgewebe, einschließlich des ösophagogastralen Übergangs einzusetzen, dessen Grad 2+ entsprechende Überexpression des HER2-Proteins zuvor nachgewiesen wurde. HINWEIS: Bekanntermaßen positives Kontrollgewebe sollte nur zur Überprüfung der korrekten Funktionsweise der verarbeiteten Gewebe und Testreagenzien verwendet werden, NICHT aber zur Unterstützung der spezifischen Diagnose anhand von Patientenproben. Wenn das positive Kontrollgewebe keine Färbung aufweist, müssen die Ergebnisse der Patientenproben für ungültig erklärt werden. Negative Kontrollgewebe: Bei jedem Färbedurchlauf eine negative Kontrollgewebeprobe (als HER2-Protein-negativ bekannt) einsetzen, die auf die gleiche Weise wie die Patientenprobe fixiert, verarbeitet und eingebettet wurde, um die Spezifität des primären Antikörpers zu verifizieren und Hinweise auf eine spezifische Hintergrundfärbung zu erhalten. Als Negativkontrolle eignet sich Gewebe aus Darm, Leber oder Schilddrüse. Die in den meisten Gewebeschnitten anzutreffende Vielzahl verschiedener Zelltypen ermöglicht interne negative Kontrollstellen (vom Benutzer zu verifizieren). Falls das negative Kontrollgewebe Färbungen aufweist, sollten die Ergebnisse der Patientenproben für ungültig erklärt werden. Nicht spezifisches Negativkontrollreagenz (Negative Control Reagent): Zur Beurteilung unspezifischer Färbung und im Hinblick auf eine bessere Interpretation der spezifischen Färbung an der Antigenstelle sollte bei einem Teil jeder Patientenprobe das mitgelieferte negative Kontrollreagenz anstelle des primären Antikörpers benutzt werden. Die Inkubationszeit für das negative Kontrollreagenz sollte mit der für den primären Antikörper übereinstimmen. Verifizierung des Assays: Bevor bei einem diagnostischen Verfahren ein Antikörper oder ein Färbesystem zum ersten Mal genutzt wird, muss vom Benutzer die Spezifizität des Antikörpers verifiziert werden. Hierzu wird dieser an einer Reihe laborinterner Gewebe mit bekannten immunzytochemischen Leistungsmerkmalen getestet, die bekanntermaßen positive und negative Gewebe repräsentieren. Siehe die zuvor in diesem Abschnitt der Packungsbeilage dargestellten Qualitätskontrollmaßnahmen und die Qualitätskontrollanforderungen des CAP Certification Program for Immunohistochemistry und/oder CLSI (früher NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24). Diese Maßnahmen sind für jede neue Antikörpercharge bzw. bei jeder Veränderung der Assayparameter zu wiederholen. Für die Assay-Verifizierung geeignet sind Magen- oder Adenokarzinom des ösophagogastralen Übergangs mit erwiesenen HER2-Protein-Färbungsintensitäten von 0 bis 3+ sowie negative Gewebe wie z. B. Colon, Leber oder Schilddrüse. Für die Assay-Verifizierung geeignet sind Magen-Adenokarzinomgewebe, einschließlich des ösophagogastralen Übergangs, mit erwiesenen HER2-Protein-Färbungsintensitäten von 0 bis 3+ sowie negative Gewebe wie z. B. Darm, Leber oder Schilddrüse. ( ) P04087EFG_01_K / p. 133/152

134 Magenkrebs Interpretation des Anfärbens - Magenkarzinom Zur Bestimmung der Expression des HER2-Proteins sollten anhand der Skala in Tabelle 9 nur die Färbungsintensität und das Färbemuster der Membran zugrunde gelegt werden. Die Auswertung der Objektträger ist von einem Pathologen mittels Lichtmikroskop vorzunehmen. Zur Auswertung der immunhistochemischen Färbung und zur Bestimmung der Färbungsintensität ist ein Objektiv mit 10facher Vergrößerung ausreichend. Für die Bestätigung der Gradeinteilung ist die Verwendung eines Objektivs mit 5 40facher Vergrößerung nützlich. Eine zytoplasmatische Färbung ist als nichtspezifisch zu betrachten und bei der Bewertung der Färbungsintensität der Membran nicht zu berücksichtigen (8). Zur Unterstützung der Klassifizierung von Färbungen mit den Werten 0, 1+, 2+ bzw. 3+ repräsentative Abbildungen der Färbungsintensität und Muster bitte dem HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer entnehmen. Es sollten nur Proben von Patienten mit Magen-Adenokarzinomgewebe, einschließlich des ösophagogastralen Übergangs ausgewertet werden. In Fällen mit intestinaler Metaplasie und Magen-Adenokarzinom in derselben Probe sollte nur die Magen- Adenokarzinom-Komponente ausgewertet werden. Für die Auswertung von mit HercepTest gefärbten Biopsieproben wird ein Cluster von mindestens 5 gefärbten Tumorzellen empfohlen. Ein Cluster von mindestens 5 gefärbten Tumorzellen enthält 5 verbundene HER2-gefärbte Tumorzellen. Tabelle 9. Interpretation und Bewertung der HER2-immunhistochemischen Färbung Score (Scoring) Probe aus einem operativen Eingriff Anfärbungsmuster Biopsieprobe Anfärbungsmuster Bewertung der Überexpression von HER2 0 Keine Reaktivität oder membranöse Reaktivität in < 10 % der Tumorzellen Keine Reaktivität oder keine membranöse Reaktivität in jeglichen (bzw. < 5 geclusterten) Tumorzellen Negativ 1+ Schwache bzw. kaum wahrnehmbare membranöse Reaktivität 10 % der Tumorzellen; es liegt nur eine teilweise Reaktivität der Membran vor Tumorzellcluster ( 5 Zellen) weisen unabhängig vom Anteil der angefärbten Tumorzellen eine schwache bzw. kaum wahrnehmbare membranöse Reaktivität auf Negativ 2+ Schwache bis mäßige vollständige basolaterale oder laterale membranöse Reaktivität in 10 % der Tumorzellen Tumorzellcluster ( 5 Zellen) weisen unabhängig vom Anteil der angefärbten Tumorzellen eine schwache bis mäßige vollständige basolaterale oder laterale membranöse Reaktivität auf Nicht eindeutig 3+ Starke vollständige basolaterale oder laterale membranöse Reaktivität in 10 % der Tumorzellen Tumorzellcluster ( 5 Zellen) weisen unabhängig vom Anteil der angefärbten Tumorzellen eine starke vollständige basolaterale oder laterale membranöse Reaktivität auf Positiv Richtlinien gemäß Hofmann et al. (40). Die Überexpression des HER2-Proteins wird mit HercepTest als negativ (Bewertung 0 und 1+), nicht eindeutig (Bewertung 2+) und positiv (Bewertung 3+) bewertet. HercepTest ist für Patientinnen oder den behandelnden Arzt nicht als prognostisches Hilfsmittel vorgesehen und für diesen Zweck auch nicht validiert. Für jeden Färbedurchlauf sollten die Objektträger zur Bestimmung der Validität des Färbedurchlaufs und zur halbquantitativen Bewertung der Färbungsintensität der Gewebeprobe in der in Tabelle 10 angegebenen Reihenfolge untersucht werden. ( ) P04087EFG_01_K / p. 134/152

135 Magenkrebs Tabelle 10. Reihenfolge der Objektträgerauswertung Reihenfolge der Ablesung der Objektträger Grundprinzip 1. Kontrollobjektträger mit den drei Zelllinien Auf einen validen Assay verweisen: Vorhandensein einer Grad 3+ entsprechenden braunen Membrananfärbung (vollständige Ringform) bei der 3+ Kontroll-Zelllinie SK-BR-3; partielle ringförmige braune Anfärbung bei der 1+ Kontroll-Zelllinie MDA- 175 und keine Anfärbung bei der 0 Kontroll-Zelllinie MDA-231. Punktförmige und diskontinuierliche Membrananfärbung liegt bei einer kleinen bis moderaten Anzahl von Zellen in der schwach-positiven 1+ Kontroll-Zelllinie MDA-175 vor. Außerdem kann bei dieser Zelllinie eine punktförmige Immunfärbung des Golgifelds des Zytoplasmas beobachtet werden. Das Auftreten einer braunen Färbung bei der 0 Kontroll-Zelllinie MDA-231 (negativ für die Färbung mit HER2-Protein) ist ein Anzeichen für eine unspezifische Färbung während des Assays. Die Assay-Resultate können wegen übermäßigen Anfärbens ungültig sein. 2. Objektträger mit positivem Kontrollgewebe. Es sollte eine Braunfärbung der Membran zu beobachten sein. Anfärben des Zytoplasmas und negativer Gewebeproben sollte nicht mehr als 1+ betragen. 3. Objektträger mit negativem Kontrollgewebe Die ABWESENHEIT einer spezifischen Färbung in den Negativkontrollproben bestätigt das Fehlen einer Kreuzreaktivität des Kits mit Zellen und Zellkomponenten. Tritt bei dem Objektträger mit als Negativkontrolle dienendem Gewebe spezifische Membranfärbung auf, müssen die mit der Patientenprobe gewonnenen Resultate als ungültig angesehen werden. 4. Färbung des Patientengewebes trat bei Verwendung der Negativkontrolle auf. 5. Färbung des Patientengewebes trat bei Verwendung des primären Antikörpers auf. Fehlen einer spezifischen Membrananfärbung verifiziert die spezifische Markierung des Target-Antigens durch den primären Antikörper. Andere als gelb-braune oder braune Färbung im Zytoplasma der mit Negativkontrollreagenz behandelten Probe wie Bindegewebe, Leukozyten, Erythrozyten oder nekrotisches Gewebe sind als nicht spezifische Hintergrundfärbung zu bewerten und auf dem Datenblatt unter der Spalte für Kommentare mitzuteilen. Wird in der Probe eine Überexpression des HER2-Proteins nachgewiesen, erscheint diese als braune Ringform, die auf der Zellmembran der mit primärem Antikörper behandelten Tumorzellen auftritt. 1. Kontrollobjektträger (mitgeliefert): Der mit HercepTest gefärbte Kontrollobjektträger sollte zuerst untersucht werden, damit gewährleistet ist, dass alle Reagenzien korrekt funktionieren. Ein braunes (3,3 -Diaminobenzidin, DAB) Reaktionsprodukt auf der Zellmembran zeigt eine positive Reaktivität an. Bei Auftreten einer peripheren Braunfärbung der Zellmembran (Randbildung) in der 3+ Kontroll-Zelllinie SK-BR-3, einer teilweisen braunen Randbildung in der 1+ Kontroll-Zelllinie MDA-175 und keiner Färbung der 0 Kontroll-Zelllinie MDA-231 ist der Assay gültig. Falls in einer der Kontrollzelllinien andere Ergebnisse als die hier genannten auftreten, sollten die Ergebnisse der Patientenproben für ungültig erklärt werden. 2. Positives Kontrollgewebe: Als nächstes sollte der Objektträger mit dem positiven Kontrollgewebe untersucht werden. Dieser Objektträger verifiziert die Wirksamkeit des Fixierungsverfahrens und der Epitopdemaskierung. Zur Auswertung der Ergebnisse müssen intakte Zellen verwendet werden, da nekrotische oder degenerierte Zellen oft eine unspezifische Färbung aufweisen (26). Die Färbung sollte im Tumorgewebe als Braunfärbung der Zellmembran zu beobachten sein. Eine Braunfärbung des Zytoplasmas und der Negativgewebe innerhalb der Probe sollte nicht stärker ausgeprägt sein, als dem Färbungsintensitätswert 1+ entspricht. ( ) P04087EFG_01_K / p. 135/152

136 Magenkrebs 3. Negative Kontrollgewebe: Der Objektträger mit als Negativkontrolle dienendem Gewebe sollte nach der Positivkontrolle untersucht werden, um die Spezifität der Markierung des Target-Antigens durch den primären Antikörper zu verifizieren. Das Fehlen einer spezifischen Färbung in den Negativkontrollproben bestätigt, dass das Kit nicht mit Zellen und Zellkomponenten kreuzreagiert hat. Falls das negative Kontrollgewebe Färbungen aufweist, sollten die Ergebnisse der Patientenprobe für ungültig erklärt werden. Alternativ können auch negative Bereiche des positiven Kontrollgewebes als Negativkontrolle dienen, dieses ist jedoch vom Anwender zu verifizieren. Es ist zu beachten, dass bei den meisten normalen Epithelgeweben eine schwache Reaktion (Färbungsintensität 0-1+) beobachtet werden kann. Mögliche Negativkontrollgewebe sind: Darm, Leber und Schilddrüse. Eine eventuelle unspezifische Färbung erscheint diffus. Bei übermäßig formalinfixierten Gewebeschnitten kann es gelegentlich zur Einfärbung des Bindegewebes kommen Patientengewebe: Mit HercepTest gefärbte Patientenproben zuletzt auswerten. Die Intensität der positiven Färbung ist im Kontext einer eventuellen unspezifischen Hintergrundfärbung der Negativkontrolle zu bewerten. Wie bei allen immunzytochemischen Tests bedeutet ein negatives Ergebnis, dass das Antigen nicht nachgewiesen wurde, nicht aber, dass das Antigen in den getesteten Zellen/Geweben nicht vorhanden war. Spezielle Angaben zur Immunreaktivität von HercepTest den Abschnitten Zusammenfassung und Erklärung, Einschränkungen und Leistungsmerkmale entnehmen. Zusätzliche Empfehlungen für die Auswertung der Färbung mit HercepTest Auf HER2-Protein-Überexpression getestetes Magen-Adenokarzinomgewebe, einschließlich des ösophagogastralen Übergangs wird mit Bewertungen von 0 bis 3+ versehen. Die mit 0 und 3+ bewerteten Fälle sind eindeutig, allerdings kann ein geringer Prozentsatz der restlichen, mit 1+ bzw. 2+ bewerteten Proben schwieriger auszuwerten sein. Bitte bei der Auswertung von Färbungen mit HercepTest in Ihrem Labor nach folgenden Richtlinien vorgehen. Auswerten der Kontrollzelllinien zur Validierung der Leistung des Assays. Auswerten der Objektträger mit der Positiv- bzw. Negativkontrolle. Für die erste Auswertung wird eine Färbung der Gewebeprobe mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) empfohlen. (Beim Auswerten der mit HercepTest gefärbten Probe ist der Tumor möglicherweise nicht deutlich sichtbar. Zum Verifizieren der Tumorpräsenz benötigt der Pathologe einen H- und E-angefärbten Objektträger.) Der HercepTest TM ist an einem paarig vorliegenden Schnitte (Serienschnitt) durchzuführen, der vom gleichen paraffineingebetteten Präparatblock angefertigt wurde. Die für die Überexpression von HER2-Protein gefärbten Schnitte zunächst mit geringer Vergrößerung auswerten. Die meisten positiven Fälle sind bei geringer Vergrößerung deutlich sichtbar. Verwenden Sie bei einer Bewertung mit 1+ eine 40-fache Vergrößerung, um die Membranfärbung zu verifizieren. Verwenden Sie bei einer Bewertung mit 2+ eine 10- bis 20-fache Vergrößerung, um die Membranfärbung zu verifizieren. Proben aus einem operativen Eingriff Für die Bestimmung des prozentualen Anteils positiver Tumorzellen sollten gut erhaltene und gut gefärbte Bereiche der Probe verwendet werden. Weist die Mehrzahl der Tumorzellen eine vollständige basolaterale oder laterale Membranfärbung auf, so beträgt die Färbungsintensität entweder 2+ oder 3+. Wenn 10 % oder mehr der Tumorzellen in Proben aus einem operativen Eingriff eine vollständige, sehr starke basolaterale oder laterale Membranfärbung aufweisen, wird die Probe mit 3+ bewertet. ( ) P04087EFG_01_K / p. 136/152

137 Magenkrebs Wenn 10 % oder mehr der Tumorzellen in Proben aus einem operativen Eingriff eine vollständige, schwache oder mäßige basolaterale oder laterale Membranfärbung aufweisen, wird die Probe mit 2+ bewertet. Wenn mindestens 10 % der Tumorzellen in Proben aus einem operativen Eingriff, deren Zellmembran nur teilweise gefärbt ist, eine schwache bzw. kaum wahrnehmbare Membranfärbung aufweisen, wird die Probe mit 1+ bewertet. Wenn weniger als 10 % der Tumorzellen in Proben aus einem operativen Eingriff eine Färbung aufweisen, unabhängig vom Färbemuster (z. B. vollständig, basolateral oder lateral, oder eine teilweise Färbung der Membran), wird die Probe mit 0 bewertet. Wenn keine Färbung festzustellen ist, wird die Probe aus einem operativen Eingriff mit 0 bewertet. Biopsieproben Ein Cluster von mindestens 5 gefärbten Tumorzellen enthält 5 verbundene HER2- gefärbte Tumorzellen. Wenn ein Tumorzellcluster von mindestens 5 gefärbten Tumorzellen mit einer starken vollständigen basolateralen oder lateralen Membranfärbung vorliegt, wird die Biopsieprobe unabhängig vom Anteil der gefärbten Tumorzellen mit 3+ bewertet. Wenn ein Tumorzellcluster von mindestens 5 gefärbten Tumorzellen mit einer schwachen bis mäßigen vollständigen basolateralen oder lateralen Membranfärbung vorliegt, wird die Biopsieprobe unabhängig vom Anteil der gefärbten Tumorzellen mit 2+ bewertet. Wenn ein Tumorzellcluster von mindestens 5 gefärbten Tumorzellen mit einer schwachen bzw. kaum wahrnehmbaren Membranfärbung vorliegt und die Zellmembran nur teilweise gefärbt ist, wird die Biopsieprobe unabhängig vom Anteil der gefärbten Tumorzellen mit 1+ bewertet. Wenn keine Färbung festzustellen ist, wird die Biopsieprobe mit 0 bewertet. Wenn in weniger als 5 geclusterten Tumorzellen (unahängig von der Färbeintensität) eine Membranfärbung festgestellt wird, wird die Biopsieprobe mit 0 bewertet. Beschränkungen - Magenkarzinom Allgemeine Beschränkungen 1. Immunzytochemie ist ein diagnostisches Mehrfachschritt-Verfahren, das hinsichtlich der Auswahl der geeigneten Reagenzien, der Auswahl, Fixierung und Verarbeitung von Geweben sowie der Vorbereitung des Objektträgers für die Immunzytochemie und der Auswertung der Färbungsergebnisse ein Spezialtraining erfordert. 2. Gewebefärbungen hängen von der sachgemäßen Handhabung und Verarbeitung des Gewebes vor der Färbung ab. Unsachgemäßes Fixieren, Einfrieren, Auftauen, Waschen, Trocknen, Erhitzen, Schneiden oder Verunreinigung durch andere Gewebe oder Flüssigkeiten kann zu Artefakten, Antikörper-Trapping oder falsch negativen Ergebnissen führen. Widersprüchliche Ergebnisse können auf Unterschiede bei den Fixierungs- und Einbettungsmethoden oder auf Unregelmäßigkeiten innerhalb des Gewebes zurückzuführen sein. ( ) P04087EFG_01_K / p. 137/152

138 Magenkrebs 3. Übermäßige oder unvollständige Gegenfärbung kann die sachgemäße Auswertung der Ergebnisse beeinträchtigen. 4. Die klinische Auswertung jeder positiven Färbung oder deren Ausbleiben muss im Rahmen des klinischen Bildes, der Morphologie und anderer histopathologischer Kriterien erfolgen. Die klinische Auswertung einer Färbung oder deren Ausbleiben muss durch morphologische Studien und geeignete Kontrollen sowie durch andere diagnostische Tests ergänzt werden. Für die Auswertung der gefärbten Präparate ist ein qualifizierter Pathologe zuständig, der mit Antikörpern, Reagenzien und den zur Auswertung der gefärbten Präparate angewandten Methoden vertraut ist. Die Färbung muss in einem offiziell zugelassenen, lizenzierten Labor unter Aufsicht eines Pathologen erfolgen, dessen Aufgabe es ist, die gefärbten Objektträger zu überprüfen und die Eignung der positiven und negativen Kontrollen zu gewährleisten. 5. Gewebe von mit dem Hepatitis-B-Virus infizierten Personen und Gewebe mit Hepatitis-B- Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) können mit Meerrettichperoxidase eine unspezifische Färbung aufweisen (27). Reagenzien können in zuvor nicht getesteten Gewebetypen unerwartete Reaktionen zeigen. Selbst in getesteten Gewebetypen kann aufgrund von biologischen Unterschieden bei der Antigen-Expression in Neoplasmen oder anderen pathologischen Geweben die Möglichkeit unerwarteter Reaktionen nicht völlig ausgeschlossen werden (28). Es wird gebeten, dokumentierte unerwartete Reaktionen dem Technischen Kundendienst von Dako mitzuteilen. 6. Aufgrund der nicht-immunologischen Bindung von Proteinen oder Substrat- Reaktionsprodukten können falsch-positive Ergebnisse auftreten. Sie können ebenfalls durch Pseudoperoxidaseaktivität (Erythrozyten) und endogene Peroxidaseaktivität (Zytochrom C) hervorgerufen werden (28). 7. Das Färbeverfahren ist bei Umgebungstemperaturen zwischen C durchzuführen. Produktspezifische Beschränkungen 1. Das in der 1+ Kontroll-Zelllinie MDA-175 vorhandene Antigen zersetzt sich mit der Zeit. Die Ergebnisse der Kontrollobjektträger im Zusammenhang mit dem Verfalldatum des Kontrollobjektträgers bewerten. Eine negative Färbung der MDA-175 Zellen zeigt möglicherweise nur an, dass der Kontrollobjektträger untauglich ist. Die Kontrollobjektträger sind bei 2-8 C zu lagern. 2. Falsch-negative Ergebnisse können die Folge eines mit der Zeit stattfindenden Antigenabbaus in den Geweben sein. Proben sollten innerhalb von 4-6 Wochen nach dem Einschließen der Präparate auf Objektträgern angefärbt werden, wenn die Lagerung bei Raumtemperatur (20-25 C) erfolgte (29). 3. Zum Erzielen optimaler und reproduzierbarer Ergebnisse bei routinemäßig fixierten (neutral gepuffertes Formalin) und paraffineingebetteten Geweben ist für das HER2- Protein eine hitzeinduzierte Epitopdemaskierung erforderlich. Diese Vorbehandlung muss zu Beginn der gesamten Färbeprozedur abgeschlossen worden sein. Anleitungen sind dem Abschnitt über die Probenvorbereitung und die Behandlung von Geweben vor dem Abfärben zu entnehmen. 4. Die hitzeinduzierte Epitopdemaskierung des HER2-Proteins darf nur in einem kalibrierten Wasserbad durchgeführt werden. Andere Erwärmungsverfahren wurden getestet, haben aber keine reproduzierbaren Resultate erbracht. 5. Kit-Reagenzien dürfen nicht gegen Reagenzien mit anderen Chargennummern oder gegen Reagenzien anderer Hersteller ausgetauscht werden. Hiervon ausgenommen ist lediglich der Waschpuffer (Wash Buffer), anstelle dessen der Dako Wash Buffer, Code-Nr. S3006 genutzt werden kann. 6. Die Auswertung der zytoplasmatischen Färbung könnte zu falschen Ergebnissen führen. Bei der Auswertung der Ergebnisse nur die Färbungsintensität der Zellmembran berücksichtigen. ( ) P04087EFG_01_K / p. 138/152

139 Magenkrebs 7. Gefärbte Kontrollzelllinien sind nur zur Validierung des Färbedurchlaufs und nicht als Richtlinie für die Auswertung der Färbereaktion in Gewebeschnitten heranzuziehen. 8. Gelegentlich kann es zu einer ausgeprägten fokalen Färbung (3+), so genannten Hot Spots kommen. Diese können die Folge einer ungleichmäßigen Gewebefixierung und/oder -verarbeitung sein. In diesen Fällen wird die Immunfärbung eines zweiten Gewebeblocks derselben Probe empfohlen. 9. Die Verwendung von HercepTest mit Proben, die mit anderen Fixiermitteln als neutral gepuffertem Formalin fixiert wurden, ist nicht validiert. 10. Bitte beachten, dass aus Mandeln und Speiseröhre entnommenes, normales Epithelgewebe eine Färbungsintensität von bis zu 2+ aufweisen kann. 11. Die Verwendung zerdrückter Magenkrebsproben und die Auswertung der Artefaktfärbung um Biopsieränder sollte vermieden werden. Leistungsmerkmale - Magenkarzinom Hintergrund Die Sicherheit und Effizienz von Trastuzumab (Herceptin ) ist in einer klinischen Studie (der ToGA-Studie) nachgewiesen worden (38, 39). Die Studie wurde als randomisierte multizentrische Open Label-Studie der Phase III an HER2-positiven Patienten mit inoperablem lokal fortgeschrittenem, rezidivierendem und/oder metastatischem Adenokarzinom des Magens bzw. ösophagogastralen Übergangs durchgeführt. In der ToGA-Studie wurde ermittelt, dass die HER2-Positivität entweder IHC-positiv (3+) (HercepTest, Dako) und/oder positiv durch das HER2 FISH- Verfahren (HER2/CEN17 2,0) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako) ist. Nachdem die Patienten in die Studie aufgenommen waren, wurde per Zufallsprinzip bestimmt, welche Patienten Chemotherapie (5-FU oder Capecitabine und Cisplatin) und welche Chemotherapie plus Trastuzumab erhielten. Diese Studie zielte auf das Gesamt- Überleben (OS) ab. In der Studie wurden insgesamt 594 Patienten randomisiert, und bei 584 Patienten erhielten die Studienmedikation und wurden in die Gesamtgruppe (Full Analysis Set, FAS) aufgenommen. Bezüglich des Gesamt-Überlebens erwies sich die Kombination aus Chemotherapie und Trastuzumab im Vergleich zur Chemotherapie allein als statistisch überlegen. Das mittlere Gesamt-Überleben stieg von 11,1 auf 13,8 Monate (p = 0,0046) bei einer Hazard Ratio von 0,74 (95 % CI: 0,60 0,91). Die Kaplan-Meier- Kurven für das Gesamt-Überleben sind in Abbildung 1 dargestellt. ( ) P04087EFG_01_K / p. 139/152

140 Magenkrebs Überlebenswahrscheinlichkeit 1,0 0,9 0,8 0,7 Logrank-Test P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Zeit (Monate) verbleibende Anzahl Fluor/Cisp Tras/Fluor/Cisp Behandlungsgruppe Fluor/Cisp Tras/Fluor/Cisp Abbildung 1. Kaplan-Meier-Kurve für das Gesamt-Überleben (n=584). Als die Daten vorlagen, wurden vordefinierte diagnostische Analysen des HER2-Status durchgeführt. Zwei neue HER2-Untergruppen wurden nachträglich auf der Grundlage der IHC-Bewertung definiert: Gruppe 1 ( schwach HER2 exprimierende Gruppe ): IHC 0/FISH+ und IHC 1+/FISH+ (n=131) Gruppe 2 ( stark HER2 exprimierende Gruppe ): IHC 2+/FISH+ und IHC 3+ (FISH+ oder FISHoder FISH ergebnislos (n=446) Als die Primäranalyse zum Gesamt-Überleben für die stark HER2 exprimierende Gruppe (n=446) nachträglich wiederholt wurde, war der Vorteil zugunsten der kombinierten Behandlung noch stärker. Das mittlere Gesamt-Überleben bei der Patientengruppe, der Chemotherapie zusammen mit Trastuzumab verabreicht wurde, stieg auf 16,0 Monate im Vergleich zu 11,8 Monaten bei den Patienten, bei denen die Chemotherapie allein angewendet wurde. Der Hazard Ratio sank bei dieser Analyse auf 0,65 (95 % CI: 0,51 0,83). Die Kaplan-Meier-Kurven für das Gesamt-Überleben für die stark HER2 exprimierende Gruppe sind in Abbildung 2 dargestellt. ( ) P04087EFG_01_K / p. 140/152

141 Magenkrebs Überlebenswahrscheinlichkeit 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Zeit (Monate) verbleibende Anzahl Fluor/Cisp Tras/Fluor/Cisp Behandlungsgruppe Fluor/Cisp Tras/Fluor/Cisp Abbildung 2. Kaplan-Meier-Kurve für das Gesamt-Überleben für die stark HER2 exprimierende Gruppe (n=446). In der ToGA-Studie wurde nachgewiesen, dass die Kombination aus IHC und FISH- Testverfahren prädiktiv für die Wirkung der kombinierten Behandlung mit Chemotherapie und Trastuzumab ist, wobei jedoch die nachträglichen diagnostischen Analysen darauf hinzuweisen scheinen, dass bei Patienten mit einer stärkeren HER2- Überexpression (IHC2+/FISH+ und IHC3+) die besten Prognosevoraussetzungen vorliegen. Das ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass Trastuzumab auf das Protein abzielt. Weitere Informationen zur ToGA-Studie finden Sie in der Packungsbeilage für Herceptin. Reproduzierbarkeit Reproduzierbarkeit innerhalb eines Testdurchgangs: Die Reproduzierbarkeit innerhalb eines Durchlaufs wurde in einem Labor mit 3 Proben anhand verschiedener IHC- Färbungsintensitätswerte untersucht. Jede Probe wurde dreimal getestet. Dieses Protokoll wurde für die automatisierte Färbung verwendet. Bei allen Proben waren die Ergebnisse zu 100 % reproduzierbar. Die Reproduzierbarkeit innerhalb eines Durchlaufs wurde in einem Labor mit 11 Proben anhand verschiedener IHC-Färbungsintensitätswerte untersucht. Jede Probe wurde dreimal getestet. Dieser Prüfplan wurde für die manuelle Anfärbung genutzt. Bei allen Proben waren die Ergebnisse zu 100 % reproduzierbar. Reproduzierbarkeit bei verschiedenen Durchläufen und Laboren: Die HercepTest - Analyse wurde an 5 nicht aufeinanderfolgenden Tagen in 3 verschiedenen Studienzentren an 60 verschiedenen Magenkrebsproben aus dem Bereich des Magens oder des ösophagogastralen Übergangs vorgenommen, die aus chirurgischen Resektionen oder Biopsien stammten. Die 60 Proben in der Studie wurden gleichmäßig über die drei HER2- Statuskategorien verteilt. Insgesamt wurden 2040 HER2-Bewertungen von sechs Pathologen vorgenommen. Die Übereinstimmung an verschiedenen Tagen (negativ, nicht eindeutig, positiv) lag zwischen 83,1 % und 98,3 %. Bei 47 von 60 möglichen Vergleichen lag die Übereinstimmung bei 90,0 % oder darüber. In Table 1 werden spezifische Beispiele der Vergleiche an verschiedenen Tagen angegeben, mit durchschnittlichen Übereinstimmungen von 91,2 %, 92,5 % und 92,5 % bei den drei Studienzentren. ( ) P04087EFG_01_K / p. 141/152

142 Magenkrebs Die Übereinstimmungen zwischen den Studienzentren lagen bei 82,7 %, 75,0 % und 88,0 % beim Vergleich zwischen jeweils zwei Studienzentren (siehe Table 12). Gemäß dem Genauigkeitstest von Fisher gab es keine Unterschiede bei den Ergebnissen zwischen Studienzentren. Die Übereinstimmungen zwischen den Untersuchern betrugen für die Pathologen in jedem der drei Studienzentren jeweils 88,0 %, 83,6 % und 81,0 % (Tabelle 13). Abschließend hat sich erwiesen, dass bei der HercepTest -Analyse von Magenkrebsproben an drei Studienzentren eine gute Übereinstimmung zwischen den Untersuchungen bezüglich der Tage, Studienzentren und Untersucher bestand. Tabelle 11. Übereinstimmung insgesamt an verschiedenen Tagen in Prozent Teilauswertung: 12 von 60 Vergleichen Studienzentrum 1 Studienzentrum 2 Studienzentrum 3 Tag 1 verglichen mit Tag 2 Tag 3 verglichen mit Tag 4 Tag 1 verglichen mit Tag 2 Tag 3 verglichen mit Tag 4 Tag 1 verglichen mit Tag 2 Tag 3 verglichen mit Tag 4 1 CI95 LL: 95 % Untergrenze Konfidenzintervall. Untersucher 1 Untersucher 2 Durchschnitt Übereinstimmung CI95 LL 1 Übereinstimmung CI95 LL 1 Übereinstimmung 85,0 74,4 93,3 84,9 93,3 84,9 93,3 84,9 95,0 87,3 83,1 72,0 96,7 89,7 95,0 87,3 90,0 80,5 91,7 82,7 96,7 89,7 91,7 82,7 91,2 92,5 92,5 ( ) P04087EFG_01_K / p. 142/152

143 Magenkrebs Tabelle 12. Übereinstimmung insgesamt zwischen Studienzentren in Prozent Übereinstimmung CI95 LL 1 Durchschnittliche Übereinstimmung Studienzentrum 1 verglichen mit Studienzentrum 2 Studienzentrum 1 verglichen mit Studienzentrum 3 Studienzentrum 2 verglichen mit Studienzentrum 3 Tag 1 verglichen mit Tag 1 Tag 2 verglichen mit Tag 2 Tag 3 verglichen mit Tag 3 Tag 4 verglichen mit Tag 4 Tag 5 verglichen mit Tag 5 Tag 1 verglichen mit Tag 1 Tag 2 verglichen mit Tag 2 Tag 3 verglichen mit Tag 3 Tag 4 verglichen mit Tag 4 Tag 5 verglichen mit Tag 5 Tag 1 verglichen mit Tag 1 Tag 2 verglichen mit Tag 2 Tag 3 verglichen mit Tag 3 Tag 4 verglichen mit Tag 4 Tag 5 verglichen mit Tag 5 1 CI95 LL: 95 % Untergrenze Konfidenzintervall. 83,3 72,4 85,0 74,4 85,0 74,4 81,7 70,5 78,3 66,7 80,0 68,6 73,3 61,2 78,3 66,7 68,3 55,9 75,0 63,0 88,3 78,5 86,7 76,4 90,0 80,5 86,7 76,4 88,3 78,5 82,7 75,0 88,0 ( ) P04087EFG_01_K / p. 143/152

144 Magenkrebs Tabelle 13. Übereinstimmung zwichen Untersuchern in Prozent Übereinstimmung CI 95 LL 1 Durchschnittliche Übereinstimmung Studienzentrum 1 Studienzentrum 2 Studienzentrum 3 Tag 1 91,7 82,7 Tag 2 91,7 82,7 Tag 3 93,3 84,9 Tag 4 83,3 72,4 Tag 5 80,0 68,6 Tag 1 86,4 76,0 Tag 2 83,3 72,4 Tag 3 83,3 72,4 Tag 4 83,3 72,4 Tag 5 81,7 70,5 Tag 1 80,0 68,6 Tag 2 78,3 66,7 Tag 3 80,0 68,6 Tag 4 78,3 66,7 Tag 5 90,0 80,5 1 CI95 LL: 95 % Untergrenze Konfidenzintervall. 88,0 83,6 81,0 ( ) P04087EFG_01_K / p. 144/152

145 Magenkrebs Immunreaktivität Tabelle 14 gibt einen Überblick über die Immunreaktivität von HercepTest mit den empfohlenen normalen Geweben. Alle Gewebe waren mit Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet worden und wurden in Übereinstimmung mit den Anleitungen der Packungsbeilage mit dem HercepTest angefärbt. Tabelle 14. Zusammenfassung der Reaktivität normaler Gewebe mit dem HercepTest Gewebetyp (Anz. getestet) Positive Gewebeelementfärbung und Färbungsmuster Nebenniere (3) Knochenmark (3) Hirn/Zerebellum (3) Hirn/Zerebrum (3) Mamma (3) Cervix uteri (3) Colon (3) Ösophagus (3) Herz (3) Niere (3) Leber (3) Lunge (3) Mesothelzellen (3) Ovar (3) Pankreas (3) Parathyroida (3) Peripherer Nerv (3) Hypophyse (3) Prostata (3) Speicheldrüse (3) Skelettmuskel (3) Haut (3) Dünndarm (3) Milz (3) Magen (3) Testes (3) Thymus (3) Thyroida (3) Tonsille (3) Uterus (3) Keine Keine Keine Keine Brustdrüse (1 von 3 Geweben, Färbungsintensität: 1+) Keine Keine Keine Keine Tubuli des Nierenmarks (3 von 3 Geweben, 1 2+ bei 5 50% der Zellen, zytoplasmisch) Keine Keine Keine Keine Keine Keine Keine Keine Prostatadrüse/-gänge (3 von 3 Geweben, Färbungsintensität: 1+, 50 % der Zellen, zytoplasmisch) Keine Keine Schweißdrüsen (1 von 3 Geweben, 1+, 30% der Zellen, zytoplasmisch) Zylinderepithel, Oberfläche (1 von 3 Geweben, Färbungsintensität: 2+, 25% der Zellen) Keine Epithel (1 von 3 Geweben, Färbungsintensität: 1+, 25% der Zellen) Keine Keine Keine Plattenepithelien (3 von 3 Geweben, Färbungsintensität: 1+, 80% der Zellen) Keine Sofern nicht anders angegeben, war die beschriebene Färbung in allen Geweben membranös. Alle drei Proben jedes Gewebetyps wiesen außer anders lautend angegeben die gleiche Färbungsintensität auf. ( ) P04087EFG_01_K / p. 145/152

146 Magenkrebs Fehlersuche - Magenkarzinom Es ist auf den Abschnitt zur Störungsbeseitigung in dem unter (19) angegebenen Handbuch Bezug zu nehmen. Ungewöhnliche Anfärbungen können dem Technischen Kundendienst von Dako zur Kenntnis gebracht werden. Problem Wahrscheinliche Ursache Empfohlene Maßnahme 1. Keine Färbung der Objektträger 2. Schwache Färbung der Objektträger 3. Zu starke Hintergrundfärbung der Objektträger 1a. Programmierfehler. Reagenzien in falscher Reihenfolge verwendet 1b. Reagenzieneinsätze wurden nicht in den korrekten Lokationen in den Reagenzienaufnahmen untergebracht 1c. Unzureichende Reagenzienmenge in Reagenzieneinsatz 1a. Programmierungsraster überprüfen, um das korrekte Programmieren des Färbedurchgangs zu verifizieren 1b. Reagenzien-Diagramm überprüfen, um die korrekte Lokation der Reagenzieneinsätze zu verifizieren 1c. Vor Beginn des Testdurchlaufs überprüfen, ob genügend Reagenz in die Reagenzgläser eingefüllt wurde. Die benötigten Volumina dem Positionsschema für Reagenzien entnehmen. 1d. Natrim-Azid in der Waschlösung 1d. Frischen Ansatz des im Kit enthaltenen Waschpuffers (Wash Buffer) verwenden 1e. Übermäßig starkes Erwärmen der eingebetteten Gewebeschnitte vor der Entparaffinierung und wärmeinduzierten Antigendemaskierung kann zu einem Verlust der sichtbaren HER2-Immunreaktionsfähigkeit führen. 1e. Sie trocknen die Gewebeschnitte an der Luft bei Raumtemperatur mindestens 12 Stunden lang oder bis zur vollständigen Trockenheit. Oder bei 37 C über Nacht oder bei 60 C maximal 1 Stunde. Die Trocknung der Gewebeschnitte bei erhöhten Temperaturen darf nur in einem kalibrierten Ofen mit gleichförmiger Wärmeverteilung erfolgen (17). 2a. Inadäquate Epitopdemaskierung 2a. Überprüfen, ob die Epitope Retrieval Solution 40 Minuten lang eine Temperatur von C aufgewiesen hat und weitere 20 Minuten Zeit zum Abkühlen hatte 2b. Unzureichende Inkubationszeiten der Reagenzien 2c. Ungeeignete Fixiermethode angewendet. 2d. Übermäßig starkes Erwärmen der aufgezogenen Gewebeschnitte vor der Entparaffinierung und wärmeinduzierten Antigen- Demaskierung kann zu einem erheblichen Abfall der sichtbaren HER2-Immunreaktionsfähigkeit führen. 2b. Anleitungen für die Färbeprozedur erneut überprüfen 2c. Sicherstellen, dass das Patientengewebe nicht übermäßig fixiert oder kein alternatives Fixiermittel verwendet wurde 2d. Sie trocknen die Gewebeschnitte an der Luft bei Raumtemperatur mindestens 12 Stunden lang oder bis zur vollständigen Trockenheit. Oder bei 37 C über Nacht oder bei 60 C maximal 1 Stunde. Die Trocknung der Gewebeschnitte bei erhöhten Temperaturen darf nur in einem kalibrierten Ofen mit gleichförmiger Wärmeverteilung erfolgen (17). 3a. Paraffin nicht vollständig entfernt 3a. Frische Reinigungslösungen verwenden und die im Abschnitt B.1 beschriebenen Verfahren befolgen ( ) P04087EFG_01_K / p. 146/152

147 Magenkrebs 3b. Beim Aufbringen der Schnitte auf die Objektträger wurden Stärkezusätze verwendet 3b. Keinerlei Stärkezusätze zur Haftung der Schnitte an der Glasoberfläche verwenden. Viele Additive sind immunreaktiv 4. Gewebe lösen sich vom Objektträger ab 5. Übermäßig starke spezifische Anfärbung 6. Schwaches Anfärben der 1+ Zelllinie des Kontrollobjektträgers 3c. Objektträger wurden unzureichend gespült 3d. Schnitte sind während der Färbung ausgetrocknet 3e. Schnitte trockneten während des Einsetzens in den Autostainer aus 3f. Ungeeignete Fixiermethode angewendet. 3g. Unspezifische Bindung der Reagenzien an Gewebe 4a. Verwendung ungeeigneter Objektträger 5a. Ungeeignete Fixiermethode angewendet. 5b. Nutzung einer unangemessenen Wärmequelle für die Epitopdemaskierung, z. B. Dampfapparat, Mikrowelle oder Autoklav 3c. Autostainer muss vor dem Durchlauf vorschriftsmäßig vorgefüllt sein. Prüfen, ob ausreichend Puffer für den gesamten Durchlauf vorhanden ist. Frisch angesetzte Puffer- und Waschlösungen verwenden. 3d. Überprüfen, ob den Schnitten das korrekte Reagenzvolumen zugegeben wurde. Sicherstellen, dass der Testdurchgang bei geschlossener Abdeckung des Autostainer durchgeführt wird und keine Aussetzung zu starker Wärme oder Zug erfolgt. 3e. Sicherstellen, dass die Schnitte während des Ladens in das Gerät und vor Starten des Durchgangs mit Puffer befeuchtet bleiben 3f. Korrektes Fixiermittel benutzen. Alternative Fixiermittel können übermäßige Hintergrundfärbung verursachen 3g. Die Proben auf vorschriftsmäßige Fixierung und eventuelle Nekrose überprüfen 4a. Silanisierte Objektträger wie z. B. Dako Silanized Slides, Code-Nr. S3003, SuperFrost Plus oder mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger verwenden 5a Sicherstellen, dass nur zugelassene Fixative und Fixiermethoden verwendet werden 5b. Sicherstellen, dass für den Schritt der Epitopdemaskierung ausschließlich ein Wasserbad genutzt wird 5c. Reagenzien zu lange inkubiert 5c. Anleitungen für die Färbeprozedur erneut überprüfen 5d. Falsche Waschlösung verwendet 5d. Nur den für das Kit empfohlenen Waschpuffer verwenden 6a. Falsches Protokoll für die Epitopdemaskierung 6b. Mangelnde Reaktion mit Substrat- Chormogen-Lösung (Substrate- Chromogen Solution, DAB) 6a. Objektträger in die vorgewärmte Epitopdemaskierungslösung eintauchen. Temperatur der Lösung wieder auf C bringen und Vorbehandlung ganze 40 Minuten lang durchführen 6b. Sicherstellen, dass die gesamte Inkubationszeit von 10 Minuten genutzt wird. Sicherstellen, dass dem DAB-gepufferten Substrat lediglich 1mL DAB Chromogen zugesetzt wurde ( ) P04087EFG_01_K / p. 147/152

148 Magenkrebs 7. Epitopdemaskierungslösung trübt sich bei Erwärmung 8. Epitopdemaskierungslösung ist bei Aufbewahrung getrübt (vor der Erwärmung) 6c. Degradation des Kontrollobjektträgers 7. Bei Erwärmung trübt sich die Lösung 8. Die Lösung wurde falsch aufbewahrt oder das Verfallsdatum der Lösung ist abgelaufen 6c. Verfallsdatum und Lagerungsbedingungen des Kits überprüfen (siehe Aufdruck auf Außenverpackung) 7. Dies ist normal und beeinträchtigt die Färbung nicht 8. Das auf der Verpackung aufgedruckte Verfallsdatum des Kits sowie dessen Lagerungsbedingungen überprüfen. Epitopdemaskierungslösung entsorgen HINWEIS: Sollte das Problem nicht auf eine oder mehrere der oben angeführten Ursachen zurückzuführen sein oder wenn das Problem durch die vorgeschlagene Abhilfemaßnahme nicht ausgeräumt werden kann, wird gebeten, den Technischen Kundendienst von Dako zu verständigen. Weitere Informationen über Färbeverfahren und Probenvorbereitung finden sich in dem bereits genannten Handbuch von Dako (19) (kann von Dako bezogen werden), im Atlas of Immunohistology (30) und in Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04087EFG_01_K / p. 148/152

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150 23. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29- A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A ( ) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA; Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, et al. Special report: quality control in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 1989;92: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: Part I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983;14: Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980;73: Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994;54: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; Jørgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78: Tanner M, Hollmén M, Junttila TT, Kapanen AI, Tomola S, SoiniY et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase II alpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005;27: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mor K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007;59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh DY, Im S-A, Lee D et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008; 32: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-esophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomized controlled trial. Lancet Bang Y, Chung J, Xu J, Lordick F, Sawaki A, Lipatov O et al. Pathological features of advanced Gastric Cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global screening programme of the ToGA trial. J Clin Oncol 2009; 27:15s (suppl; abstr 4556). 39. Van Cutsem E, Kang YK, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, et al. Efficacy results from the ToGA trial: a phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy in first-line human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive advanced gastric cancer. (presentation ASCO 2009). 40. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Büttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopath 2008;52: Asioli S, Maletta F, Verdun di Cantogno L, Satolli MA, Schena M, Pecchioni C, et al. Approaching heterogeneity of human epidermal growth factor receptor 2 in surgical specimens of gastric cancer. Human Pathol 2012; 43;11: ( ) P04087EFG_01_K / p. 150/152

151 Explanation of symbols/ Explication des symbols/ Erläuterung der Symbole Catalogue number Référence du catalogue Bestellnummer Temperature limitation Limites de température Zulässiger Temperaturbereich Batch code Code du Lot Chargenbezeichnung GHS hazard pictogram (consult precautions section) Pictogrammes de danger SGH (voir la section Précautions d'emploi) GHS-Gefahrensymbol (siehe Abschnitt zu den Sicherheitshinweisen) In vitro diagnostic medical device Dispositif médical de diagnostic in vitro In-Vitro-Diagnostikum Fragile handle with care Fragile, manipuler avec précaution Zerbrechlich, vorsichtig handhaben Use by Utiliser jusque Verwendbar bis GHS hazard pictogram (consult precautions section) Pictogrammes de danger SGH (voir la section Précautions d'emploi) GHS-Gefahrensymbol (siehe Abschnitt zu den Sicherheitshinweisen) Consult instructions for use Consulter les instructions d utilisation Gebrauchsanweisung beachten Contains sufficient for <n> tests Contenu suffisant pour <n> tests Inhalt ausreichend für <n> Ansätze Manufacturer Fabricant Hersteller ( ) P04087EFG_01_K / p. 151/152