Anleitung zum Praktikum Strukturanalytik

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1 Anleitung zum Praktikum Strukturanalytik WS 2014/15 Fakultät für Biochemie, Pharmazie und Psychologie Institut für Biochemie Professur für Biophysikalische Chemie

2 Inhalt X ray I und II X ray III FRET MS I MS II NMR I NMR II IR EPR

3 X ray I und II Es handelt sich um zwei zweistündige Vorlesungen für alle Gruppen gemeinsam bei Prof. Sträter. Unterlagen dazu finden Sie unter: leipzig.de/~straeter/intern User: bbz Password: memento

4 X ray III

5 Übung X-ray III im Praktikum Biophysikalische Chemie für Biochemiker A. Kristallisation- Das Enzym Lysozym aus Hühnereiweiß (Fa. VWR, ) soll mittels der Hängetropfen-Methode über Nacht kristallisiert werden. Als Kristallisationsmittel (Fällungsmittel) dient NaCl im Konzentrationsbereich 4-7 % (w/v) mit dem Puffersystem 0,1 M NaAcetat bei ph 4,5. Folgende Lösungen sind bereits vorhanden: - Pufferlösung (0,1 M NaAcetat, ph 4,5) - Lysozymlösung von 30 mg/ml in Pufferlösung (0,1 M NaAcetat bei ph 4,5 oder MembraPur-H 2 O) - 4 / 5 / 6 / 7 % (w/v) NaCl in Pufferlösung davon jeweils 0,5 ml je Reservoir Jeder Teilnehmer hat 4 (NaCl-Konzentrationen) x 3 (Wiederholungen) = 12 Hängetropfen (je 4 µl Protein mit 4 µl Reservoirlösung mixen) anzusetzen, entsprechend einer Kristallisations-Halbplatte. Die Kristallisationsplatten werden anschließend bei 19 C gelagert. Zusätzlich sind bereits vorhandene Lysozymkristalle der Vorgängergruppen am Mikroskop mit der Digitalkamera zu dokumentieren. Die eigenen Kristalle werden erst am nächsten Tag sichtbar und wachsen bis zu drei Tagen. Beachten Sie bitte, dass die äußere Gestalt der Proteinkristalle schon Hinweise auf die innere Ordnung (Symmetrie) geben kann - suchen Sie nach Symmetrie! Zur Verifizierung von Proteinkristallen gegenüber Salzkristallen werden ausgewählte Nachweismethoden ausprobiert (Bruchtest, Anfärbetest mit Proteinfarbstoffen, Röntgentest - siehe B). Dabei wird auch auf Handhabungsmethoden (Kryo-Schleifen, Quartz-Kapillaren) für Proteinkristalle eingegangen. B. Datensammlung- Ein nicht zu großer Proteinkristall (< 400 µm für maximale Kantenlänge) einer Vorgängergruppe ist entweder bei Raumtemperatur (Quartz-Kapillare) oder im tiefgekühlten Zustand (Kryo-Schleife) bei 100 K am Röntgenmessplatz zu vermessen. Bei Tiefkühlung ist der Proteinkristall vorher sukzessive in einer mit ansteigender Konzentration eines Gefrierschutzmittels (25 v/v % Glycerol) versetzten Reservoirlösung zu inkubieren. Alternativ kann der Proteinkristall kurz durch einen Tropfen Paraffinöl gezogen werden, bevor er in den fl[ussigen Stickstoff getaucht wird. Beide Methoden verhindern unerwünschte Eisbildung, welche das Messergebnis (Diffraktionsbild) erheblich verschlechtertern. Das erhaltende Diffraktionsbild (30 sec - 1 min Belichtungszeit bei Drehung des Kristalls um 1 entlang der sogenannten Spindelachse) stellt nur eine exemplarische Messung von vielen dutzenden bis hunderten Messaufnahmen dar, die zu einem Diffraktionsdatensatz führen. C. Modellbau- Es soll die Struktur der menschlichen violetten sauren Phosphatase (HPAP) in Teilen bestimmt werden. Das Phasenproblem wurde mit der Methode des molekularen Ersatzes gelöst, wobei eine bekannte Struktur (hier die der saueren violetten Phosphatase des Schweins = Uteroferrin) in die Elementarzelle der zu bestimmenden Struktur gedreht wurde. Dann konnte eine Elektronendichtekarte der zu bestimmenden Proteinstruktur berechnet werden. Mit Hilfe dieser Elektronendichtekarte kann die Struktur von HPAP ausgehend von der Struktur des Startmodells (Uteroferrin) gebaut werden. Linux! Das notwendige Programm Coot und die betreffenden Dateien sollten bereits eingeladen sein: Dateien: /HPAP/hpap.map Elektronendichtekarte der humanen PAP /HPAP/model.pdb Koordinatendatei des Uteroferrins nach molekularem Ersatz /HPAP/hpap.pdb Koordinatendatei der fertigen HPAP-Struktur

6 Beachten Sie folgende Menüs: Displaymanager (Ein/Abschalten der einzelnen Objekte) Edit Map Colour hpap.map (Farbe der Elektronendichtekarte) Go to Atom (Anklickbare Aminosäuresequenz/Nummerneingabe mit Zentrierfunktion) Die Ansicht der Moleküle verändern Sie mit: Mausrad klicken auf ein Atom = Zentrieren auf das Atom und Aktualisierung der Elektronendichtekarte Rechte Maustaste gedrückt ziehen/schieben = Zoom Linke Maustaste gedrückt bewegen = dreidimensionale Rotation in allen drei Raumachsen Linke Maustaste auf Aminosäure im Sequence View -Fenster klicken = Zentrieren auf die Aminosäure und Aktualisieren der Elektronendichtekarte Mausrad bewegen (VORSICHT!) = Konturierunglsevel der Elektronendichtekarte verändern (nach Betätigung wird Wert angezeigt und sollte wieder auf ca. sigma = 1 gebracht werden) Leertaste oder Shift+Leertaste = Springen der aktuellen Zentrierposistion von C nach C oder nach C -1 Folgende Modellbauoptionen (rechtes Menü!) sollten Sie verwenden Mutate & Auto Fit: Mutieren und automatisches Anpassen der Seitenkette Rotate/Translate Zone: Bewegen von kompletten Aminosäuren (klicken Sie dazu nacheinander auf Hauptkettenamino- und Hauptkettencarboxylgruppe) Edit Chi Angles: Verändern der Seitenkettenwinkel Real Space Refine Zone: sehr wirkungsvolle Automatikbaufunktion für Aminosäurebereiche Rigid Body Fit Zone: Automatikbauen ganzer Aminosäurebereiche (Anfang und Ende markieren) Aufgaben: 1. Mutieren Sie 6 Aminosäurereste (6, 34, 60, 117, 121, 127) in der Modell-Struktur, die laut Sequenzvergleich (siehe Anlage) verschieden im Vergleich zur Zielstruktur sind, in die betreffenden richtigen Aminosäurereste. 2. Zentrieren Sie auf Cys142. Diese Aminosäure ist im Uteroferrin an einer Disulfidbrücke beteiligt. Ist diese Brücke auch in HPAP vorhanden (Elektronendichte)? 3. Verfolgen Sie die Kette nach Cys142 weiter C-terminal. Bald kommt ein Bereich, in dem der Hauptkettenverlauf in HPAP anders verläuft als in Uteroferrin. Bevor hier die Seitenketten eingepasst werden können, muss zunächst der ganze Rest korrekt in die Dichte geschoben werden. Bauen Sie bis Asp147 oder auch weiter. Welche Besonderheit weist Asp147 auf? Konturieren Sie dazu die Elektronendichte auf sigma größer 10 und mehr.

7 Sequenzvergleich Schwein (Uteroferrin) - Mensch (HPAP) Hinweis- Sequenznummern beziehen sich mit ihrer letzen Ziffer auf die entsprechende Position, so ist z.b. die Aminosäure 126 im Uteroferrin ein Arg (R), analog ist die Aminosäureposition 130 in HPAP ein Gln (Q).

8 FRET

9 Förster Resonanz Energietransfer (FRET) Praktikum Strukturanalytik 1. Grundlagen a. Förster Resonanz Energietransfer (FRET) i. Prinzip Für den Förster Resonanz Energietransfer werden zwei Moleküle (oder ein Molekül an verschiedenen Stellen) mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen versehen, wobei des einen Emissionsspektrum mit dem Anregungsspektrum des anderen überlappt. Wenn die beiden Fluorophore in große räumliche Nähe kommen, sei es durch Proteinwechselwirkungen oder Konformationsänderungen, kann das eine Fluorophor (der Donor) die Energie von adsorbierten Photons direkt auf das andere Fluorophor (der Akzeptor) übertragen. Demnach wird Fluoreszenzlicht entsprechend des Emissionsspektrums des zweiten Fluorophors erzeugt. Der Energietransfer ist stark abstandsabhängig und geschieht nur über Distanzen von wenigen Nanometern. Deshalb eignet sich die Technik um Molekülstrukturen auf Nanometerskala zu detektieren. ii. Fluoreszenzspektrometrie Es können viele verschiedene Analysetechniken verwendet werden um den Energieübertrag aus FRET zu messen. Während meist ein Fluoreszenzmikroskop zur räumlichen Auflösung von FRET zum Einsatz kommt, soll in diesem Praktikumsversuch ein Fluoreszenzspektrometer eine qualitative Aussage über die Effizienz von FRET in einer Proteinlösung ermöglichen. Annähernd monochromatisches Licht wird durch einen ersten Filter erzeugt, der entsprechend der Anregungswellenlänge des ersten Fluorochroms gewählt ist. Nachdem das gefilterte Licht auf ein entsprechendes Fluorochrom getroffen ist, dieses angeregt hat, findet, je nachdem ob ein Fluorochrom der zweiten Art in der Nähe ist, FRET statt oder nicht. Für die Analyse der Häufigkeit von FRET wird das emittierte Licht durch einen zweiten Filter geleitet, der entsprechend der Emissionswellen b. Untersuchung der Konformation von Fibronektin i. Fibronektin als Bestandteil der extrazellulären Matrix Fibronektin ist ein etwa 470kDa großes Glykoprotein der extrazellulären Matrix und dient da zum einen als strukturgebendes Element, zum anderen stellt es auch Bindungstellen für Zelladhäsionsrezeptoren und andere Matrixproteine bereit. Fibronektin ist ein Heterodimer aus zwei Untereinheiten, die wiederum aus einer Anzahl Domänen verschiedenen Typs (siehe Abbildung 1) bestehen. Abbildung 1: Ein Fibronektinmonomer besteht aus Domänen dreier Typen, die Bindungstellen für andere Matrixproteine und Zelladhäsionsrezeptoren bereithalten. Über die Dissulfidbrücke sind zwei Monomere zu einem Heterodimer verknüpft. Quelle: (2) In der extrazellulären Matrix kommt Fibronektin in unlöslichen, großen Aggregaten vor, die sich in fibrillärer Form zusammengelagert haben. Dieser Prozess geschieht unter Kraftausübung der Zelle, die über Zellrezeptoren an das Molekül gebunden ist und durch die anschließende Streckung des Moleküls werden kryptische Bindungstellen freigelegt, die eine Selbstassemblierung von Fibronektinmoleülen zu Fibrillen ermöglicht.

10 Als einzelnes Molekül ist Fibronektin löslich und wird zum Beispiel aus humanen Blutplasma gewonnen. Fibronektin kann verschiedene Konformationen annehmen, je nachdem ob es in Lösung, auf Oberflächen adsorbiert, oder in Fibrillen verbaut ist. Es gibt eine kompakte Konformation bei der die beiden Armes des Fibronektins übereinander gefaltet sind und die resultierende globuläre Form durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den beiden Armen stabilisiert wird. Bei zunehmender Denaturierung, oder unter Kraftausübung der Zelle, wird die kompakte Konformation aufgelöst und Fibronektin liegt als langes, gestrecktes Molekül vor. Bei weiterer Dehnung werden Teile des Moleküls entfaltet und dabei Bindungsstellen freigelegt (siehe Abbildung 2). Abbildung 2: Verlust der Struktur von Fibronektin unter denaturierenden Bedingungen. In Lösung nimmt Fibronektin eine kompakte Konformation an (A). Bei Denaturierung wird die kompakte Struktur aufgelöst und das Molekül ist eine lange Kette (B). Unter Fortschreitender Denaturierung werden Module entfaltet (C). Quelle: (1). ii. Untersuchung von Fibronektin mittels FRET Bei sehr starker Denaturierung von Fibronektin, zum Beispiel mittels 8M Guanidinhydrochlorid, liegen auf beiden Monomeren zwei Cysteine auf den Modulen III 7 und III 15 frei (siehe gelbe Module in Abbildung 2), die mittels eines funktionalisierten Fluoreszenzfarbstoffes markiert werden können. Im Versuch werden die mit Maleimiden versehenen Alexa Fluor 488 und Alexa Fluor 546 verwendet, bei denen unter großer räumlicher Nähe ein Energietransfer stattfinden kann. Abbildung 2 kann entnommen werden, dass die größte Wahrscheinlichkeit für einen Energietransfer in der kompakten Konformation von Fibronektin vorhanden ist und bei zunehmender Denaturierung ist eine Abnahme zu erwarten ist. Im idealen Fall sind jeweils ein Modul III 7 und III 15 jeweils mit einem Donor Fluorophor und die anderen mit einem Akzeptor Molekül versehen. Da aber von einer großen Anzahl von Molekülen mit statistisch verteilten Fluorophoren ausgegangen wird, ist es unerheblich, ob die in jedem Fluorophorpaar FRET stattfinden kann. Als Ziel des Versuchs sollen die Verhältnisse der Intensitäten nach erfolgtem Energiertransfers und der Fluoreszenz des Donors für verschieden stark denaturierende Bedingungen verglichen werden.

11 2. Versuchsdurchführung a. Fluoreszenzmarkierung des Fibronektins an freien Cysteinen Vorbereitung der Farbstofflösungen Vorbereitung von 1 10 mm Stammlösungen der Farbstoffe Alexa Flour 488 maleimide und Alexa Fluor 546 maleimide in DMSO (die Lösungen müssen lichtgeschützt aufbewahrt werden!) Überprüfung der Konzentration durch Absorptionsspektroskopie (Eppendorf BioSpectrometer) über die Extinktionskoeffizienten der Farbstoffe: Alexa Fluor 488: 720,66 g mol, 488 nm cm M Alexa Fluor 546: 1034,37 g mol, 546 nm cm M Dafür muss ein Teil der Farbstofflösungen abgenommen und verdünnt werden (etwa fach). Berechnung der Konzentration: Farbstoff / / (Küvettendicke d=1cm) Inkubation mit Alexa Flour 488 maleimide und Alexa Fluor 546 maleimide Alle Lösungen in denen Fibronektin enthalten sind sollten keinen starken Scherkräften ausgesetzt werden, da Fibronektin sonst spontan ausfibrilliert. Herstellung einer 8 M GndHCl Lösung durch Lösen von 76,42 g GndHCl ( 95,53 g mol) in 100 ml Reinstwasser 1:1 Mischung der Fibronektin Lösung mit 8 M GndHCl Hinzufügen der Farbstoff Lösungen zur Proteinlösung (tropfenweise) jeweils bis zum ca fachen molaren Überschuss (Berechnung aus Fibronektinkonzentration) Reaktionsansatz nicht größer als 2,5 ml! Ablauf der Reaktion wippend für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 C (lichtgeschützt!) Größenausschluss Chromatographie Abtrennung des ungebundenen Farbstoffs durch Größenausschluss Chromatographie mit Sephadex PD 10 Säule Äquilibrierung der Säule mit 25 ml PBS Sobald das PBS durchgelaufen ist und die Säule trocken zu fallen droht wird der Reaktionsansatz aufgetragen Gleichzeitig wird begonnen Fraktionen (ca Tropfen/Fraktion) aufzufangen und gegebenenfalls PBS auf die Säule nachgegeben Bestimmung des Labelgrades und der Fibronektin Konzentration Messung am Absorptionsspektrometer:

12 Alexa Fluor 488: FN, FN LG FN Alexa Fluor 546: FN, FN LG FN mit FN g mol, 488 nm cm 1 M 1, nm cm M Messung der Absorption der Fraktionen bei 280 nm (A 280 ), 494 nm (A 494 ) und 554 nm (A 554 ) b. Messung des Förster Resonanz Energietransfer Mit Hilfe des zweifach gefärbten Fibronektins kann die Konformationsänderung von Fibronektin bei fortschreitender Denaturierung untersucht werden. In eine Mikrotiterplatte mit (flachem Boden) wird eine bestimmte Menge an Fibronektinlösung vorgelegt Das wird im Anschluss mit verschiedenen Volumina von 8M GndHCl Lösung versetzt, sodass die GndHCl Lösung in 0M, 1M,, 4M vorliegt, jeweils mit der entsprechenden Menge PBS zum gleichen Volumen auffüllen Die Messung der Fluoreszenzintensität erfolgt im Tecan Microplate Reader mit zwei verschiedenen Filtersets: - Anregungswellenlänge bei 480 nm und Emissionswellenlänge bei 525 nm: Fluoreszenz des Donors mit Intensität I D - Anregungswellenlänge bei 480 nm und Emissionswellenlänge von 585 nm: Anregung des Donors und Fluoreszenz des Akzeptors mit Intensität I A 3. Auswertung Berechnung des Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten für alle Ansätze Auftragung des von gegen die Konzentration an denaturierender Substanz Wie ist der Verlauf der Kurve zu erklären? Warum fällt nicht bis auf 0 ab? 4. Literaturhinweise (1) Klotzsch, E., Smith, M. L., Kubow, K. E., Muntwyler, S., Little, W. C., Beyeler, F., Gourdon, D., Nelson, B. J. and Vogel, V. (2009). Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force exposed cryptic binding sites, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 106, pp (2) Wierzbicka Patynowski, I. and Schwarzbauer, J. E. (2003). The ins and outs of fibronectin matrix assembly, J. Cell. Sci., 116, pp (3)

13 MS I

14 [1] Universität Leipzig Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie & Psychologie Institut für Biochemie AK Prof. Annette Beck-Sickinger Neubau Sonderlabore, Leipzig, Stephanstrasse 24 II. Etage Praktikum Strukturanalytik Station MS I betreut durch: Regina Reppich-Sacher; Dr. Jan Stichel Tel.: ; Mail: rreppich@uni-leipzig.de; stichelj@rz.uni-leipzig.de Massenspektrometrie Die Massenspektrometrie ist eine analytische Methode zur Bestimmung der Molekülmasse von Biomolekülen (z.b. Peptiden und Proteinen). Das Massenspektrometer selbst besteht aus einer Ionenquelle, zur Erzeugung gasförmiger Ionen, einem Massenanalysator, der die Ionen hinsichtlich ihres Masse/Ladungs-Quotienten (m/z) auftrennt und einem Detektor, der das Massenspektrum liefert, aus dem abgelesen werden kann, welche Ionen in welchen relativen Mengen gebildet worden sind. Abb. 1 allg. Prinzip eines Massenspektrometers

15 MALDI-Massenspektrometrie [2] Die Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation (MALDI)-Massenspektrometrie wurde in den 1980er Jahren entwickelt. Sie ist besonders bei der Identifizierung von großen Molekülen effektiv und besitzt außerdem eine hohe Empfindlichkeit, die im Femtomol- und Subfemtomol-Bereich liegt. Die Methode beruht auf der Kokristallisation von Matrix und Analyt mit einem fachen molaren Überschuss an Matrix. Als Matrixsubstanzen werden kleine organische Moleküle gewählt, die bei der verwendeten Laserwellenlänge (z. B. Stickstoff-Laser bei einer Wellenlänge von 337 nm; frequenzverdreifachter Neodym dotierter YAG-Laser von 355nm) Energie stark absorbieren. Mit kurzen hochenergetischen Laserimpulsen von 2-5 ns Pulsdauer erfolgt die Anregung, die nach Relaxation im Kristallgitter zu explosionsartigen Teilchenablösungen an der Oberfläche des Kristalls führt. Durch die Verbindung mit der Matrix wird eine Fragmentierung von massereichen Molekülen verhindert. Abb. 2 Schematische Darstellung der Maldi-Tof-Messung

16 [3] Abb. 3 Prinzip der Maldi-MS Peptide können dabei direkt gemessen werden, Proteine werden entweder in Lösung oder nach vorhergehender Gelelektrophorese und Ausschneiden der einzelnen Banden proteolytisch verdaut und mittels ZIPTIP entsalzt. Anschließend kann man die gebildeten Peptidfragmente massenspektrometrisch bestimmen und die gefundenen Massenspektren einer Datenbanksuche unterziehen. Um die Genauigkeit der Messungen im Linearmodus (Ionen fliegen von A nach B) zu verbessern, sind moderne Geräte mit einem Reflektordetektor (Ionen werden reflektiert und umgelenkt) ausgestattet, der ein isotopenaufgelöstes Spektrum und damit die exakte Bestimmung des monoisotopischen Signals zulässt. Abb. 4 Linear- und Reflektordetektor

17 [4] ESI-Massenspektrometrie Die Electro Spray Ionisation (ESI)-Massenspektrometrie ist ebenfalls ein bevorzugtes Ionisationverfahren zur Analyse von Biomolekülen, da es sehr schonend für das Analytmolekül ist und kaum zu Fragmentationen führt. Bei der Elektrosprayionisation wird eine Analytlösung durch eine Metallkapillare geleitet, an deren Spitze eine Spannung angelegt ist. Durch die Spannung kommt es zur Bildung eines elektrischen Feldes zwischen der Kapillare und einer Gegenelektrode. Das elektrische Feld durchdringt die Analytlösung und in ihr befindliche Ionen bewegen sich elektrophoretisch auf die Gegenelektrode zu. Dabei bildet sich an der Spitze der Kapillare ein Überschuss gleichartig geladener Ionen, die sich gegenseitig abstoßen und über die Bildung eines Taylor-Kegels (Taylor-Cone) als feines Aerosol (etwa 10 µm Tropfengröße) aus der Kapillare austreten. Ein neutrales Trägergas wie Stickstoff wird häufig benutzt um die Vernebelung der Lösung und die Verdampfung des Lösungsmittels zu unterstützen. Aufgrund der Verdampfung des Lösungsmittels verkleinert sich die Tropfengröße, während die Dichte des elektrischen Feldes auf der Tropfen- Oberfläche zunimmt. Wenn der Radius der Tropfen kleiner als das sogenannte Rayleigh- Limit wird, zerfallen die Tropfen aufgrund der Abstoßung von gleichartigen Ladungen (Coulomb-Explosionen) in kleinere Tröpfchen. Für die Bildung freier Ionen in der Gasphase existieren mehrere Modellvorstellungen. Das Charge Residue Model (CRM, Modell des geladenen Rückstands) geht davon aus, dass letztlich winzige Tropfen von etwa 1 nm Durchmesser übrigbleiben, die nur ein ionisiertes Analytmolekül enthalten. Beim Ion Evaporation Model (IEM, Ionenemissionsmodell) wird angenommen, dass bereits aus größeren geladenen Tropfen freie Ionen in die Gasphase emittiert werden. Die erzeugten Ionen werden durch die Potentialdifferenz zwischen Sprayerkapillare und Orifice in das MS gelenkt. Die Art der Spannung, die an der Kapillare angelegt wird, bestimmt die Ladung der Ionen, die erzeugt werden. Durch eine positive Spannung werden positive geladene Ionen erzeugt und durch eine negative Spannung negativ geladene Ionen. Bei der Elektrospray- Ionisierung handelt es sich um eine sanfte Methode der Ionenerzeugung, bei der auch empfindliche Moleküle und nicht kovalente Aggregate ionisiert werden können. Typischerweise werden Quasimolekül-Ionen detektiert z.b.[ M+H] + bei positiver Spannung. Ein charakteristisches Phänomen der ESI-MS ist dabei die Bildung mehrfach geladener Ionen. Mithilfe der allg. Formel (M+nH) n+ kann die tatsächliche Masse des Biomoleküls ermittelt werden.

18 [5] Abb. 5 Prinzip der Esi-MS Sowohl MALDI-MS als auch ESI-MS dienen der Charakterisierung von Biomolekülen.

19 [6] Massenspektrometrie Praktischer Teil Identifizieren von Peptiden und Proteinen - Teil I Messen am BRUKER-HCT-Gerät (Esi-MS) - 1. Präparation: a) Verdünnen Sie die beiden ausliegenden Peptidlösungen mit einem Acetonitril- Wasser bidest. -Ameisensäure-Gemisch bis zu einer Endkonzentration von ca 25 µm. Es werden etwa 50µl benötigt. b) Eine bereitgestellte Proteinlösung kann in der originalen Konzentration verwendet werden. 2. Messung: a) Nachdem der Betreuer das Gerät gestartet und in den Meßbetrieb überführt hat, können Sie nun eine ausgewählte Probe über die Spritzenpumpe injizieren. b) Nach Optimierung des Sprays und Wahl des Speicherortes für das aufgenommene Spektrum, starten Sie die Aufnahme. c) Nach 2-3 min kann die Messung beendet werden; Sie füllen die Spritze mit Spüllösung und spülen die Ionenfalle ausreichend. d) Wenn das Spektrum frei von den Signalen Ihrer dosierten Probe ist, kann die nächste Probe injiziert werden, sofern die Meßmethode geeignet ist. Zum Abschluß nehmen Sie gemeinsam mit Ihrem Betreuer ein ESI-Spektrum eines unbekannten Proteins auf.

20 [7] 3. Auswertung: Die ESI-Spektren zeigen Ihnen Serien von geladenen Molekülionen. Anhand der Formel n = m 2 X m 2 m 1 (Ladung n von m1) M = n ( m1 - X ) n Anzahl der Ladungen M Molekulargewicht X Proton für Positiv Mode m1; m2 Masse-Ladungsverhältnis (m/z) im Spektrum ist es Ihnen möglich, die Molekulargewichte von Peptid 1 und Peptid 2 zu bestimmen. Signale in der Esi-MS [Ahx5-24]pNPY H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Ahx-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 Masse calc average Intens. x10 8 +MS, min #(5-148), Baseline subtracted(0.80) 5 [M+4H] [M+5H] [M+3H] m/z Bestimmumg des Molekulargewichts durch Dekonvolution der Signale RRS MS-Einführung Berechnen Sie das Molekulargewicht des unbekannten Proteins anhand der Signale im Spektrum und entscheiden Sie, ob es sich um (a) Myoglobin from Horse heart; MW D oder (b) Cytochrome C from horse heart; MW D handelt.

21 [8] - Teil IIa Messen am BRUKER-Microflex (Maldi-MS) - 1. Präparation: a) Stellen Sie eine Matrixlösung aus alpha-cyano-4-hydroxyzimtsäure nach ausliegender Vorschrift her. b) Tragen Sie 3 der zur Auswahl stehenden Peptide (A, B, C, D, E,) in geeigneter Verdünnung (ca.25µm) sowie die Calibrierstandards (gelbes Label sowie Neuropeptid Y) mit frisch hergestellter Matrixlösung mittels Dried-Droplet-Verfahren (je 0.5µl) auf ein Edelstahltarget (klein) auf. Alle Positionen der Substanzen auf den Platten sind zu notieren. Die Lösung zum Verdünnen ist 0.1%ige TFA. 2. Messung: Nach ausreichender Trocknung können Sie nun am Maldi-Tof-Gerät MICROFLEX die Peptide unter Anleitung mit einer geeigneten Meßmethode messen. Achten sie darauf, daß die monoisotopische Masse nur dann exakt bestimmt werden kann, wenn das Signal isotopenaufgelöst gemessen wurde. 3. Auswertung: Ordnen Sie die gefundenen m/z-werte in Dalton den folgenden Peptiden zu: Tab. 1 Peptide A, B, C, D, E Probenbezeichnung Masse calc. monoisotopisch Masse calc. Average gh _ ch ax Fmoc-kK cr

22 [9] - Teil IIb Messen am BRUKER-Ultraflex (Maldi-MS) - 1. Präparation: Ein Protein wurde proteolytisch verdaut und anschliessend über ZipTip aufgereinigt. Tragen Sie diese Lösung in Originalkonzentration sowie 10fach verdünnt neben einem Calibrierspot (gelbes Label) auf das Target für das Ultraflexgerät mittels Dried-Droplet- Verfahren (je 0.5µl) auf. 2. Messung und Auswertung: a) Messen Sie unter Anleitung den tryptischen Verdau. Transferieren Sie das Spektrum des tryptisch verdauten Proteins in das Programm BIOTOOLS und starten Sie eine Datenbanksuche. Sie erhalten ein Mascot search result. Versuchen Sie, das ursprünglich eingesetzte Protein zu bestimmen. b) Nehmen Sie das Spektrum eines Peptides a oder b auf. Führen Sie eine MS/MS-Messung durch. Nachdem Sie das MS/MS-Spektrum aus dem Programm FLEX ANALYSIS nach BIOTOOLS transferiert haben, können Sie nun gemeinsam mit Ihrem Betreuer die MS/MS-Fragmente labeln und interpretieren. Aminosäuresequenz: Peptid a - Ahx(5-24)pNPY, MW calc monoisotopisch H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Ahx-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2 Peptid b - hangiotensin II MW calc monoisotopisch H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH

23 [10] Fragen: 1. Welches Protein wurde proteolytisch verdaut? 2. Benötigen Sie ein MS/MS-Spektrum oder ist ein MS-Spektrum ausreichend, um etwas über die richtige Sequenz eines Peptides sagen zu können? 3. Welche Methode zur Ermittlung der Seuqenz eines Peptides ist Ihnen noch bekannt? ACN Acetonitril; TFA Trifluoressigsäure

24 MS II

25 Praktikum Biophysikalische Chemie für den Studiengang Biochemie Versuch MS II: Lipidanalytik mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie und Dünnschichtchromatographie - Effekt der Ionenunterdrückung Universität Leipzig, Medizinische Fakultät Institut für Medizinische Physik und Biophysik Härtelstr. 16/18, D Leipzig

26 Biophysikalische Chemie (WS 2013/2014) - MS II Lipidanalytik mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie und Dünnschichtchromatographie Rosmarie Süß, Yulia Popkova, Kristin Zschörnig, Beate Fuchs und Jürgen Schiller Medizinische Fakultät, Institut für Medizinische Physik und Biophysik, Härtelstr. 16/18, D Leipzig Tel.: ; Fax: juergen.schiller@medizin.uni-leipzig.de A. Allgemeine Einführung 1. Was sind Lipide und Phospholipide? Lipide spielen neben Proteinen und Kohlenhydraten eine gewaltige Rolle in der gesamten Biologie [1]. Obwohl sie in der Vergangenheit häufig etwas stiefmütterlich behandelt wurden, kann man heute als gesichert annehmen, daß Lipide u.a. bei vielen Erkrankungen eine sehr wichtige Rolle spielen (z.b. bei der Arteriosklerose) [2]. Generell werden unter Lipiden vergleichsweise unpolare Verbindungen verstanden, die z.b. durch organische Lösungsmittel (in der Regel Hexan oder Chloroform) aus biologischen Proben extrahiert werden können. Lipide unterscheiden sich also von den meisten anderen Verbindungen dadurch, daß sie hydrophob bzw. lipophil ("fettliebend") sind. Eine Übersicht der natürlich vorkommenden Lipide zeigt Abb. 1: Abb. 1: Übersicht über die natürlich vorkommenden Lipide. Unter Lipiden werden in dem Schema ganz generell hydrophobe Verbindungen verstanden. Bitte beachten Sie die große Variationsbreite der Lipide. 2

27 Biophysikalische Chemie (WS 2013/2014) - MS II Wir werden uns im folgenden ganz überwiegend für die sogenannten "Phospholipide" (PL) und hier wiederum für die Glycerophospholipide interessieren. Diese Verbindungen machen zwar im Gegensatz zu den klassischen Speicherfetten, d.h. den Triacylglycerolen (TAG) und auch dem Cholesterol nur einen mengenmäßig sehr geringen Anteil der Lipide im Organismus aus, besitzen aber dennoch überragende Bedeutung. So sind sie aufgrund ihres amphiphilen Charakters (sie besitzen einen polaren und einen apolaren Anteil) z.b. wesentlich am Aufbau von biologischen (Zell)-Membranen beteiligt. Darüber hinaus spielen Phospholipide oder davon abgeleitete Verbindungen eine große Rolle als "second messenger Moleküle" bei der Signaltransduktion. Die Strukturen der wichtigsten Glycerophospholipide sind in Abb. 2 dargestellt: Abb. 2: Übersicht über die wichtigsten Klassen von Glycerophospholipiden. Dabei unterscheidet man in der Regel zwischen neutralen (PE und PC) und sauren Phospholipiden, d.h. Verbindungen, die bei annähernd neutralem ph-wert (das Blut des gesunden Menschen besitzt einen ph-wert von ca. 7.4) eine negative Ladung besitzen (PA, PS, PG, PI). Die Lipidzusammensetzung schwankt je nach Zell- oder Gewebetyp ganz beträchtlich. Jedoch kann davon ausgegangen werden, daß PC in den meisten biologischen Gewebe den größten Teil der PL ausmacht [1]. Der in den Phospholipiden enthaltene Fettsäurerest kann in weiten Grenzen variieren, wobei sowohl die Kettenlänge, d.h. die Zahl der C-Atome als auch der Gehalt an Doppelbindungen (Sättigungsgrad) stark schwanken. Da die Synthese der PL jedoch immer aus Acetyl-Coenzym A erfolgt, besitzen alle physiologisch relevanten Phospholipide immer Fettsäurereste mit einer geraden Anzahl von C-Atomen. Einen Überblick über die wichtigsten Fettsäuren gibt Tab. 1: 3

28 Biophysikalische Chemie (WS 2013/2014) - MS II Tab. 1: Übersicht über die wichtigsten, physiologisch relevanten Fettsäuren, die Position der Doppelbindungen, ihr Trivialname und Molekulargewicht. Die vollständige und eindeutige Bezeichnung eines Phospholipids lautet z.b. 1-Stearoyl-2- linoleoyl-sn-phosphatidylcholin. Zur Abkürzung verwendet man hier in der Regel auch Bezeichnungen wie "SLPC" oder "PC 18:0/18:2". Die verwendeten Zahlen geben hierbei die Zahl der C-Atome bzw. die Zahl der Doppelbindungen (hinter dem Doppelpunkt) an. Natürlich vorkommende Phospholipide besitzen in 1-Position in der Regel immer einen vollständig gesättigten Fettsäurerest, während sich in 2-Position normalerweise eine ungesättigte Fettsäure befindet. Von dieser Faustregel wollen wir im folgenden stets ausgehen, da mittels Massenspektrometrie (in der Regel) lediglich eine Unterscheidung hinsichtlich des Molekulargewichtes, aber nicht der entsprechenden Position eines bestimmten Fettsäurerestes möglich ist (s. unten) [3]. 2. Lipidanalytik Die bei Lipiden etablierten Prozeduren sind - im Vergleich etwa zu den Proteinen - weit weniger genau definiert bzw. standardisiert [4]. Dennoch lassen sich auch hier unterschiedliche Schritte eindeutig unterscheiden: 2.1. Extraktion der Lipide In der Regel werden die Lipide zunächst aus den entsprechenden Köperflüssigkeiten (z.b. Blutplasma) oder Geweben (z.b. Leber) durch Anwendung organischer Lösungsmittel extrahiert, d.h. von den polareren Verbindungen wie z.b. Proteinen oder Kohlenhydraten abgetrennt. Dazu werden Gemische organischer Lösungsmittel wie z.b. Chloro- 4

29 Biophysikalische Chemie (WS 2013/2014) - MS II form/methanol oder Hexan/Isopropanol eingesetzt. Am weitesten verbreitet ist dabei das System CHCl 3 /CH 3 OH: Chloroform ist mit Wasser nicht mischbar, wodurch sich ein 2- Phasensystem bildet (Abb. 3): In der unteren, organischen Physe sammeln sich die Lipide, während in der oberen, wäßrigen Phase (+CH 3 OH) die polareren Moleküle wie auch ein Großteil der Ionen verbleiben. Abb. 3: Schematische Darstellung der Extraktion von Lipiden aus biologischen Materialien. Bitte beachten Sie: CHCl 3 hat eine größere Dichte als Wasser und findet sich deshalb immer "unten"! Aufgrund seiner Polarität ist das Methanol überwiegend in der H 2 O-Phase Trennung der erhaltenen Lipide in die einzelnen Unterklassen Für die meisten analytischen Anwendungen ist es notwendig die in dem erhaltenen Lipid- Rohextrakt vorhandenen Lipide in die einzelnen Klassen aufzutrennen, d.h. den Extrakt zu "fraktionieren". Dazu werden in der Regel chromatographische Verfahren wie z.b. die Dünnschichtchromatographie (TLC, "Thin-layer chromatography") [5] oder die Säulenchromatographie [3] eingesetzt. Die optimale Trennmethodik zu finden setzt hier große Erfahrung voraus und hängt in entscheidendem Maße von der Art des Lipidgemisches ab. Da wir lediglich die TLC einsetzen werden, soll nur auf dieses Verfahren näher eingegangen werden: Zur TLC werden in aller Regel mit Kieselgel beschichtete Kunststoff,- Aluminium,- oder Glasplatten als stationäre Phase verwendet. Die zu analysierenden Lipide werden in einem möglichst leicht flüchtigen, organischen Lösungsmittel wie z.b. Chloroform oder Hexan gelöst und anschließend mit einer Mikroliterspritze auf einer vorher markierten Linie auf die TLC-Platte aufgebracht. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wird die so vorbereitete Platte in eine mit "Laufmittel" gesättigte Kammer gebracht. Steht die Platte in Kontakt mit dem Laufmittel, so beginnt das Laufmittel aufgrund der Kapillarkräfte in der Kieselgelschicht horizontal ("nach oben") zu wandern. Dabei werden die einzelnen Komponenten des zu trennenden Lipidgemisches entsprechend ihrer Affinität zur stationären Phase unterschiedlich stark vom Laufmittel "mitgenommen". Dies führt dazu, daß unpolare Lipide (z.b. Triacylglycerole) unter identischen Bedingungen wesentlich weiter wandern als die viel polareren Phosphatidylcholine. Hat die Laufmittelfront fast den oberen Rand der Platte erreicht, wird die Chromatographie abgebrochen. Nach dem Trocknen der Platte werden die (farblosen) Lipide durch Besprühen mit einem Farbstoff sichtbar gemacht. Wir wollen dazu den Farbstoff Primulin (Strukturformel in Abb. 4) einsetzen. Dieser Farbstoff bindet nicht-kovalent an die unpolaren 5

30 Biophysikalische Chemie (WS 2013/2014) - MS II Reste von Lipiden, die anschließend unter UV-Licht sichtbar gemacht werden können (λ max der Emission ~ 365 nm) [6]. Abb. 4: Strukturformel des Fluoreszenzfarbstoffes "Primulin" Der besondere Vorteil dieses Farbstoffes liegt darin, daß er bei Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels wieder ohne Zerstörung des Lipids abgelöst werden kann. Somit können die einzelnen Lipidklassen nach ihrer Trennung mittels TLC unmittelbar für die Massenspektrometrie verwendet werden. Ein wichtiger Begriff bei der TLC ist der sogen. "R f -Wert" ("ratio of fronts"), der zur Charakterisierung der einzelnen Fraktionen verwendet wird. Darunter versteht man den Quotienten aus der zurückgelegten Strecke der Substanz und der Strecke des Laufmittels (vgl. Abb. 5): Abb. 5: Illustration zur Berechnung des R f -Wertes anhand einer schematisierten TLC-Platte 2.3. Quantitative Bestimmung der Phospholipide Hat man die einzelnen PL-Klassen voneinander getrennt, so erfolgt in der Regel eine Konzentrationsbestimmung der PL in den einzelnen Fraktionen. Der klassische Weg ist hier die Bestimmung des Phosphatgehaltes, der über biochemische Techniken sehr präzise und sensitiv erfolgen kann [7]. Dazu wird das entsprechende PL zunächst durch oxidierende Säuren vollständig in Phosphat überführt und dieses anschließend quantitativ bestimmt. Dann gilt: 1 Phosphat = 1 Phospholipidmolekül. Natürlich ist auch die sogen. "densitometrische" Auswertung der TLC-Platten direkt möglich. Dabei wird die Platte "eingescant" und digitalisiert. Die Quantifizierung erfolgt dann über die Intensitäten der einzelnen "Flecke". 6

31 Biophysikalische Chemie (WS 2013/2014) - MS II Mit den bislang genannten Verfahren lassen sich zwar die einzelnen PL-Klassen quantitativ bestimmen, allerdings ist eine Bestimmung der Fettsäurezusammensetzung nur unter sehr großen Mühen möglich. In diesem Zusammenhang hat sich die Etablierung geeigneter massenspektrometrischer Techniken als außerordentlich hilfreich erwiesen. Die Massenspektrometrie ist außerdem eine extrem sensitive Technik und ermöglicht es mit nur sehr geringen Materialmengen auszukommen [8]. 3. Massenspektrometrische Lipidanalytik Die Massenspektrometrie (MS) ist ein vergleichsweise altes analytisches Verfahren [8] und wurde bereits gegen Anfang des 20. Jahrhunderts entwickelt. Bei der MS wird die Masse von Ionen bestimmt. Dabei lassen sich generell zwei Schritte, die eigentliche Erzeugung von Ionen in der sogen. Ionenquelle und ihre anschließende Trennung bzw. die Detektion voneinander unterscheiden. Die klassische Methode zur Generierung von Ionen ist der Beschuß der (zuvor verdampften) Probe mit Elektronen (Electron Impact, EI) in der Gasphase (Elektronenstoßionisation). Allerdings ist diese Technik durch zwei Randbedingungen erheblich limitiert, da (a) die Substanz ohne Zersetzung zu verdampfen sein muß und (b) die gebildeten Ionen eine genügende Stabilität aufweisen müssen, um den Detektor erreichen zu können. Dabei werden - wenn die notwendige Ionisierungsenergie überschritten wird - Elektronen aus dem Analytmolekül "herausgeschlagen" und es entstehen positiv geladene Radikalkationen, die über ein ungepaartes Elektron verfügen. Da bewegte elektrische Ladungen in einem Magnetfeld abgelenkt werden, kann auf diese Weise das entsprechende Molekulargewicht bestimmt werden. Eine schematisierte Darstellung eines "klassischen" Massenspektrometers zeigt Abb. 6: Abb. 6: Typische Anordnung bei der "klassischen" MS mit Elektronenstoß-Ionisation und Detektion der gebildeten Ionen in einem Magnetfeld. 7

32 Biophysikalische Chemie (WS 2013/2014) - MS II Diese Art der MS wird auch heute noch eingesetzt (insbesondere in Kombination mit der Gaschromatographie (GC)), da hier die Ionenausbeute im wesentlichen durch die Ionisierungsenergie bestimmter funktioneller Gruppen gegeben ist: Da z.b. die Ionisierungsenergie von Fettsäuren durch die Carboxylgruppe bestimmt ist und diese in allen Fettsäuren identisch ist, können Fettsäuren mittels EI-MS quantitativ bestimmt werden. Dies ist ein wichtiger Unterschied zu Techniken wie z.b. ESI oder MALDI, da hier die Ionenausbeute mit der Azidität oder Basizität der einzelnen Verbindungen (in einem Gemsich) gewichtet ist. Die zugrunde liegenden physikalischen Gesetzmäßigkeiten lassen sich wie folgt wiedergeben: a) Elektrische Energie = Kinetische Energie: E z = Ladungszahl Elementarladung 2 2 elek = Ekin v = m v z U = 2 b) Kraft im Magnetfeld = Zentripetalkraft: 2 z U m m v F = B z v = r 2 B z r v = m v 2 B = 2 z m 2 2 r 2 Gleichsetzen : B 2 z m 2 2 r 2 = 2 z U m 2 2 B z r m = 2 U z m 2 U = 2 B r m B r = z 2 U Bestimmt wird bei der MS also immer das Masse/Ladungs-(m/z)-Verhältnis. Geht man davon aus, daß das Molekül nur eine einzige Ladung besitzt, dann entspricht dieses Verhältnis genau dem Molekulargewicht. Dabei ist es jedoch wichtig mit den Atommassen und nicht etwa mit den Isotopenmassen zu rechnen: 8

33 Biophysikalische Chemie (WS 2013/2014) - MS II Tab. 2: Atomgewichte und mittlere Atomgewichte verschiedener, physiologisch relevanter Elemente und ihrer verschiedenen Isotope Mit dem genannten Verfahren sind jedoch nur Moleküle zu charakterisieren, die über eine ausreichende Flüchtigkeit verfügen und die ohne Zersetzung verdampft werden können. Dies machte die MS bis vor ca. 20 Jahren für die Analytik der meisten biologisch relevanten Moleküle ungeeignet. Erst Ende der 80er Jahre des 20. Jahrhunderts gelang es sogen. "Soft-Ionization"-Techniken zu etablieren, die diese Nachteile ausgleichen konnten. Von den beiden wichtigsten Verfahren, der "electrospray" (ESI) und der "MALDI"-Technik werden wir hier ausschließlich das MALDI-Verfahren zur Analytik von Lipiden einsetzen. Es soll noch darauf hingewiesen werden, daß sowohl die Erfindung von ESI wie auch von MALDI im Jahre 2002 mit dem Nobelpreis für Chemie geehrt wurde. 4. Was ist MALDI-TOF MS? MALDI-TOF MS ist die Abkürzung für "matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight Massenspektrometrie" und wird heute - insbesondere für die Analytik von Proteinen - sehr häufig eingesetzt [9]. Das Verfahren nutzt einen Laser zur Verdampfung der Probe. Dabei werden vor allem Stickstoff-Laser eingesetzt, da sie relativ kostengünstig sind und im Betrieb recht reibungslos arbeiten. Diese Laser emittieren bei λ = 337 nm. Bei weitem nicht alle Proben absorbieren jedoch auch bei dieser Wellenlänge. Deshalb hat man 9

34 Biophysikalische Chemie (WS 2013/2014) - MS II sich folgenden "Trick" einfallen lassen: Man setzt der zu untersuchenden Probe eine geeignete "Matrix" zu. Dies ist ein (in der Regel kleines, organisches) Molekül, das bei der angegebenen Wellenlänge die Energie des Lasers absorbiert. Dadurch wird die Probe "heiß" und verdampft. Analytmoleküle werden dabei "mitgerissen". Eine sehr vereinfachte Skizze des MALDI-Prozesses zeigt Abb. 7: Abb. 7: Schematische Darstellung der Prozesse bei der MALDI-TOF MS (Ionen-erzeugung und Detektion) Durch Stöße zwischen der zu untersuchenden Substanz und der Matrix bzw. einem zugesetzten Hilfsmedium (z.b. einer organischen Säure) bzw. von vorneherein enthaltenen Ionen kommt es zur Bildung von Ionen, die zunächst in einem elektrischen Feld beschleunigt werden und anschließend in einem feldfreien Raum sich selbst überlassen werden. Dabei erfolgt eine Trennung gemäß des m/z-verhältnisses: Leichte Ionen erreichen den Detektor schneller als schwerere und können auf diese Weise getrennt werden. Da die Massentrennung sehr wesentlich von der freien Flugstrecke abhängig ist, erreicht man eine höhere Massenauflösung durch Verlängerung der Flugstrecke. Um dennoch möglichst kleine Geräte konstruieren zu können, wird eine spezieller "Umlenkspiegel" (Reflektor-Detektor) verwendet, der die Flugstrecke verlängert. In Abb. 8 ist das Positiv-Ionen MALDI-TOF-Massenspektrum von 1,2-Dipalmitoylphosphatidylcholin dargestellt, um einen Eindruck zu vermitteln wie Massenspektren von Lipiden aussehen und wie sie interpretiert werden müssen: 10

35 Biophysikalische Chemie (WS 2013/2014) - MS II Abb. 8: Positiv-Ionen MALDI-TOF MS von DPPC (PC 2 16:0). Das Spektrum wurde mit einem µg Lipid und DHB als Matrix aufgenommen. Alle Peaks sind entsprechend des m/z- Verhältnisses gekennzeichnet. Die charakteristische Kopfgruppe von PC wie auch die Struktur von DHB sind ebenfalls gezeigt. "Th" ist die Abkürzung für "Thompson", die Einheit des m/z-verhältnisses. Das Molekulargewicht dieses Lipids im neutralen Zustand beträgt g/mol. Man erkennt 3 deutlich voneinander getrennte Peakgruppen, wobei das intensivste Signal jeweils bei m/z = 734.6, bzw liegt. Dieses intensivste Signal entspricht der Verbindung, die ausschließlich die jeweils häufigsten Isotope enthält ( 1 H, 12 C, 14 N, 16 O, 23 Na und 31 P), während der Peak im Abstand von einem Dalton ein schwereres Isotop (wahrscheinlich 13 C aufgrund seiner höchsten natürlichen Häufigkeit), der Peak im Abstand 2 Da zwei schwerere Isotope usw., enthält. Zur Vereinfachung sollen hier nur die jeweils intensivsten Peaks betrachtet werden. Diese Peaks entsprechen der Anlagerung unterschiedlicher Kationen, wodurch einfach geladene DPPC-Addukte mit charakteristischen Massendifferenzen im Vergleich zum neutralen DPPC entstehen. Die Anlagerung eines Protons entspricht einer Massendifferenz von 1 Da, die eines Natrium-Ions 23 Da und die Anlagerung eines Kalium-Ions schließlich 39 Da. Die Intensität der unterschiedlichen Addukte ist im wesentlichen durch den Kationen-Gehalt der verwendeten Lösungen bestimmt und somit gewissen Schwankungen unterworfen [10]. Der Peak bei m/z = entspricht schließlich einem sogen. Cluster-Ion aus einem Matrix-Molekül (bei dem zwei Protonen gegen Natrium-Ionen ausgetauscht sind, d.h. MG = 198) und dem Protonaddukt des DPPC. Eine sehr ausführliche Arbeit zum gegenwärtigen Stand der Lipid- bzw. Phospholipidanalytik mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie findet sich in [11]. Ein vergleichbarer Review zur ESI-Problematik hingegen in [12]. 11

36 Biophysikalische Chemie (WS 2013/2014) - MS II B. Experimenteller Teil Folgende Fragen sollen beantwortet werden: 1. Werden alle Lipide mit der gleichen MS-Empfindlichkeit nachgewiesen? 2. Ist die Summe der Spektren der einzelnen Fraktionen gleich dem Gemischspektrum? Bitte beachten Sie bei allen Arbeiten im Labor: Die zur Anwendung kommenden Chemikalien bzw. Lösungsmittel sind gesundheitsschädlich (dies gilt vor allem für Chloroform, das verdächtigt wird krebserregend zu sein!). Vermeiden Sie Berührungen mit ALLEN Chemikalien bzw. Lösungsmitteln. Dies gilt insbesondere für die Augen. Obwohl wir bei allen Experimenten nur mit sehr geringen Mengen an Chemikalien bzw. Lösungsmitteln arbeiten werden, sollten Sie darauf achten, sich den Lösungsmitteldämpfen nur kurz auszusetzen. Das heißt: Bitte schließen Sie die entsprechenden Vorratsflaschen unmittelbar nach Entnahme wieder sorgfältig. Chloroform ist ein "aggressives" Lösungsmittel und darf NICHT in Kunststoffgefäße gefüllt werden! Aus dem gleichen Grund verbietet sich das Pipetieren mit Kunststoff- Pipetten ("Eppendorf-Pipetten"). Verwenden Sie ausschließlich Spritzen aus Glas (sogen. "Hamilton"-Spritzen). 1. Lipidextraktion Untersucht werden sollen (a) eine Avocado, (b) ein Stück Rinderleber und c) ein Eigelb. Zur Entfernung polarer Bestandteile sowie zur Anreicherung der apolaren Bestandteile (Lipide bzw. Phospholipide) ist dazu zunächst eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln erforderlich: Schneiden Sie die Avocado bzw. die Leber in möglichst kleine Stücke, das Eigelb wird homogenisiert. Wägen Sie jeweils ungefähr 0.5 g in ein Reagenzglas mit Schliff ein. Geben Sie 1 ml destilliertes Wasser, 1 ml Chloroform und 1 ml Methanol zu (Extraktion gemäß "Bligh & Dyer") [13]. Vortexen Sie die Proben gründlich (ca. 1 min) lang. 12

37 Biophysikalische Chemie (WS 2013/2014) - MS II Füllen Sie die Probe in ein Zentrifugenröhrchen um und zentrifugieren Sie die Probe (20 C, 2500 U/min, 8 min) um die Phasentrennung zu beschleunigen. Entnehmen Sie mit einer Hamilton-Spritze (vorsichtig!) die untere (CHCl 3 ) Phase und überführen Sie diese in ein anderes Gefäß. 2. Trennung der Lipidextrakte mittels TLC Die Trennung der drei Lipid-Gesamtextrakte in die einzelnen Lipidklassen erfolgt an cm HPTLC-("high performance thin-layer chromatography")-kieselgel 60 Platten. Als "Laufmittel" verwenden Sie ein Gemisch aus Chloroform, Ethanol, Wasser und Triethylamin (30:35:7:35 v/v/v/v). Tragen Sie jeweils ca. 5 µl der drei Lipidextrakte im Abstand von ca. 1 cm vom unteren Rand und im Abstand von ca. 1,2 cm voneinander auf die TLC-Platte auf (Bitte achten Sie darauf, daß Sie die Beschichtung der Platte mit der Spritze nicht beschädigen). Neben den drei Lipidextrakten tragen Sie je 1 µl Stammlösung (10 mg/ml) der folgenden Lipidstandards auf: PC 16:0/18:1 (a), PE 16:0/18:1 (b), und Triacylglycerol (TAG) 3 18:1 (Triolein) (c). Legen Sie die präparierte Platte in die mit dem Laufmittel gefüllte Horizontal-Entwicklungskammer. Die Trennung der Proben ist nach ca. 45 Minuten beendet. Nehmen Sie die Platte aus der Entwicklungskammer und trocknen Sie die Platte mit dem Fön. Besprühen Sie die Platte mit Primulin-Lösung (Direct Yellow 59) in Aceton. Trocknen Sie die Platte. Unter dem UV-Betrachter (366 nm) erkennen Sie an den Stellen, wo der Farbstoff gebunden hat, violette Flecke. Markieren Sie diese Stellen indem Sie die Flecke mit Bleistift umkreisen. Durch Vergleich mit den Standards identifizieren Sie die jeweiligen Fraktionen in den Gewebeproben. Kratzen Sie die Spots von PC und PE des Leber-und Eigelbextraktes mit einem Spatel vorsichtig von der Platte ab und überführen Sie das Kieselgel in ein kleines Glasgefäß. Eluieren Sie die Lipide vom Kieselgel mit einem Gemisch aus 65 µl CHCl 3, 65 µl Methanol und 65 µl 0.9%-iger wässriger NaCl-Lösung. Zentrifugieren Sie die Proben kurz um die Phasentrennung zu beschleunigen (5 Minuten bei 3500 U/min). Alle erhaltenen Proben werden in der Vakuumzentrifuge "Speed-Vak" zur Trockne eingedampft. 13

38 Biophysikalische Chemie (WS 2013/2014) - MS II 3. MALDI Präparation Als Matrix für die MALDI-TOF MS wird 2,5-Dihydroxybenzosäure (DHB) verwendet. Stellen Sie sich bitte eine 0.5 M (77.06 mg/ml) Lösung von DHB in Methanol (CH 3 OH) her. Mischen Sie in einem kleinen Glasröhrchen 10 µl der auch bei der TLC als Standard verwendeten Lipidlösungen (1 mg/ml) mit 10 µl der Matrix-Lösung und mischen Sie sorgfältig (Vortexer). Tragen Sie auch die drei Lipid-Gesamtextrakte sowie die nach der Trennung erhaltenen Fraktionen auf. Probe Standard PC Standard PE Standard Triolein Gesamtextrakt Leber Gesamtextrakt Avocado Gesamtextrakt Eigelb PE-Fraktion Leber PC-Fraktion Leber PE-Fraktion Eigelb PC-Fraktion Eigelb Position auf Target 4. Durchführung der MALDI-TOF MS Nehmen Sie zunächst die Spektren der Standardlipide (Detektionsmodus: Positiv Ionen) auf. Vergleich Sie die Anzahl der erhaltenen Peaks der einzelnen Verbindungen. Was fällt Ihnen beim Vergleich von PE/PC bzw. TAG/PC auf? Messen Sie nun die Gesamtlipidextrakte der Avocado, der Leber sowie des Eigelbs. Können Sie einzelne Peaks zuordnen? Detektieren Sie PE und PC (in der Leber und im Eigelb) mit vergleichbarer Empfindlichkeit? Betrachten Sie schließlich die Spektren der isolierten Fraktionen des Leber- und des Eigelbextraktes. Geben Sie die Fettsäurezusammensetzung von PC und PE durch Vergleich mit den bereitgestellten Massentabellen an. 14

39 Biophysikalische Chemie (WS 2013/2014) - MS II Peakzuordnung für die PE-Fraktion: Verbindung m/z (M + H + ) m/z (M + Na + ) m/z (M - H Na + ) PE 16:0;18: PE 18:0;18: PE 16:0;20: PE 18:0;20: PE 16:0;22: PE 18:0;22: Peakzuordnung für die PC-Fraktion: Verbindung m/z (M + H + ) m/z (M + Na + ) PC16:0;16: PC 16:0;18: PC 16:0;18: PC 16:0;18: PC 16:0;20: PC 18:0;18: PC 18:0;18: PC 18:0;18: PC16:0;22: PC 18:0;20: PC 18:0;22: Peakzuordnung für die TAG-Fraktion: Verbindung m/z (M + Na + ) TAG 48: TAG 50: TAG 50: TAG 50: TAG 52: TAG 52: TAG 52: TAG 54: TAG 54: TAG 54:

40 Biophysikalische Chemie (WS 2013/2014) - MS II Literatur: [1] Stryer, L.: Biochemie, Vieweg, Braunschweig, [2] Libby, P.: Ateriosklerose als Entzündung. Spektrum der Wissenschaft. 2002, Heft 7, [3] Lottspeich, F., Zorbas, H.: Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, [4] [5] Touchstone; J.C.: Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. J. Chromatogr. B 1995, 671: [6] White, T., Bursten, S., Frederighi, D., Lewis, R.A., Nudelman, E.: High-resolution separation and quantification of neutral lipid and phospholipid species in mammalian cells and sera by multi-one-dimensional thin-layer chromatography. Anal. Biochem. 1998, 10: [7] Chen, P. S., Toribara, T. Y., Wanner, H.: Microdetermination of phosphorus. Anal. Chem. 1956, 11: [8] Hesse, M., Meier, H., Zeeh, B.: Spektroskopische Methoden in der Organischen Chemie, Thieme, Stuttgart, [9] Schiller, J., Arnold, K.: Mass spectrometry in structural biology. In: Encyclopedia of Analytical Chemistry (ed. by Meyers, R.A.), John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 2000, [10] Schiller, J., Arnhold, J., Benard, S., Müller, M., Reichl, S., Arnold, K.: Lipid analysis by matrix-assisted-laser desorption and ionization mass spectrometry (MALDI-TOF- MS) - A methodological approach. Anal. Biochem. 1999, 267: [11] Schiller, J., Süß, R., Arnhold, J., Fuchs, B., Leßig, J., Müller, M., Petković, M., Zschörnig, O., Arnold, K.: Matrix-assisted laser desorption and ionization time-offlight (MALDI-TOF) mass spectrometry in lipid and phospholipid research. Progr. Lipid Res. 2004, 43: [12] Pulfer, M., Murphy, R.C.: Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrom. Rev. 2003, 22: [13] Bligh, E.G., Dyer, W.J.: A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 1959, 3:

41 NMR I

42 Praktikum Strukturanalytik Biochemiker Teil: Strukturaufklärung/-bestätigung mittels NMR- Spektroskopie - Charakterisierung einer Substanz durch Formel; 2 Arten: - Summenformel: quant. u. qual. Zusammensetzung einer Verbindung - Strukturformel - Für Struktur Kriterium Isomerie entscheidend (Konstitution, Konfiguration, Konformation) - Voraussetzung für Strukturuntersuchung: Reinheit der Substanz - Reinigungsoperationen: u.a. Destillation, Umkristallisation, Sublimation - Chromatographische Methoden (DC, GC, SC, HPLC) Früher: Strukturaufklärung auf chemischem Wege: - Beurteilung der Substanz nach äußerer Erscheinung - Vorproben (Bestimmung phys. Konstanten) - Nachweisreaktionen funktioneller Gruppen - Identifizierung über Derivate - Unabhängige Synthese Heute: Strukturbestimmung mit physikalischen Methoden (mehr Informationen mit geringerem Zeitaufwand) wesentliche Methoden sind u.a.: UV/Vis-Spektroskopie, IR-Spektroskopie, NMR- Spektroskopie, Massenspektrometrie besondere Bedeutung kommt dabei heute NMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie zu Die NMR-Spektroskopie ist die einzige Methode zur Strukturbestimmung, mit deren Hilfe sowohl Aussagen zu Konstitution als auch Konfiguration und Konformation gemacht werden können. Ablauf des NMR-Praktikums: Jede Praktikumsgruppe wählt aus einem Angebot von Wirk- und Naturstoffen eine Verbindung aus, von der die NMR-Spektren (mindestens 1 H und 13 C; häufig dazu APT und H,H-COSY; seltener auch HSQC und HMBC) aufgenommen und interpretiert werden. Während der eigentlichen Messung erfolgt eine Erläuterung und Vorführung der apparativen Ausstattung, die Charakterisierung der von den Studenten ausgewählten Substanz im chemischen, biochemischen und pharmakologischen Zusammenhang und die Berechnung der Spektren mit der entsprechenden Software (ChemOffice) sowie die Suche in Datenbanken (SciFinder; SDBS).

43 Angebotsliste von Wirkstoffen für den praktischen Teil: Acetylsalicylsäure Paracetamol Ibuprofen Thalidomid Isoprochin Coffein Theophyllin Sulfadiazin Sulfacetamid Trimethoprim Lidocain Indometacin Boxonal Chlorephedrin Atropinsulfat Erythromycin Andererseits kann aber bei Bedarf auch aus einem breiten Angebot von Naturstoffen (Terpene, Steroide, Flavonoide etc.) ausgewählt werden.

44 NMR II

45 Praktikum Strukturanalytik Bachelorstudiengang Biochemie Nuclear Magnetic Resonance II (NMR-Bildgebung) Klinik und Poliklinik für Diagnostische und Interventionelle Radiologie Universitätsklinikum Leipzig AöR, Liebigstr. 20 (Operatives Zentrum), Leipzig Grundlagen Kernmagnetische Resonanz Kernspin und magnetisches Moment Magnetisches Moment im äußeren Magnetfeld: Larmorpräzession Kernspin ½: Wasserstoff Energieniveaus und Besetzungszahlen Spin-Ensemble: Longitudinal- und Transversalmagnetisierung Detektion des NMR-Signals Hochfrequenz (HF)-Anregung: 90 -Puls Transversale und longitudinale Relaxation Relaxationszeiten biologischer Gewebe: T1 und T2 NMR-Experiment: Spin-Echo Experimentelle Parameter: Echozeit (TE) und Repetitionszeit (TR) Bildkontrast: T1-Wichtung, T2-Wichtung, Protonendichte-Wichtung Praktischer Teil: Klinisches 1,5-Tesla Ganzkörper-System Sicherheitsaspekte HF-Kabine und Kontrollraum Systemaufbau Magnetfelder: Grundfeld, Anregung, Gradienten, Abschirmung, Homogenisierung (Shim) Sende- und Empfangsspulen Bedienkonsole und Bedienoberfläche MR-Protokolle und Pulssequenzen Spin-Echo-Sequenz und grundlegende Messparameter Ablauf einer MR-Untersuchung Patientenvorbereitung und Spulenanbringung Aufnahme der Bilddaten Betrachtung und Bewertung der MR-Bilder Besonderheiten der NMR-Bildgebung (MR-Tomographie) Anwendungsbeispiele Kontakt: (0341)

46 IR

47 Instrumentelle Analytik IR Spektroskopie 1. Arbeiten Sie mit dem Assistenten das Tutorium PERKIN ELMER Infrared Spectroscopy and References durch: Abschnitt 1: Introduction Definition of Spectroscopy The Nature of Light (u.a. auch bedeutende Persönlichkeiten in der Erforschung der Spectroskopie) Measurement of an Infrared Spectrum (Classische und FT IR Geräte) Abschnitt 2: Theory of IR Spectroscopy Classical Model of a Molecule Quantum Mechanical Model Normal Modes and Group Frequencies Abschnitt 3: Interpretation of Spectra Hexan Dimethylbutan Hexen Heptin Heptylcyanid Toluen Hexanol Hexylamin Heptaldehyd Heptanon Heptansäure Essigsäureethylester Buttersäureanhydrid

48 2. Demonstrationsversuch (durch den Assistenten): Aufnahme eines IR Spektrums (Theophyllin) klassische KBr Pressling Technik ATR Technik 3. Interpretieren Sie 4(vier) IR Spektren aus den IR Spektren folgender Arzneistoffe. Acetylsalicylsäure 4 Amino antipyrin Benzoesäure Coffein (als Beispielauswertung) Nicotin Paracetamol Phenacetin Phenytoin Theophyllin Theobromin Weisen Sie dabei auf besonders charakteristische Banden hin. Orientieren Sie sich dabei am Beispiel des Coffeins

49 EPR

50 EPR strukturanalytik: epr praktikum 1 Strukturanalytik: EPR 1 Praktikum Die Elektronenspinresonanz ist ein Messverfahren zur Untersuchung von paramagnetischen Zentren in Materie. Sie wird in der Physik, Chemie, Biologie und vielen angrenzenden Bereichen zur Stukturaufklärung eingesetzt. Für biochemische Anwendungen sind beispielsweise Entfernungsverteilungen zwischen paramagnetischen Zentren relevant (Abb. 1). Diese können im Bereich von 1,8 bis 6 nm in Membranproteinen und bis zu 10 nm in deuterierten löslichen Proteinen mit der sog. DEER-Technik untersucht werden. Die Anzahl von paramagnetischen Zentren und deren relative Orientierung ist damit charakterisierbar. 2 DEER setzt keine Kristallisation voraus und ist nicht im Hinblick auf die Größe der Proteine oder Proteinkomplexe beschränkt. Diamagnetische Proteine können durch seitenorientierende Spinlabels untersucht werden. 3 Dieses Praktikum wird Ihnen einen Überblick über die verschiedenen EPR-Messtechniken und ihren Einsatz in biochemischen Untersuchungen geben. Sie lernen ein Messverfahren der EPR- Spektroskopie praktisch kennen und charakterisieren Proben in verschiedenen Konzentrationen und Lösungsmitteln nach den g- und A-Werten. 1 EPR engl. Electron Paramagnetic Resonance, auch ESR Electron Spin Resonance Abbildung 1: Proteinvermessung mit Spinlabels. Aus 2 Razzaghi, S., Brooks, E. K., Bordignon, E., Hubbell, W. L., Yulikov, M., Jeschke, G., ChemBioChem 2013, 14, 14, Jeschke, G., Annual review of physical chemistry 2012, 63, 419 Grundlagen der EPR-Spektroskopie Die EPR ist eine relativ alte Messmethode, deren theoretische Beschreibung mit dem berühmten Stern-Gerlach-Experiment von 1921 zusammenhängt. Mit Etablierung der Radar- und Funk-Bauteilverwandten Röhrentechnik wurde bereits 1944 an der U Kasan durch J. K. Sawoiski die heute bekannte Form der sog. CW-EPR 4 eingeführt. Grundlage ist die Aufspaltung der Zeeman-Energieniveaus eines paramagnetischen Stoffes unter dem Einfluss eines Magnetfeldes. Mit fortschreitender elektronischer Entwicklung wurden auch in der EPR die aus der NMR bekannten, vielfältigen gepulsten Messungen eingeführt und finden heute insbesondere für die Biochemie breite Verwendung. Im Gegensatz zur NMR ist in der EPR die CW-Methode noch immer weit verbreitet und liefert wichtige Forschungsergebnisse. Die folgenden Kapitel sollen in beide Techniken einführen. Elektronen-Zeeman-Effekt: CW-EPR Ungepaarte Elektronen, wie sie in organischen Radikalen, Farbzentren in Kristallen, Übergangsmetallen und weiteren Stoffen vorkommen, sind paramagnetische Zentren, die sich unter dem Einfluss eines Magnetfeldes B gemäß ihres Elektronenspins ausrichten. Systeme mit einem ungepaarten Elektron können hier die Energien von Abbildung 2: J. K. Sawoiski ( ), russ. Physiker 4 CW continous wave, das herkömmliche Messverfahren mit kontinuierlich eingestrahlter Mikrowelle E m S = E m S = 1 2 B Abbildung 3: Ein aufgezeichnetes EPR- Spektrum der Zeeman-Aufspaltung der Elektronenspin-Energieniveaus m S ± 1 2 in Abhängigkeit des Magnetfeldes B. EPR / MQF, Institut für Experimentalphysik II, Universität Leipzig