An enzyme immunoassay for the quantitative measurement of insulin in human clinical samples. This kit contains reagents for 96 test wells.

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1 Insulin ELISA Kit Code K6219 An enzyme immunoassay for the quantitative measurement of insulin in human clinical samples. This kit contains reagents for 96 test wells. Un test enzymatique pour une mesure quantitative de l Insuline sur des échantillons humains. La trousse contient des réactifs pour 96 puits de test. Enzymimmuntest zur quantitativen Bestimmung von Insulin in humanen Proben. Dieser Kit enthält Reagenzien für 96 Vertiefungen. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 1/45

2 1 INTENDED USE Dako Insulin ELISA Kit is an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the quantitative measurement of insulin in human serum and plasma. 2 SUMMARY Insulin is the principal hormone responsible for the control of glucose metabolism. It is synthesised in the ß cells of the Islets of Langerhans as the precursor, proinsulin, which is processed to form C-peptide and Insulin, and both are secreted in equimolar amounts into the portal circulation. The mature insulin molecule comprises two polypeptide chains, the A chain (21 amino acids) and the B chain (30 amino acids), which are linked by two interchain disulphide bridges. There is, in addition, a single intra-chain disulphide bridge in the A chain. The sequence of insulin is highly conserved in mammalian species, and is homologous with the insulin-like growth factors IGF-I and IGF-II. Secretion of insulin is mainly controlled by plasma glucose concentration and the hormone has a number of important metabolic actions. Its principal function is to control the uptake and utilisation of glucose in peripheral tissues via the glucose transporter. This and other hypoglycaemic activities, such as the inhibition of hepatic gluconeogenesis and glycogenolysis are counteracted by the hyperglycaemic hormones including glucagon, epinephrine (adrenaline), growth hormone and cortisol. Insulin concentrations are severely reduced in type 1 diabetes and some other conditions such as hypopituitarism. Insulin concentrations may be raised in type 2 diabetes, obesity, insulinoma and some endocrine dysfunctions such as Cushing's syndrome and acromegaly. 1,2 The main clinical utility of insulin measurement is in the investigation of hypoglycaemia. Insulin assays have been used in the following applications:- 1. To assess the residual ß cell function, especially in newly-diagnosed cases of type 1 diabetes. 2. As an aid to the discrimination between type 1 and type 2 diabetes. 3. The diagnosis of insulinoma. 4. In the investigation of the pathophysiology of diabetes mellitus. Insulin assays are essential in various dynamic tests, such as oral or intravenous glucose tolerance tests (OGTT and IVGTT), to determine the insulin response of the pancreas and the degree of insulin resistance. In many applications, insulin measurements may be complicated by cross-reactivity with partially degraded insulin, proinsulin and split forms of proinsulin. Immune complexes of these molecules are especially problematic in patients who have developed anti-insulin antibodies through animal insulin administration. The Dako Insulin assay measures biologically active insulin with a high degree of specificity, using a pair of mouse monoclonal antibodies. These antibodies and a prototype of the assay have been described previously. 3 ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 2/45

3 3 PRINCIPLE OF THE TEST Dako Insulin is an ELISA based on two monoclonal antibodies. Simultaneous incubation of sample and enzyme-labelled antibody in a microplate microwell coated with a specific antiinsulin antibody forms a complex. A simple washing step removes unbound enzymelabelled antibody. The bound conjugate is detected by reaction with the substrate 3,3',5,5'- tetramethylbenzidine (TMB). The reaction is stopped by adding acid to give a colorimetric endpoint that is read spectrophotometrically. The inclusion of calibrators of known insulin concentration in the assay allows a calibration curve to be constructed from which the level of insulin in patient samples can be determined. Schematic diagram of the Dako Insulin Assay Principle Monoclonal anti-insulin antibody Insulin Substrate Insulin Insulin Anti-insulin/HRP conjugate Colour 4 DEFINITIONS Explanation of symbols: N Product code and catalogue number Consult the instructions for use Contains sufficient for <N> tests Manufacturer In vitro diagnostic medical device Use by Batch code Storage temperature limitations Add water 5 REAGENTS PROVIDED 96 - Each kit contains sufficient material for 96 determinations. - The shelf-life of the kit is indicated on the outer box label. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 3/45

4 5.1 DAKO INSULIN TEST CONTENTS One Instructions For Use Booklet. One 96 microwell microtitration plate of 12, 8 microwell strips coated with mouse monoclonal anti-insulin antibody. A resealable polythene bag is provided for storage of unused microwells. One bottle of each of the following: 5 ml calibrator 1: protein matrix with an anti-microbial agent. Calibrators 2-5 (lyophilised): biosynthetic insulin in a protein matrix with an anti-microbial agent. The assay is calibrated against the 1st WHO International Reference Preparation (IRP) of insulin (code 66/304), and values are expressed both in µiu/ml and S.I. units (pmol/l) (conversion factor 1 IU = 6.0 nmol 4 ). Precise values in both units are attached to the packaging and must always be used for calibration of the assay. The approximate values are: Calibrator µiu/ml pmol/l ml conjugate concentrate: anti-insulin monoclonal antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP) in an organic buffered solution containing protein, inorganic salts, a green coloured dye and an anti-microbial agent. 10 ml conjugate diluent: organic buffered solution containing inorganic salts, protein, and an anti-microbial agent. 28 ml wash buffer concentrate (15x): organic buffered solution containing detergent, inorganic salts and an anti-microbial agent. 13 ml substrate: stabilized peroxide and 3,3-5,5 - tetramethylbenzidine in a dilute buffer solution. TMB has been reported to be non-carcinogenic. However, personal protective equipment is recommended to avoid direct exposure. 13 ml stop solution: 0.46M sulphuric acid. 5.2 PREPARATION, STORAGE AND RE-USE OF KIT COMPONENTS The Dako Insulin kit format allows testing of up to 86 patient samples. In order to ensure optimal performance, it is important that all reconstituted and unused components are stored according to the following instructions Monoclonal Antibody Coated Microwells - Open the plate pouch by cutting along the seal. Break off the required number of microwell strips and relocate them into the frame. Use only complete strips. Place unused microwell strips in the resealable plastic pouch with the dessicant, carefully reseal the ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 4/45

5 pouch and store at 2-8 C. Microwells may be used f or up to 8 weeks after initial opening, provided they are stored in this manner Calibrator 1 - Ready to use. Store unused Calibrator 1 at 2-8 C. Calibrator 1 may be used for up to 8 weeks at 2-8 C after initial opening, provided it is stored in this manner Calibrators 2 to 5 - / / / Reconstitute the lyophilised calibrators with 1 ml of fresh deionised or distilled water. Discard the stopper after reconstitution. Allow to stand for minutes at room temperature, mix gently before use. Aliquot and store reconstituted calibrators upright at 2-8 C for up to 2 weeks or 20 C for up to 8 week s with a maximum of 3 freeze/thaw cycles Conjugate Concentrate and Conjugate Diluent / Dilute the conjugate concentrate (2.5 ml) by adding the conjugate diluent (10 ml). This is sufficient for 96 microwells. Mix gently before use. Store reconstituted Conjugate at 2-8 C for up to 8 weeks Wash Buffer Concentrate - Provided 15x concentrate. Prepare working strength wash buffer by adding 1 part of wash buffer to 14 parts of fresh deionised or distilled water. For 96 microwells dilute 28 ml of wash buffer concentrate with 392 ml of deionised or distilled water to give a total volume of 420 ml. Store remaining concentrate at 2-8 C. St orage after dilution at 2-8 C for up to 8 weeks Substrate - Ready to use. Store unused substrate at 2-8 C, pr otect from light Stop Solution - Ready to use. Store unused stop solution at 2-8 C. 6 ADDITIONAL REAGENTS 6.1 REAGENTS Fresh deionised or distilled water for reconstitution of calibrators 1-5 and preparation of working strength wash buffer. 6.2 ACCESSORIES The following products are intended for use in conjunction with Insulin. Contact your local Dako subsidiary or distributor for further information. The Diabetes Immunoassay Control Set (Code S6247) is intended as a tri-level control for use with diabetes immunoassays. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 5/45

6 7 EQUIPMENT The following equipment is required: Precision pipettes and disposable tips or adjustable multichannel pipettes tips to deliver µl - 0 µl. V-shaped reagent troughs. Timer. Clean absorbent paper (onto which microwells can be tapped dry). Measuring cylinder 0 ml. Microtitration plate shaker. For information on suitability of plate shakers contact your local Dako subsidiary or distributor. Automated plate washer (optional) or suitable equipment for washing 8 microwell strips (Section ). Spectrophotometer or EIA plate reader able to read a 96 microwell plate of 8 microwell strips at an absorbance of 4 nm with a reference at nm. (Optional, Section 10.3, Reading the Test Results). 8 PRECAUTIONS - For in vitro diagnostic use. For professional use only. 8.1 SAFETY PRECAUTIONS Stop solution is sulphuric acid (0.46 mol/l). Avoid eye and skin contact by wearing protective clothing and eye protection Clinical samples may contain infectious agents eg Hepatitis B virus and HIV. These should be treated as potentially infectious and handled accordingly. Assay equipment must be maintained and decontaminated according to manufacturers instructions Ensure that cuts, abrasions and skin lesions are properly protected and take precautions to avoid self inoculation or splashing of mucous membranes As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin Unused solution should be disposed of according to local, State and Federal regulations Material safety data sheet available for professional user on request. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 6/45

7 8.2 TECHNICAL PRECAUTIONS Components must not be used after the expiry date printed on the labels. Do not mix or interchange different batches/lots of reagents Test performance will be adversely affected if reagents are incorrectly diluted, modified or stored under conditions other than those detailed in Section Avoid contamination of reagents Ensure that no cross-contamination occurs between microwells at all stages of the test. It is essential that the enzyme-conjugated monoclonal antibody is not allowed to contaminate other reagents or equipment. Reserve a separate pipette for dispensing conjugate and avoid touching or splashing the rim of the microwell with conjugate. Conjugate allowed to dry on to the rim of the microwell may adversely affect the performance of the test Manual or automated washing equipment must be free of microbial contamination, be correctly calibrated and maintained according to the manufacturer's instructions Microwells cannot be re-used Do not use substrate showing a blue colour prior to its addition to the microwells Protect Substrate from light It is recommended that samples are run in duplicate until the laboratory is totally familiar with the assay Test results should be interpreted in conjunction with information available from epidemiological studies, clinical assessment of the patient and other diagnostic procedures. 9 COLLECTION AND PREPARATION OF SPECIMENS Dako Insulin has been designed for use with human serum and plasma. 9.1 SERUM Collect blood by venepuncture into tubes without additives, allow to clot and separate the serum from cells by centrifugation. Store samples for up to 3 days at 2-8 C or for up to 28 days at 20 C. Aliquot, if necessary, to avoid re peated freezing and thawing of samples and do not thaw frozen samples by heating above ambient temperature. 9.2 PLASMA Collect blood by venepuncture into tubes containing heparin or EDTA as anticoagulant. Centrifuge, separate the plasma fraction and store for up to 3 days at 2-8 C or for up to 28 days at 20 C. Aliquot, if necessary, to avoid re peated freezing and thawing of samples and do not thaw frozen samples by heating above ambient temperature. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 7/45

8 10 TEST PROCEDURE PLEASE REFER TO SECTION 8.2 TECHNICAL PRECAUTIONS BEFORE PERFORMING TEST PROCEDURE GENERAL NOTES Ensure that, within any run, all the reaction times are the same by adding reagents in the same timed sequence Pipette into the reagent trough only as much liquid as necessary for any assay to include required dead volume. Do not return excess reagents to bottles after use ASSAY PROCEDURE NOTE: The assay procedure requires the use of a microtitration plate shaker. For information on suitability of shakers contact your local Dako subsidiary or distributor Calibrator, Specimen and Control Addition Locate the required number of microtitration strips into the microwell holder, according to the number of determinations required. Pipette µl of calibrator, specimen or control into the microwells. Duplicate microwells should be used for the calibrators. The position of each patient sample on the microtitration plate must be recorded Conjugate Addition After addition of all calibrators, specimens or controls, add 100 µl of conjugate into each microwell. Avoid cross contamination between microwells First Incubation Incubate the microtitration plate on the plate shaker at C for 60 minutes Washing the Microwells The microwells should be washed using freshly prepared working strength wash buffer (Section 5.2.6). The washing technique is critical to the test performance and should be carried out so as to ensure complete filling (with a minimum of 0 µl of working strength wash buffer) and emptying of the microwells. Three wash cycles are essential, by either automated or manual washing techniques. Manual washing If washing microwells manually, aspirate or shake out the contents of the microwells and using freshly prepared wash buffer, ensure complete filling and emptying of microwells. Between each wash step remove all remaining wash buffer by tapping the inverted microwells on to clean absorbent paper. Repeat the process twice, rotating the plate after each wash to start in the opposite direction (a total of 3 washes). Manual washing efficiency is further ensured if the wash buffer is delivered at an angle so as to produce a vortex in the microwells. After the final wash, the plate should be inverted and tapped on absorbent paper to remove the last traces of wash buffer. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 8/45

9 Automated washing Automated washers should be programmed to complete 3 wash cycles. Soak steps are not required. Washers must be correctly calibrated to ensure complete filling and emptying of microwells between each wash. After the final wash, the plate should be inverted and tapped on absorbent paper to remove the last traces of wash buffer Substrate Addition and Second Incubation Add 100 µl substrate solution to each microwell. Incubate the microtitration plate on the plate shaker at C with shaking for 10 minutes. NOTE: If using a plate reader with a maximum absorbance of 2.2 AU, reduce the substrate incubation time to 7 minutes Stop the Reaction Add 100 µl stop solution to each microwell, allowing the same time interval between each strip (Section ). Ensure thorough mixing in the microwells READING THE TEST RESULTS Photometric Reading The plate must be read photometrically within 30 minutes after addition of the stop solution. Protect the plate from light until ready to read. Mix the contents of the microwells and read the absorbance of each microwell using a suitable spectrophotometer or EIA plate reader set at 4 nm. Ensure that the bottoms of the microwells are clean before reading and check that no foreign matter is present in the microwells. The reader should be blanked on air (ie with no plate in the carriage) before the plate is scanned. Alternatively if the spectrophotometer or EIA plate reader allows for the use of a reference wavelength (at 620 to 6 nm), dual wavelength reading should be performed which will eliminate any potential interference caused by aberrations, such as dirt or marks, on the optical surface of the microwells SUMMARY OF DAKO INSULIN ASSAY PROCEDURE Ensure all reagents reach room temperature (15-30 C ) before use. Add µl sample or calibrator Add 100 µl of conjugate Incubate for 60 minutes with shaking at C Wash (x3) Add 100 µl of substrate Incubate for 10 minutes with shaking at C Add 100 µl of stop solution Read absorbance at 4 nm ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 9/45

10 11 CALCULATION AND RESULTS Patient sample results are estimated from a calibration curve constructed either manually or automatically by computer AUTOMATED CALCULATION Refer to the plate reader manual. Plot the absorbance obtained against the concentration of insulin in the calibrators. A four parameter logistic curve fit is recommended to construct the calibration curve from which patient sample results are estimated. Owing to the nature of the four parameter logistic curve fit, it may be necessary to enter the value of the zero calibrator as This will ensure that the curve passes through all data points. For further details please contact your local Dako subsidiary or distributor MANUAL CALCULATION Results can be calculated manually using graph paper. Plot insulin concentration on a linear scale on the x axis and the absorbance on a linear scale on the y axis. Construct the calibration curve and use this to determine the concentration of insulin in patient samples TYPICAL CALIBRATION CURVE Absorbance (Au) Conc (µiu/ml) Note: This graph is for the purpose of illustration only and should not be used to determine results DILUTION OF SAMPLES OF HIGH CONCENTRATION Samples with concentrations of Insulin expected to be in excess of the top calibrator should be diluted 1 in 4 (v/v) with calibrator 1 before performing the assay. 12 PERFORMANCE LIMITATIONS 12.1 INTERFERENCES External clinical evaluations indicate samples containing high concentrations of lipid or bilirubin do not interfere in the Dako Insulin assay. No interference from rheumatoid factor or human anti-mouse antibodies (HAMA) was seen. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 10/45

11 12.2 HAEMOLYSIS Purified haemoglobin up to µg/ml has been shown not to interfere. Grossly haemolysed samples should not be used as lower assay values may result from enzymatic degradation of insulin "HIGH DOSE HOOK EFFECT" In two site immunoassay systems the response curve may invert in the presence of extremely high analyte concentrations. In the Dako Insulin assay, samples with insulin levels greater than the top calibrator, up to 100,000 µiu/ml will give an absorbance greater than the top calibrator SERUM AND PLASMA Both serum and plasma can be used. During clinical evaluation, no clinically significant difference was found in measured insulin between matched serum and plasma samples. Both heparin and EDTA anticoagulants may be used PROINSULIN CROSS REACTIVITY Proinsulin secreting tumours may not be detected because Dako Insulin shows no significant cross reactivity with proinsulin FORENSIC APPLICATIONS The Dako Insulin assay is not intended for forensic use and has not been validated with post mortem samples. 13 EXPECTED VALUES It is recommended that each laboratory establishes its own reference intervals. Reference intervals can differ considerably between methods. intervals established for other methods. Do not use reference All the data in this section were obtained during independent clinical evaluations of the Dako Insulin assay using serum samples. Results are expressed in International and S.I. units REFERENCE INTERVAL 79 healthy subjects were tested and the reference interval was found to be µiu/ml (11-86 pmol/l) (95% confidence interval) DIABETIC RANGE OF VALUES Figure 2 shows a histogram of frequency and range of values obtained when 1 type 1 diabetic patients were tested in Dako Insulin. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 11/45

12 Figure 2: Histogram of frequency of Insulin in type 1 diabetic patients Frequency >40 Insulin (uiu/ml) 14 PERFORMANCE CHARACTERISTICS The data presented in this section was obtained during independent clinical evaluations and/or at Dako PRECISION Within (intra) assay precision Three pools of patient samples covering the range of the assay were tested 20 times each on a single plate. Poo l n Mean SD (µiu/ml) Mean SD (pmol/l) CV (%) Between (inter) assay precision Three pools of patient samples covering the range of the assay were tested in 20 assays for pool 1 and 19 assays for pools 2 and 3. Poo l n Mean SD (µiu/ml) Mean SD (pmol/l) CV (%) ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 12/45

13 Detection Limit (Sensitivity) The limit of detection was assessed in 2 assays by testing 20 replicates of calibrator 1. The average value obtained corresponds to a signal 2.5 standard deviations from the mean signal of the calibrator 1. Detection limit: 0.5 µiu/ml (3 pmol/l) ACCURACY Linearity Four patient samples with high analyte concentrations were diluted both with calibrator 1 and a corresponding sample of low analyte concentration. Sample Diluent Dilution Factor (%) Observed/Expected (%) 1 Serum 2 Serum 3 Plasma 4 Plasma cal 1 75 Serum 75 cal 1 75 Serum 75 cal 1 75 plasma 75 cal 1 75 plasma ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 13/45

14 Recovery Two patient pools with low analyte concentrations were spiked with different concentrations of insulin and the recovery calculated as a percentage. Added insulin (µiu/ml) Recovery (%) Pool 1 Pool Pool Pool Pool 2 Pool Pool Pool Cross reactivity The specificity of the assay was assessed by observing cross reaction with structurally related peptides and hormones. Cross reactivity (%) was calculated from the mass of insulin and the mass of cross reactant giving the same assay signal. Analyte Cross Reactivity (%) Intact human proinsulin (biosynthetic) split proinsulin des split proinsulin split proinsulin des split proinsulin Human C-peptide * * C-peptide at a concentration of 00 pmol/l was below the detection limit of the insulin assay. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 14/45

15 Cross reactivity with non-human Insulin The specificity of the assay for Insulin from other species was assessed. Cross reactivity (%) was calculated from the mass of human insulin and the mass of nonhuman insulin giving the same signal. Bovine Insulin Species Cross Reactivity (%) 100 Porcine Insulin 4 Rat Insulin Negligible Mouse Insulin Negligible ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 15/45

16 1 DOMAINE D UTILISATION Le test Dako Insulin ELISA Kit est un dosage immuno-enzymologique en phase solide (ELISA) pour la détermination quantitative de l insuline dans le sérum et le plasma humains. 2 RESUME L'insuline est la principale hormone responsable du métabolisme glucidique. Cette hormone est synthétisée par les cellules β des îlots de Langerhans sous la forme d un précurseur, la proinsuline, qui se transforme en peptide C et insuline, tous deux sécrétés en quantité équimolaire dans la circulation porte. La molécule d'insuline mature comporte deux chaînes polypeptidiques : la chaîne A (21 acides aminés) et la chaîne B (30 acides aminés) qui sont réunies par deux ponts disulfures intercaténaires. De plus, il existe un pont disulfure intracaténaire à l'intérieur de la chaîne A. La séquence de l'insuline est fortement conservée chez les mammifères et est avec les somatomédines IGF-I et IGF- II. La sécrétion de l'insuline est principalement contrôlée par la concentration du glucose dans le plasma. L'hormone joue un rôle dans un ensemble de mécanismes métaboliques importants. Sa fonction principale est le contrôle de la capture et de l utilisation du glucose dans les tissus périphériques par l intermédiaire du transporteur du glucose. Cet effet hypoglycémiant ainsi que d'autres comme l'inhibition de la néoglycogénèse et de la glycogénolyse hépatiques sont neutralisés par les hormones hyperglycémiantes dont le glucagon, l'épinéphrine (adrénaline), l'hormone de croissance et le cortisol. Les concentrations en insuline sont très réduites en cas de diabète de type 1 et dans certains autres états tels que l'hypopituitarisme. Les concentrations en insuline peuvent être accrues en cas de diabète de type 2, d'obésité, d'insulinome, et de quelques dysfonctionnements endocriniens tels que le syndrome de Cushing et l'acromégalie. 1,2 L étude de l hypoglycémie constitue la principale utilisation clinique de l'insuline. Les dosages d'insuline sont utilisés dans les contextes cliniques suivants : 1. Evaluation de la fonction résiduelle des cellules β du pancréas, en particulier dans les diabète de type 1 récemment diagnostiqués. 2. Instrument de différenciation entre le diabète de type 1 et de type Diagnostic de l insulinome. 4. Etude de la physiopathologie du diabète sucré. Le dosage de l'insuline joue un rôle essentiel lors de divers tests dynamiques, comme les tests de tolérance au glucose par voie orale (TTGO) ou intraveineuse (TTGIV), en vue de déterminer la réponse insulinique du pancréas et le degré de résistance à l insuline. Dans de nombreuses applications, le dosage de l'insuline peut se compliquer du fait d une réactivité croisée avec l'insuline partiellement dégradée, la proinsuline et les formes clivées de la proinsuline. Les complexes immuns de ces molécules posent des problèmes, en particulier chez les patients ayant développé des anticorps anti-insuline à la suite de l'administration d'insuline animale. La trousse Dako Insulin dose l'insuline biologiquement active avec une grande spécificité à l'aide de deux anticorps monoclonaux de souris. Ces anticorps et le prototype de la trousse ont été décrits précédemment 3. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 16/45

17 3 PRINCIPE DU TEST La trousse Dako Insulin est un test de type ELISA basé sur deux anticorps monoclonaux. L'incubation simultanée de avec un anticorps marqué par une enzyme dans le puits d une microplaque revêtu d un anticorps spécifique anti-insuline conduit à la formation d un complexe. Une simple étape de lavage élimine l'anticorps marqué non fixé. Le conjugué lié est détecté par la réaction avec le substrat de l enzyme (tétraméthyl 3,3', 5,5' benzidine, TMB). La réaction est arrêtée par l'ajout d'acide pour donner un point de virage colorimétrique lu sur un spectrophotomètre. L incorporation dans le test de calibrateurs dont la concentration en insuline est connue permet de réaliser une courbe d étalonnage à partir de laquelle la concentration en insuline des échantillons peut être déterminée. Principe du dosage de la trousse Dako Insulin Anticorps monoclonal anti Insuline Substrat Insuline Insuline Insuline Anticorps anti Insuline conjugué à la Péroxydase Produit coloré 4 DEFINITIONS Explication des symboles : N Code du produit et référence du catalogue Consulter les instructions d utilisation Contenu suffisant pour <N> tests Fabricant Dispositif médical de diagnostic in vitro Utiliser jusqu à Code du lot Limites de température de conservation Ajouter de l eau 5 REACTIFS FOURNIS 96 - Chaque trousse contient le matériel nécessaire à 96 mesures. - La date de péremption de la trousse est indiquée sur l étiquette apposée à l extérieur de la boîte. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 17/45

18 5.1 DAKO INSULIN - CONTENU DE LA TROUSSE Une brochure d instructions d utilisation. Une plaque de microtitration comportant 96 puits, répartis sur 12 bandelettes de 8 micropuits, revêtus d un anticorps monoclonal de souris anti-insuline. Une pochette plastique réutilisable est fournie pour la conservation des bandelettes inutilisées. La trousse contient un flacon de chacun des réactifs suivants : 5 ml de calibrateur 1 : matrice protéique contenant un agent antimicrobien. Calibrateurs 2-5 (lyophilisés) : insuline biosynthétique dans une matrice protéique contenant un agent antimicrobien. Le test est calibré par rapport à la préparation internationale de référence de l'oms (PIR) de l'insuline et les valeurs sont exprimées en µui/ml et en pmol/l (unités SI). Le facteur de conversion est le suivant : 1 UI = 6,0 nmol 4. Les valeurs précises, exprimées dans les deux unités, sont indiquées dans chaque trousse et doivent toujours être utilisées pour la calibration de ce test. Ces valeurs sont approximativement les suivantes: Calibrateur µiu/ml pmol/l ,5 ml de conjugué concentré: anticorps monoclonal anti-insuline conjugué à la peroxydase de Raifort (PER) dans une solution organique tamponnée contenant des protéines, des sels inorganiques, un colorant vert et un agent antimicrobien. 10 ml de diluant pour conjugué : solution organique tamponnée contenant des sels inorganiques, des protéines et un agent antimicrobien. 28 ml de tampon de lavage concentré (15x): solution organique tamponnée contenant un détergent, des sels inorganiques et un agent antimicrobien. 13 ml de substrat: peroxyde stabilisé et 3,3'-5,5'- tétraméthylbenzidine dans un tampon de dilution. Le TMB est un produit non cancérigène. Porter cependant des vêtements de protection et des gants appropriés pour éviter toute exposition directe. 13 ml de solution d'arrêt: acide sulfurique 0,46mol/L. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 18/45

19 5.2 PREPARATION, CONSERVATION ET REUTILISATION DES ELEMENTS DE LA TROUSSE La trousse Dako Insulin permet le dosage de 86 échantillons de patients. Afin de garantir les performances optimales de la trousse, il est important de conserver tous les éléments reconstitués et inutilisés conformément aux recommandations suivantes Micropuits revêtus d anticorps monoclonaux - Ouvrir la poche de la plaque en découpant le long de la fermeture. Séparer le nombre nécessaire de bandelettes portant les micropuits et les mettre en place dans le cadre. N utiliser que des bandelettes complètes. Placer les bandelettes inutilisées dans la poche plastique réutilisable avec le dessiccateur, refermer soigneusement la poche et la conserver à 2-8 C. Les micropuits peuvent être uti lisés pendant 8 semaines après ouverture de la poche, à condition qu ils aient été conservés de cette façon Calibrateur 1 - Prêt à l emploi. Conserver le calibrateur 1 non utilisé à 2-8 C. Le calibrateur 1 peut être utilisé pendant 8 semaines après ouverture de la poche, à condition qu il ait été conservé de cette façon Calibrateurs 2 à 5 - / / / Reconstituer les calibrateurs lyophilisés avec 1 ml d'eau fraîchement distillée ou désionisée. Se débarrasser du bouchon après reconstitution. Laisser reposer pendant 10 à 15 minutes à température ambiante, puis mélanger doucement avant utilisation. Répartir en aliquotes et conserver les calibrateurs reconstitués en position droite à 2-8 C pendant 2 semaines et à 20 C pendant 8 semaines, avec au maximum 3 cycles de congélation/décongélation Conjugué concentré et diluant du conjugué / Diluer le conjugué concentré (2,5 ml) en ajoutant le diluant du conjugué (10 ml). La quantité est suffisante pour 96 micropuits. Mélanger doucement avant utilisation. Conservation après reconstitution: 8 semaines à 2 8 C Tampon de lavage concentré - Fourni sous forme concentrée 15x. Préparer la solution de travail de tampon de lavage en ajoutant 1 volume de tampon de lavage concentré à 14 volumes d'eau fraîchement distillée ou désionisée. Pour 96 micropuits, diluer 28 ml de tampon de lavage concentré avec 392 ml d'eau fraîchement distillée ou désionisée pour obtenir un volume total de 420 ml. Conserver la solution concentrée restante à 2-8 C. Conservation après dilution: 8 semaines à 2-8 C Solution de substrat - Fourni prêt à l'emploi. Conserver le substrat inutilisé à 2-8 C à l abri de la lumière Solution d'arrêt - Fournie prête à l'emploi. Conserver la solution d'arrêt inutilisée à 2-8 C. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 19/45

20 6 REACTIFS SUPPLEMENTAIRES 6.1 REACTIFS Eau fraîchement désionisée ou distillée pour la reconstitution des calibrateurs 1 à 5 et la préparation de la solution de travail du tampon de lavage. 6.2 ACCESSORIES Les produits suivants sont destinés à être utilisés conjointement avec le test Insuline. Pour toute information, veuillez contacter votre filiale ou votre distributeur local(e) Dako. Le Diabetes Immunoassay Control Set (Code S6247) est un contrôle à trois niveaux destiné à être utilisé avec les dosages immuno-enzymatiques liés au diabète. 7 EQUIPEMENT Le matériel suivant est nécessaire: Pipettes de précision et embouts jetables ou embouts pour pipettes réglables multicanaux permettant de distribuer de à 0 µl. Cuves à réactifs en V. Chronomètre. Papier absorbant propre (sur lequel tapoter les micro-puits pour les sécher). Eprouvette jaugée de 0 ml. Agitateur de plaques de microtitration. Pour toute information sur l utilisation des agitateurs de microplaques, consulter la filiale ou le distributeur Dako de votre pays. Laveur de plaques automatisé (optionnel) ou équipement de lavage adapté au lavage des bandelettes portant 8 micropuits (Section ). Spectrophotomètre ou lecteur de plaques EIA capable de lire une plaque de 96 micropuits constituée de bandelettes portant 8 micropuits à une longueur d onde d absorbance de 4 nm avec une longueur d onde de référence de nm. (Optionnel, Section 10.3, Lecture des résultats du test). 8 PRECAUTIONS - Pour diagnostic in vitro. Pour usage professionnel uniquement. 8.1 MESURES DE SECURITE La solution d'arrêt contient de l'acide sulfurique 0,46 mol/l. Eviter tout contact avec les yeux ou la peau par le port de vêtements et d équipements de protection. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 20/45

21 8.1.2 Les échantillons cliniques sont susceptibles de renfermer des agents infectieux comme, par exemple, le virus de l'hépatite B et le virus HIV. Tous les échantillons, calibrateurs, contrôles et matières susceptibles d avoir été en contact avec eux doivent être considérés comme potentiellement infectieux et manipulés en conséquence S assurer que les coupures, abrasions et lésions cutanées soient correctement protégées et prendre les précautions nécessaires pour éviter l auto-inoculation ou les éclaboussures sur les membranes muqueuses Comme avec tout produit d origine biologique, respecter les procédures de manipulation appropriées Porter un équipement de protection approprié pour éviter le contact avec les yeux et la peau Les solutions non utilisées doivent être éliminées conformément aux réglementations locales et nationales Des Fiches techniques de sécurité (MSDS) sont disponibles sur demande pour les utilisateurs professionnels. 8.2 PRECAUTIONS TECHNIQUES Les composants ne doivent pas être utilisés au-delà de la date de péremption qui figure sur les étiquettes. Ne pas mélanger ou intervertir divers lots de réactifs Les performances des tests peuvent être influencées par une dilution incorrecte, une modification des réactifs, ou par une conservation s opérant dans des conditions différentes de celles qui sont détaillées dans la Section Eviter la contamination des réactifs S assurer de l absence de contamination croisée entre les micropuits lors de toutes les étapes du test. Il est essentiel que l anticorps monoclonal conjugué à l enzyme ne puisse pas contaminer les autres réactifs ou équipements. Réserver une pipette distincte pour la distribution du conjugué et à celle de l amplificateur. Eviter de toucher ou d éclabousser le bord du micropuits avec le conjugué. La présence de conjugué sec sur le bord du micropuits est susceptible d influencer les performances du test Les équipements de lavage manuels ou automatisés doivent être exempts de contamination microbienne, correctement calibrés et entretenus conformément aux instructions de leurs fabricants Les micropuits ne peuvent pas être réutilisés Ne pas utiliser un substrat qui présente une coloration bleue avant son addition dans les micropuits Conserver le substrat à l abri de la lumière Il est recommandé de traiter les échantillons en double jusqu à ce que le laboratoire soit complètement familiarisé avec le dosage Les résultats des analyses doivent être interprétés en fonction des informations disponibles provenant des études épidémiologiques, de l évaluation clinique du patient et des autres procédures de diagnostic mises en œuvre. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 21/45

22 9 PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS La trousse Dako Insulin a été conçue pour être utilisé sur du sérum et du plasma humains. 9.1 SERUM Prélever le sang par ponction veineuse dans des tubes qui ne contiennent pas d'additifs, laisser coaguler et séparer le sérum des cellules par centrifugation. Conserver les échantillons jusqu'à 3 jours à 2 8 C ou jusqu'à 28 jours à 20 C. Répartir en aliquotes si nécessaire pour éviter de faire subir aux échantillons des cycles de congélation/décongélation ; ne pas décongeler les échantillons congelés en les chauffant au-delà de la température ambiante. 9.2 PLASMA Prélever le sang par ponction veineuse dans des tubes contenant de l héparine ou de l'edta comme anticoagulant. Centrifuger, séparer le plasma et conserver pendant 3 jours à 2 8 C ou jusqu'à 28 jours à 20 C. Répartir e n aliquotes si nécessaire pour éviter de faire subir aux échantillons des cycles de congélation/décongélation ; ne pas décongeler les échantillons congelés en les chauffant au-delà de la température ambiante. 10 PROCEDURE DE TEST VEUILLEZ VOUS REFERER A LA SECTION 8.2 PRECAUTIONS TECHNIQUES AVANT DE REALISER LA PROCEDURE DU TEST 10.1 REMARQUES GENERALES S assurer, en cours de traitement, que toutes les durées de réaction soient les mêmes en ajoutant les réactifs selon une même séquence chronométrée Ne pipeter que la quantité nécessaire à chaque dosage dans la cuve à réactif, de façon à prendre en compte le volume mort. Ne pas récupérer les réactifs en excès dans les flacons après usage PROCEDUREDE DOSAGE Remarque : la procédure de dosage nécessite l emploi d un agitateur de plaques de microtitration. Pour plus d informations concernant la conformité des agitateurs de plaques veuillez contacter votre filiale ou distributeur local(e) Dako Addition du calibrateur, de l échantillon et du contrôle Identifier le nombre nécessaire de bandelettes de microtitration dans le support des micropuits, en fonction du nombre de déterminations requis. Pipeter µl de calibrateur, d échantillon ou de contrôle dans les micropuits. Pour les calibrateurs, dupliquer les micropuits utilisés. Les positions de tous les échantillons de patients sur la plaque de microtitration doivent être enregistrées Addition du conjugué Après addition de tous les calibrateurs, échantillons et contrôles, ajouter 100 µl de conjugué dans tous les micropuits qui doivent être utilisés. Eviter les contaminations croisées entre les micropuits. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 22/45

23 Première incubation Incuber la plaque de microtitration sur l agitateur de plaques à C sous agitation pendant 60 minutes Lavage des micropuits Les micropuits doivent être lavés à l aide d une solution de travail du tampon de lavage fraîchement préparée (voir Section 5.2.6). La technique de lavage mise en œuvre doit garantir un remplissage (avec au minimum 0 µl de solution de travail du tampon de lavage à l aide d une pipette multicanaux) et un vidage complets des micropuits. Les trois cycles de lavage jouent un rôle essentiel, que ce soit dans le cadre de techniques manuelles ou automatisées. Lavage manuel: En cas de lavage manuel des micropuits, aspirer ou agiter leurs contenus et, à l aide d une solution tampon de lavage fraîchement préparée, s assurer du remplissage et du vidage complets des micropuits. Entre chaque étape du lavage, éliminer tout le tampon restant en tapotant les micropuits retournés sur une matière absorbante propre. Répéter deux fois le processus, faire tourner la plaque après chaque lavage de façon à commencer dans la direction opposée. L efficacité du lavage manuel est renforcée en distribuant le tampon de lavage selon un angle tel qu il se forme un vortex dans les micropuits. Après le lavage final, la plaque doit être retournée et tapotée sur du papier absorbant de façon à éliminer les dernières traces de tampon de lavage. Lavage automatique Les appareils de lavage automatisé doivent être programmés pour réaliser 3 cycles de lavage. Les étapes de trempage ne sont pas nécessaires. Les appareils de lavage doivent être correctement calibrés pour garantir un remplissage et un vidage complets des micropuits entre chaque lavage. Après le lavage final, la plaque doit être retournée et tapotée sur du papier absorbant de façon à éliminer les dernières traces de tampon de lavage Addition du substrat et deuxième incubation Ajouter 100 µl de solution de substrat dans tous les micro-puits. Incuber la plaque de microtitration sur l agitateur de plaques à C sous agitation pendant 10 minutes. REMARQUE : En cas d'utilisation d'un lecteur de plaque, dont l'absorbance maximale est seulement de 2,2 unités d'aabsorbance, réduire le temps d'incubation du substrat à 7 minutes Arrêt de la réaction Ajouter 100 µl de solution d arrêt à tous les micropuits, en laissant le même intervalle de temps entre chaque bandelette (voir Section ). Procéder à un mélange minutieux dans les micropuits LECTURE DES RESULTATS DU TEST Lecture photométrique La plaque doit être lue au moyen d un photomètre dans les 30 minutes qui suivent l addition de la solution d arrêt. Placer la plaque à l'abri de la lumière jusqu'au moment ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 23/45

24 de la lecture. Mélanger le contenu des micropuits et lire l absorbance de tous les micropuits à l aide d un spectrophotomètre approprié ou d un lecteur de plaques EIA réglé sur 4 nm. S assurer que les fonds des micropuits soient propres avant de procéder à la lecture et vérifiez l absence de matières étrangères dans les micropuits. Avant de lire la plaque, il est nécessaire de réaliser un blanc sur l air avec le lecteur (sans plaque dans le chariot, par exemple). Par ailleurs, si le spectrophotomètre ou le lecteur de plaques EIA permet l utilisation d une longueur d onde de référence (de 620 à 6 nm), une lecture à deux longueurs d onde doit être réalisée afin d éliminer toute interférence potentielle due à des aberrations telles que de la poussière ou des traces sur les surfaces optiques des micropuits RESUME DE LA PROCEDURE DE DOSAGE DE LA TROUSSE DAKO INSULIN S assurer que tous les réactifs sont à température ambiante (15-30 C ) avant emploi. Ajouter µl d échantillon ou de calibrateur Ajouter 100 µl de conjugué Laver 3 fois Incuber pendant 60 minutes sous agitation à C) Ajouter 100 µl de substrat Ajouter 100 µl de solution d arrêt Incuber pendant 10 minutes sous agitation à C Lire l absorbance à 4 nm 11 CALCUL ET RESULTATS La concentration en insuline des échantillons testés est évaluée à partir d'une droite d'étalonnage réalisée manuellement ou automatiquement à l aide d'un ordinateur CALCUL AUTOMATISE Se référer au manuel du lecteur de plaques. Tracer l absorbance obtenue par rapport à la concentration en insuline dans les calibrateurs. Un ajustement de la courbe logistique à quatre paramètres est recommandé pour construire la droite d étalonnage à partir de laquelle des les résultats des patients sont estimés. Par suite de la nature de l ajustement de la courbe logistique à quatre paramètres, il peut être nécessaire de prendre 0,001 comme valeur pour le calibrateur 0. Ceci permet de garantir que la courbe passe par tous les points de données. Pour toute information, veuillez contacter votre filiale ou votre distributeur local(e) Dako. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 24/45

25 11.2 CALCUL MANUEL Les résultats peuvent être calculés manuellement à l aide de papier millimétré. Tracer la concentration en insuline selon une échelle linéaire sur l axe des x et l absorbance selon une échelle linéaire sur l axe des y. Construire la droite d étalonnage et l utiliser pour déterminer la concentration en insuline dans les échantillons des patients DROITE D ETALONNAGE CLASSIQUE Absorbance (Au) Conc (µui/ml) Remarque: Ce graphique n est proposé qu à titre d illustration et ne doit en aucun cas être utilisé pour déterminer des résultats 11.4 DILUTION DES ECHANTILLONS FORTEMENT CONCENTRES Les échantillons dont les concentrations en insuline sont susceptibles de dépasser celle du calibrateur le plus concentré, doivent être dilués au ¼ (v/v) avec le calibrateur 1 avant de procéder au dosage. 12 PERFORMANCES 12.1 INTERFERENCES Les évaluations cliniques externes indiquent que de fortes concentrations en lipides ou bilirubine dans les échantillons n interfèrent pas sur les résultats de la trousse Dako Insulin. Aucune interférence n a été observée avec le facteur rhumatoïde ou les anticorps humain anti-souris (HAMA) HÉMOLYSE Il a été démontré que l hémoglobine purifiée, jusqu à une concentration pouvant atteindre µg/ml, ne conduit pas à des interférences avec le dosage. Les échantillons très fortement hémolysés ne doivent pas être utilisés, car une dégradation enzymatique de l insuline peut conduire à une diminution des valeurs mesurées. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. /45

26 12.3 EFFET «CROCHET A HAUTE DOSE» Dans des systèmes de dosage immunologique de type sandwich, la courbe de réponse peut s inverser en présence de très fortes concentrations en analyte. Pour le test Dako Insulin, les échantillons dont les concentrations en insuline sont supérieures à celles du calibrateur le plus concentré, jusqu à µul/ml, présentent une absorbance supérieure à celle du calibrateur le plus concentré SERUM ET PLASMA Le sérum et le plasma peuvent être utilisés. Pendant l évaluation clinique, aucune différence notable d un point de vue clinique n a été trouvée en dosant l insuline dans les échantillons de sérum et de plasma correspondants. L héparine ou l EDTA peuvent être utilisés comme anticoagulant REACTIVITE CROISEE AVEC LA PROINSULINE La trousse Dako Insulin n ayant présenté aucune réactivité croisée avec la proinsuline, les tumeurs sécrétant de la proinsuline peuvent ne pas être détectées APPLICATIONS EN MEDECINE LEGALE La trousse Dako Insulin n est pas destinée à une utilisation en médecine légale et il n a pas été validé sur des échantillons post mortem. 13 VALEURS ATTENDUES Il est recommandé à chaque laboratoire d établir ses propres valeurs de référence. Les intervalles de référence peuvent varier considérablement selon les méthodes. Ne pas utiliser de valeurs de référence établies avec d autres méthodes. Toutes les données de cette section ont été obtenues au cours d évaluations cliniques indépendantes du test Dako Insulin, en utilisant des échantillons de sérum. Les résultats sont exprimés en unités internationales et en unités du système S.I INTERVALLE DE REFERENCE 79 sujets sains ont été testés et les résultats ont conduit à un intervalle de référence compris entre 1,8 et 14,3µUl/mL (11-86pmol/L) (intervalle de confiance à 95%) VALEURS OBTENUES AVEC DES PATIENTS DIABETIQUES La figure 2 présente un histogramme de fréquences et une série de valeurs obtenues chez 1 patients atteints de diabète de type 1 testés avec la trousse Dako Insulin. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 26/45

27 Figure 2: Histogramme de fréquences chez les patients atteints de diabète de type Fréquence >40 Insuline (uiu/ml) 14 PERFORMANCES Les données présentées dans cette section ont été obtenues au cours d évaluations cliniques indépendantes réalisées avec la trousse Dako PRECISION Précision à l intérieur d un dosage (intradosage) 3 lots d échantillons de patients dont les concentrations en insuline étaient réparties dans l intervalle de mesure ont été testés 20 fois chacun sur une seule plaque. Lot n Moy ET (µui/ml) Moy ET (pmol/l) CV (%) ,5 0, , ,8 3, , , , Précision entre dosages (interdosage) 3 lots d échantillons dont les concentrations en insuline étaient réparties dans l intervalle de mesure ont été testés 20 fois pour le lot 1 et 19 fois pour les lots 2 et 3. Lot n Moy ET (µui/ml) Moy ET (pmol/l) CV (%) ,7 0, , ,8 4, , , ,2 ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 27/45

28 Limite de détection (Sensibilité) La limite de détection a été évaluée dans le cadre de 2 dosages à 20 reprises le calibrateur 1. La limite de détection correspond à un signal de 2,5 fois l écart type par rapport au signal moyen du calibrateur 1. Limite de détection : 0,5 µul/ml (3 pmol/l) EXACTITUDE Linéarité 4 échantillons dont les concentrations en insuline étaient très élevées ont été dilués avec le calibrateur 1 et avec un échantillon dont la concentration en insuline est faible. Echantillon Diluant Facteur de dilution (%) Valeurs Obtenues / Valeurs attendues (%) 1 Sérum 2 Sérum 3 Plasma 4 Plasma Cal Sérum 75 Cal Sérum 75 Cal Plasma 75 Cal Plasma Recouvrement 2 échantillons dont les concentrations en insuline étaient faibles ont été surchargés avec diverses concentrations eninsuline et le recouvrement a été calculé en pourcentage. ( ) K6219/EFG/CKJ/ p. 28/45

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