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1 (19) *DE A * (10) DE A (12) Offenlegungsschrift (21) Aktenzeichen: (22) Anmeldetag: (43) Offenlegungstag: (66) Innere Priorität: (71) Anmelder: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Halle, DE (51) Int Cl.: A61K 36/064 ( ) A61P 1/12 ( ) A23L 33/14 ( ) A23K 10/18 ( ) (72) Erfinder: Urubschurov, Vladimir, Bad Doberan, DE; Zeyner, Annette, Leipzig, DE; Souffrant, Wolfgang-Bernhard, Rostock, DE; Büsing, Kirsten, Schwaan, DE Prüfungsantrag gemäß 44 PatG ist gestellt. Die folgenden Angaben sind den vom Anmelder eingereichten Unterlagen entnommen. (54) Bezeichnung: Verwendung der Hefe Kazachstania sloofiae zur Verbesserung der Darmgesundheit von Schweinen (57) Hauptanspruch: Verwendung der Hefe Kazachstania slooffiae als Probiotikum zur Verbesserung der Darmgesundheit.

2 Beschreibung [0001] Der Gastrointestinaltrakt der Schweine repräsentiert ein komplexes Mikroökosystem, das von verschiedenen Mikroorganismen besiedelt wird, die eine wichtige Rolle für die Gesundheit des Wirtstieres spielen. Die Stoffwechselaktivität der intestinalen Mikrobiota, vor allem der Abbau der für den Wirtsorganismus unverdaulichen, schwerlöslichen Kohlenhydrate zu kurzkettigen Fettsäuren, beeinflusst nicht nur den gesamten Energieumsatz, sondern hat auch positive Effekte auf die Darmschleimhaut (z. B. Zellproliferation) und eine stimulierende Wirkung auf das Immunsystem. Während des Lebens der Tiere verändert sich die Zusammensetzung der mikrobiellen intestinalen Besiedlung. Bis zur Ausbildung einer stabilen mikrobiellen Besiedlung des Verdauungstraktes sind die Jungtiere besonders anfällig gegenüber Krankheiten. Das Absetzen von Ferkeln gilt als eine der kritischsten Phasen in der Schweinehaltung und ist oft mit Stress, sehr häufig Durchfallerkrankungen, welche in unterschiedlichem Ausmaß mit Einschränkungen des Allgemeinbefindens, Futteraufnahmeund Wachstumsdepression sowie erhöhter Sterblichkeit verbunden sind. Diesem Geschehen darf aus rechtlicher Sicht nicht durch die Gabe von Antibiotika als Futterzusatzstoff entgegen gewirkt werden. Alternative Möglichkeiten bestehen zum Beispiel in der Verabfolgung von Probiotika, Prebiotika, Kräutern oder ätherischen Ölen. Derzeit zugelassene probiotische Zusatzstoffe (Tabelle 1) wurden nicht explizit aus dem Darm der Zieltierart gewonnen und provozieren so immer auch Antigen-Antikörper-Reaktionen, welche zunehmend kritisch hinterfragt werden. 2/11

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5 Tabelle 1: Zugelassene Futterzusatzstoffe für Schweine, gemäß Verordnung der Europäischen Kommission (Reg (EC) No 1831/2003. European Union Register of Feed Additives. Edition 217. Appendixes 3e, [0002] Zur Vermeidung oder Milderung von Durchfallerkrankungen ist es wünschenswert darmeigene Mikroorganismen mit einer stabilisierenden Wirkung auf die förderliche Mikrobiota zu unterstützen. Beim Absetzen der Ferkel befinden sich im Schweinedarm mindestens 17 verschiedene Hefearten. Die Besiedelung der im Darm am meisten vorkommenden Hefe Kazachstania slooffiae beginnt mit der Fütterung von Festfutter [1]. Die Zunahme der Darmbesiedelung durch Hefen mit K. slooffiae als der vorherrschenden Art geht einher mit einer signifikanten Zunahme von Lactobacillus und einer Abnahme von Enterobacteriaceae im Kot der abgesetzten Ferkel. Diese Entwicklung ist vorteilhaft in der kritischen Zeit des Absetzens, da sowohl des Anwachsen von Lactobacillus [3] als auch die Abnahme von teilweise pathogenen Escherichia coli Stämmen vorteilhaft für die Darmgesundheit ist. [0003] Aufgabe der Erfindung war es, eine im Schweinedarm endemisch vorkommende Hefe zu isolieren, der ein solches stabilisierendes Potential zukommt. Aufgrund der Dominanz der im Schweinedarm endemisch vorkommenden Hefe K. slooffiae und der Tatsache, dass sie bisher nur aus dem Darm klinisch unauffälliger Tiere isoliert werden konnte und ihre Anzahl dabei positiv mit der Zahl an Lactobacillen im Ferkeldarm korrelierte, wurde die Hefe K. slooffiae für weitere Untersuchungen ausgewählt. Dazu wurde ein Stamm der Hefe isoliert und eingesetzt. Der isolierte Stamm wurde am 7. März 2016 am Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig gemäß Budapester Vertrag unter der Bezeichnung Kazachstania slooffiae MLU-TE-MiBi-Ks-2015/03 hinterlegt und unter der Nummer DSM registriert. [0004] Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, dass die Anzahl K. slooffiae im Kot positiv mit der Konzentration an flüchtigen Fettsäuren (hauptsächlich an Essig-, Propion-, und Buttersäure) und negativ mit dem ph- Wert korreliert. Die flüchtigen Fettsäuren sind die Produkte der enteralen, mikrobiellen Fermentation mit trophischer Wirkung auf die Schleimhautzellen im Dickdarmbereich und dienen außerdem als Energiequelle für den Wirt. Neben einer Vielzahl regulatorischer Eigenschaften weisen die flüchtigen Fettsäuren und der niedrigere ph-wert, welche durch den Anstieg der flüchtigen Fettsäuren bedingt wird, eine protektive Wirkung gegen pathogene Bakterien auf. Durch die orale Gabe der dem Schweinedarm eigenen Hefe K. slooffiae konnte die Mikrobiota in erwünschte Weise derart beeinflusst werden, dass ein die Darmgesundheit förderliches Fermentationsprofil entsteht. In einem Fütterungsversuch konnte unter Praxisbedingungen nachgewiesen werden, dass die tägliche Gabe der endemisch im Schweinedarm vorkommenden Hefe Kazachstania slooffiae einen Effekt auf die Durchfallinzidenz und die Wachstumsleistung von Absetzferkeln hat. [0005] Der Fütterungsversuch wurde vom 18. April 2016 bis zum 30. Juni 2016 in Kostkowice (Polen) in der Experimentalanlage Grodziec Śląski (Experimental Station of National Institute of Animal Production, Grodziec Śląski, Świętoszówka), durchgeführt. Durch die unterschiedlichen Geburtsdaten (Abferkeldaten) der Einzelwürfe ergibt sich der oben genannte Versuchszeitraum, während sich der spezifische Versuchszeitraum für einen Wurf jeweils über sechs Wochen erstreckte. Für den Versuch standen insgesamt 141 Ferkel von 14 verschiedenen Sauen zur Verfügung, welche jeweils aus einer Zweirassenkreuzung hervorgegangen sind. In der Ferkelproduktion wurden drei verschiedene Kreuzungsschemata eingesetzt. 9 Ferkel entstammten der Kreuzung einer Muttersau der Polnischen Landrasse (PL) und einem Eber der PL. 73 der Ferkel gingen aus der Kreuzung von sieben Muttersauen der Rasse Polnisch Large White (LWP) mit einem Eber derselben Rasse hervor. Die verbleibenden 59 Ferkel stammten von einer LWP Muttersau und einem PL Eber ab. Die Verteilung der Tiere auf die jeweiligen Kreuzungsschemata ist Tabelle 2 zu entnehmen. Kreuzung Anzahl gesamt Kontrollgruppe Versuchsgruppe Alle Kreuzungen LWP LWP PL PL /11

6 LWP PL Sauen Börgen Tabelle 2; Verteilung der Tiere auf die Versuchs- und Kontrollgruppe unter Berücksichtigung des genetischen Hintergrundes (LWP = Polnisch Large White; PL = Polnische Landrasse) [0006] Beginnend am Absetztag wurden die Ferkel je nach ihrer Gruppenzugehörigkeit entweder mit einem Placebo (Gruppe 1 = Kontrollgruppe, KG), oder mit lebender Hefe in flüssiger Form (Gruppe 2 = Versuchsgruppe, VG) über eine orale Applikation, supplementiert. Die Dauer der täglichen Supplementierung umfasste fünf Tage. Die Kontrollgruppe erhielt als Placebo täglich 5 ml einer Kochsalzlösung mittels einer Spritze direkt ins Maul. Der Versuchsgruppe wurden über die 5 Tage 7, KBE/5 ml (bzw. je Spritze) der Hefe Kazachstania slooffiae verabreicht. [0007] Nach dem Absetzen wurde den Tieren das Futter in mehlförmiger, nicht pelletierter Form dargeboten. Beide Gruppen erhielten ab dem Tag des Absetzens das gleiche Futter. Dem Futter wurden keinerlei Antibiotika, probiotische Mikroorganismen oder Enzyme zugesetzt. Sowohl das Wasser, als auch das Futter standen den Tieren über die gesamte Versuchsperiode ad libitum zur Verfügung. [0008] Jedes Einzeltier wurde über die Versuchsdauer wöchentlich gewogen; beginnend mit dem Tag des Absetzens und an den Tagen 7, 14, 21, 28, 35 und 42 des Versuches (Fig. 1, Fig. 1 und Fig. 3). In diesen wöchentlichen Abständen wurden zudem die durchschnittlichen täglichen Gewichtszunahmen, die Futteraufnahme und die Futterverwertung bestimmt. Täglich erfolgte eine Dokumentation der Anzahl der erkrankten oder verendeten Tiere und der Kotkonsistenz mittels des Fecal consistency score (FCS) [4]. 22 der 141 Ferkel sind während des Versuches verendet, 13 dieser Tiere gehörten der Kontrollgruppe an, die anderen 9 Tiere der Versuchsgruppe. In den ersten beiden Versuchswochen erkrankten die Ferkel der Kontrollgruppe 1,34 häufiger an Durchfall als die Ferkel der Versuchsgruppe (Odds Ratio). In den ersten drei Versuchswochen verstarben mehr Ferkel der Kontroll- als der Versuchsgruppe (n = 13 vs. 9 Ferkel), wobei das Verlustgeschehen in der ersten Versuchswoche, d. h. kurz nach dem Absetzen, besonders ausgeprägt war. Dieses Verlustgeschehen untersetzt die positive Wirkung der Gabe von K. slooffiae in der kritischsten Zeit kurz nach dem Absetzen im Hinblick auf die Etablierung und Vermehrung von K. slooffiae im Ferkeldarm und die damit in Folge verringert auftretenden Durchfallerkrankungen [0009] Im Ergebnis des Praxisversuches konnte gezeigt werden, dass die orale Gabe von K. slooffiae nach dem Absetzen der Ferkel zu einer signifikanten Wachstumsförderung führt (Fig. 4) und die Hefe K. slooffiae als Probiotikum in jeder Form oraler Applikation zur positiven Beeinflussung des gastrointestinalen Mikrobiota mit günstigen Folgewirkungen an Tier und Mensch geeignet ist. Erläuterung der Figuren [0010] Fig. 1: Entwicklung der mittleren Lebendmasse der Absetzferkel beider Gruppen im Beobachtungszeitraum, jeweils getrennt nach Geschlechtern (Tag 0 = Absetzen; Placebo = KG; Hefe = VG) [0011] Fig. 2: Mittlere Lebendmasse der Absetzferkel beider Gruppen im Beobachtungszeitraum (Placebogruppe = KG; Kazachstania slooffiae = VG) [0012] Fig. 3: Mittlere Lebendmassezunahme der Absetzferkel beider Gruppen und Geschlechter im Beobachtungszeitraum (Versuchstag 0 = Absetzen) [0013] Fig. 4: Mittlere Lebendmassezunahme der Absetzferkel beider Gruppen im Beobachtungszeitraum (Versuchstag 0 = Absetzen; Placebo = Versuchsgruppe; Kazachstania slooffiae = Kontrollgruppe) Patentansprüche 1. Verwendung der Hefe Kazachstania slooffiae als Probiotikum zur Verbesserung der Darmgesundheit. 2. Verwendung der Hefe Kazachstania slooffiae nach Anspruch 1 zur Verbesserung der gastroinstestinalen Mikrobiota. 6/11

7 3. Verwendung der Hefe Kazachstania slooffiae nach Anspruch 1 und 2 in jeglicher Form oraler Applikation. 4. Verwendung der Hefe Kazachstania slooffiae nach einem oder mehreren der obigen Ansprüche im medizinischen bereich als Prophylaktikum und/oder Therapeutikum. 5. Verwendung der Hefe Kazachstania slooffiae nach einem oder mehreren der obigen Ansprüche als Medizinalfuttermittel. 6. Verwendung der Hefe Kazachstania slooffiae nach einem oder mehreren der obigen Ansprüche als Diätfuttermittel. 7. Verwendung der Hefe Kazachstania slooffiae nach einem oder mehreren der obigen Ansprüche als Zusatz zu sonstigen Futter- und/oder Lebensmitteln. Es folgen 4 Seiten Zeichnungen 7/11

8 Anhängende Zeichnungen 8/11

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