Diplomarbeit. angefertigt am Institut für Botanik in der Abteilung Pflanzenphysiologie Universität Leipzig vom bis zum

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1 Die lichtabhängige Regulation der Pigmentbiosynthese in Euglena gracilis: Eine Analyse der Bedeutung wechselnder Lichtverhältnisse für eine Alge ohne Xanthophyllzyklus Diplomarbeit angefertigt am Institut für Botanik in der Abteilung Pflanzenphysiologie Universität Leipzig vom bis zum von Astrid Vieler geboren am 05. Dezember 1977 in Meschede

2 The process of living is the process of reacting to stress. Stanley J. Sarnoff

3 Abkürzungsverzeichnis Einleitung Die Ambivalenz des Lichts Photoprotektive Mechanismen... 8 Die Rolle der Xanthophylle in der Photoprotektion... 9 Alternativer Elektronentransport Photoinhibition Die Biosynthese der Carotinoide Der Protagonist: Euglena gracilis Zielsetzung Material und Methode Allgemeines Algen und Anzucht Homokontinuierliche Turbidostatkultur Der Langzeitansatz Bestimmung des Chlorophyllgehaltes Absorptionsspektroskopie PAM-Fluoreszenz Das eingesetzte Meßsystem Der Versuchsablauf Fluoreszenzspektroskopie Die Probenaufbereitung Das benutzte Meßsystem RP-HPLC Probenvorbereitung, Lagerung und Pigmentextraktion Das eingesetzte Trennsystem Qualitativer Pigmentnachweis Pigmentquantifizierung Sauerstoffelektrode Ergebnisse Das Wachstum der autotrophen Turbidostatkulturen im Dauerschwachlicht und in Starklicht-Schwachlichtzyklen... 31

4 3.2. PAM-Fluoreszenz Photochemische Quantenausbeute und photoinhibitorische Fluoreszenzlöschung Tieftemperatur-Fluoreszenzemissionsspektren der Turbidostatkulturen im Starklicht und im Schwachlicht Qualitative und quantitative Analyse der Pigmentausstattung autotropher Euglena gracilis in Abhängigkeit vom Lichtregime Absorptionsspektroskopie Pigmentausstattung autotropher Euglena gracilis im Schwachlicht und im Starklicht Die Pigmentstöchiometrie von Euglena gracilis vor und während der Starklichtversuche Kurzfristige Änderungen der Pigmentstöchiometrie nach sechs Stunden Starklicht Die Änderungen der Pigmentgehalte im Verlauf des Starklichtes und der nachfolgenden Schwachlichtinkubation Diskussion Zur Xanthophyllbiosynthese Die Biosynthese der Carotinoide in Euglena gracilis Die Regulation der Pigmentsynthese in Abhängigkeit vom Licht Ein Vergleich mit Phaeodactylum tricornutum (Bacillariophyceae) Zur ökologischen Bedeutung fluktuierender Lichtverhältnisse für Euglena gracilis Phototaxis statt Xanthophyllzyklus? Fluoreszenzlöschung in den Antenne - Eine langfristige Anpassung? Zusammenfassung und Ausblick Literatur Anhang Euglena-Medium nach Wiessner (1968) Eisen-(III)-Lösung Spurenelement-Lösung A Spurenelement-Lösung B Vitaminlösung A Vitaminlösung B Strukturformeln ausgewählter Carotinoide Und ein herzliches Dankeschön an Eigenständigkeitserklärung... 76

5 Abkürzungsverzeichnis AL aktinische Belichtung Alx Alloxanthin Ax Antheraxanthin βcar -Carotin Car ges Chl a Chl b Chl c Chl ges CHYB CHYE Ddx DMAPP Dtx F 0 Gesamtcarotinoidgehalt Chlorophyll a Chlorophyll b Chlorophyll c Gesamtchlorophyllgehalt -C 3 -Hydroxylase ε-c 3 -Hydroxylase Diadinoxanthin Dimethylallylpyrophosphyt Diatoxanthin minimale (Grund-)Fluoreszenz F Grundfluoreszenz im gequenchten Zustand FE Fluoreszenzemission Fm maximale Fluoreszenz Fm maximale Fluoreszenz im gequenchten Zustand FR Fernrot Fv variable Fluoreszenz Fx Fucoxanthin GA3P Glycerinaldehyd-3-Phosphat GGPP Geranylgeranylpyrophosphat GGPR Geranylgeranylpyrophosphat-Reduktase GGPS Geranylgeranylpyrophosphat-Synthase HL Starklicht I k I max IPI IPP LHC charakteristische Lichtintensität (einer P-I-Kurve) Lichtintensität der maximalen Photosyntheserate Isopentenylpyrophosphat-Isomerase Isopentenylpyrophosphat light harvesting complex, engl. Antennenkomplex

6 LL LYCB LYCE MGDG NPQ Nx PAR PDS P ges P max PSI PSII PSY qe qf qi qm qs ROS RP-HPLC s ω VDE Vx ZDS ZEP Zx Schwachlicht Lycopin--Cyclase Lycopin-ε-Cyclase Monogalactosyldiacylglycerol nichtphotochemisches Quenching Neoxanthin photosynthetic active radiation, photosynthetisch nutzbare Strahlung Phytoendesaturase Gesamtpigmentgehalt maximale Photosyntheserate Photosystem I Photosystem II Phytoensynthase high-energy-state quenching schnell relaxierende Komponente des NPQ in Euglena gracilis photoinhibitorisches Quenching mittelfristig relaxierende Komponente des NPQ in Euglena gracilis langsam relaxierende Komponente des NPQ in Euglena gracilis reactive oxigen species, engl aktive Sauerstoff-Formen reversed phase high pressure liquid chromatography Anfangssteigung der P-I-Kurve Parameter der Peakschärfe einer P-I-Kurve Violaxanthindeepoxidase Violaxanthin ζ-carotindesaturase Zeaxanthinepoxidase Zeaxanthin

7 Einleitung 7 1. Einleitung 1.1. Die Ambivalenz des Lichts Gott sprach: Es werde Licht! Und es ward Licht. (Genesis 1.3). Dieses um 900 v. Chr. niedergeschriebene Zitat vom Anfang der Schöpfungsgeschichte lässt erahnen, wie früh die Menschheit die Abhängigkeit des Lebens auf der Erde vom Licht der Sonne erkannt hat, ohne die Zusammenhänge im Detail begreifen und benennen zu können. Fast dreitausend Jahre später existiert in unseren Köpfen eine sehr distinkte Vorstellung von den biophysikalischen und biochemischen Prozessen der Photosynthese, sowie deren Bedeutung für den Energie- und Stoffhaushalt der Erde. In den Pigment-Protein-Komplexen der Chloroplasten absorbiertes Licht liefert die Energie zur Ladungstrennung im Reaktionszentrum. Der Transport von Elektronen über angeschlossene Redoxsysteme führt zur Bildung eines ph-gradienten über der Thylakoidmembran, der das nötige chemische Potential zur Synthese von ATP aufbaut. Als finaler Elektronen-Akzeptor dient NADP +, das als Reduktionsäquivalent zur Fixierung von anorganischem Kohlenstoffdioxid (CO 2 ) durch den Calvinzyklus genutzt wird. Die durch den Elektronentransport in den Thylakoidmembranen gewonnenen Reduktionsäquivalente werden außerdem zur Nitrat- und Sulfatreduktion eingesetzt. Insgesamt basiert der Stoffwechsel der autotrophen Lebensformen auf der Umwandlung von Lichtenergie in chemische Energie. Somit erscheint es nicht verwunderlich, dass zahlreiche morphogenetische und physiologische Prozesse in autotrophen Organismen der Regulation durch Licht unterworfen sind, insbesondere diejenigen, die mit diesem direkt zusammenhängen. So ist in den Angiospermen, sowie in Euglena gracilis, die Chlorophyllsynthese ein lichtabhängiger Prozess (Schopfer et al.,1999). (Bohne et al., 2002) konnten zeigen, dass auch die Expression der Gene von Enzymen der Carotinoidbiosynthese in Chlamydomonas reinhardtii (Chlorophyceae), nämlich der Phytoensynthase (PSY) und der Phytoendesaturase (PDS) (Kapitel 1.3), durch Licht induzierbar ist. Im Kontrast hierzu kann jedoch ein Lichtüberschuss zum vermehrten Vorkommen verschiedener für die pflanzliche Zelle schädlicher Reaktionen führen. Von Niyogi (Niyogi, 1999; Niyogi, 2000) wurden hier drei hauptsächliche Orte am Photosyntheseapparat beschrieben, die bei Lichtüberschuß aktive Sauerstoff-Formen (ROS, engl. reactive oxygen species) generieren können. Dies sind zum einen die Antennen des Photosystem II (PSII) und das PSII-Reaktionszentrum. Hier kann es durch intersystem-crossing in Chlorophyll- Molekülen zur Bildung relativ langlebiger Triplett-Chlorophylle kommen, die zur Anregung

8 Einleitung 8 von molekularem Sauerstoff in der Lage sind, so dass Singulett-Sauerstoff entsteht. Des weiteren ist das die Photosystem I (PSI)-Akzeptor-Seite. Hier kann, insbesondere bei Mangel an NADP +, alternativ O 2 direkt reduziert werden. Bei dieser Reaktion entsteht zunächst das Superoxid Anion Radikal (O - 2 ), das wiederum zu Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) metabolisiert oder durch die metallkatalysierte Fenton-Reaktion zum Hydroxyl Radikal (OH ) umgesetzt werden kann. Alle genannten reaktiven O 2 -Derivate gehören zur Gruppe der ROS. ROS sind in der Lage sämtliche organischen Moleküle oxidativ zu schädigen. Typische Schäden sind zum Beispiel Lipidperoxidationen in den Thylakoidmembranen oder, in erster Linie durch die auf der stromalen Seite am PSI entstehenden ROS, eine Oxidation der Enzyme der Kohlenstoff-Fixierung Photoprotektive Mechanismen Die Pflanze besitzt verschiedene Mechanismen zur Vermeidung von oxidativem Stress, die an unterschiedlichen Stellen der Lichtreaktion ansetzen (vgl. Abbildung 1.1). Übersichten hierzu bieten die Artikel von (Baroli et al., 2000; Demmig-Adams et al., 1996a; Demmig-Adams et al., 1996b; Gilmore, 1997; Horton et al., 1996; Muller et al., 2001; Niyogi, 1999; Niyogi, 2000). Zunächst kann die Menge der absorbierten Strahlung reguliert werden. In höheren Pflanzen dienen hierzu nastische Bewegungen von Blättern oder anderen Pflanzenteilen oder auch die Bewegung und Ausrichtung von Chloroplasten in den Zellen. Langfristig kann auch die Antennegröße reduziert, also weniger Lichtsammelkomplexe (LHC, engl. light harvesting complex) pro Reaktionszentrum gebildet werden. Ein weiterer regulativer Mechanismus, dessen photoprotektive Eigenschaften in höheren Pflanzen jedoch noch der Prüfung bedürfen, ist durch State1-State2-Transitions beschrieben worden. Für die Grünalge Chlorella fusca dagegen konnte bereits gezeigt werden, dass State- Transitions in der Photoprotektion eine Rolle spielt (Garcia-Mendoza et al., 2002). Eine der Redox-Kontrolle des Plastochinonpools unterworfene Kinase phosphoryliert bei überproportionaler Reduktion der PSII-Akzeptorseite dessen periphere LHC. Diese werden hierdurch vom Reaktionszentrum des PSII abgekoppelt und bedienen unter Umständen stattdessen das PSI Reaktionszentrum mit Anregungsenergie. Dies würde den Elektronendruck am PSII vermindern und der Entstehung von Triplett P680 entgegenwirken.

9 Einleitung 9 Licht Lichtsammlung Anpassung von A ntennengröße und -A usrichtung Photochemie ROS D issipation CO 2 -Fixierung zyklischer e - -Transport C hlororespiration Photorespiration W asser-w asser-k reislauf Photoschäden Nettoschaden A ntioxidantien Reparatur/ Neusynthese Photoinhibition Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der photoprotektiven Mechanismen in Chloroplasten (nach Niyogi, 1999). Die Rolle der Xanthophylle in der Photoprotektion Die dissipative Ableitung überschüssiger Energie in Form von Wärme findet in erster Linie in den Antennen des LHCII und, zu einem geringeren Grad, im PSII-Reaktionszentrum statt und ist abhängig von der Anwesenheit bestimmter Xanthophylle. Im PSII Reaktionszentrum spielen vermutlich auch noch carotinoidunabhängige Rekombinationsprozesse eine Rolle (Richter et al., 1999; Wagner et al., 1996), auf die an dieser Stelle nicht im Detail eingegangen werden soll. Carotinoide können theoretisch aufgrund ihrer Anregungszustände Energie vom angeregten Chlorophyll und vom Triplett-Chlorophyll übernehmen und somit der Entstehung von Triplett-Chlorophyll entweder vorbeugen oder dieses direkt quenchen. Die wichtigsten Carotinoide sind in dieser Hinsicht in höheren Pflanzen das -Carotin im PSII-Reaktionszentrum und das Zeaxanthin in den peripheren Antennen des LHCII, sowie in Gefäßpflanzen und Grünalgen Lutein und in den Bacillariophyceae, Dinophyceae und einigen anderen Algenklassen Diatoxanthin. In den Komponenten des PSI ist die durchschnittliche

10 Einleitung 10 Lebensdauer des angeregten Chlorophylls aufgrund von schnelleren Reaktionszeiten an der Akzeptorseite generell wesentlich kürzer. Somit liegt an diesem Photosystem eine allgemein geringere Wahrscheinlichkeit der Triplett-Chlorophyll-Bildung vor. Es wurde beschrieben, dass im Zusammenhang mit diesem nichtphotochemischen Quenching (NPQ), welches die Wärmedissipation widerspiegelt, der Xanthophyllzyklus eine zentrale Rolle spielt. Beim Xanthophyllzyklus entsteht epoxidfreies Zeaxanthin im Licht in einer zweistufigen Reaktion reversibel durch die Deepoxidierung von Violaxanthin (Diepoxid). Das Monoepoxid Antheraxanthin ist in dieser Reaktionsfolge das Zwischenprodukt. Die Reaktion wird von der Violaxanthin-Deepoxidase (VDE) katalysiert und bei der Umsetzung wird das System der konjugierten Doppelbindungen von neun auf elf erweitert. Das ph-optimum der VDE in höheren Pflanzen liegt bei ph 5,5 (Demmig-Adams et al., 1996a; Demmig-Adams et al., 1996b; Hager et al., 1994; Hieber et al., 2000; Latowski et al., 2002; Yamamoto et al., 1996). Da das Enzym im Lumen der Thylakoide lokalisiert ist, unterliegt es somit der Kontrolle des photosynthetischen Elektronentransportes und dem hierüber aufgebauten ph. Die Gegenreaktion, also die Epoxidierung von Zeaxanthin zu Violaxanthin verläuft zeitgleich an der stromalen Seite der Thylakoidmembranen und wird von der Zeaxanthinepoxidase (ZEP) katalysiert. Das Zusammenspiel dieser beiden Reaktionen, das zu einer Akkumulation von Zeaxanthin im Starklicht und Violaxanthin im Schwachlicht führt, macht den zyklischen Charakter der Reaktionsfolge aus. Neben diesem in Gefäßpflanzen und vielen Grünalgen etablierten Xanthophyllzyklus existiert in vielen Chlorophyll a/c-haltigen Algen ein alternativer Zyklus, wobei Diadinoxanthin (Monoepoxid) im Licht reversibel zu Diatoxanthin umgesetzt wird (Olaizola et al., 1994a; Olaizola et al. 1994b). Hierbei handelt es sich um eine einstufige Reaktion. Die Anwesenheit von Deepoxyxanthophyllen erhöht nachweislich das NPQ, über die zugrundeliegenden Mechanismen der erhöhten Dissipation von Anregungsenergie herrscht dagegen noch Ungewissheit. In der Theorie werden zwei prinzipielle Modelle zur nichtphotochemischen Fluoreszenzlöschung in den Antennen des PSII unterschieden. Zum einen ein direkter Mechanismus in Form eines Singulett-Singulett-Energietransfers vom angeregten Chlorophyll auf das im jeweiligen Xanthophyllzyklus vorkommende Deepoxyxanthophyll (Young et al., 1996). Aufgrund des erweiterten π-elektronen-systems ist bei Deepoxyxanthophyllen das Energieniveau des ersten Singulett-Zustandes (S1) gegenüber den Epoxy-Xanthophyllen erniedrigt. Im sogenannten gear-shift model wurde von Frank (Frank et al., 1996) postuliert, dass der Energiegehalt des angeregten Singulett-Chlorophylls unterhalb des S1-Zustandes von Viola- und Diadinoxanthin und oberhalb des S1-Zustandes von Zea-, Anthera- und

11 Einleitung 11 Diatoxanthin läge. Somit wäre Viola- und Diadinoxanthin klar eine Lichtsammelfunktion zuzuordnen. Beide Pigmente können Anregungsenergie auf Chlorophyll weiterleiten. Zea-, Anthera- und Diatoxanthin dagegen müssen als klassische Quencher gelten, die beim Rückfall in den Grundzustand Wärme abgeben. Allerdings fehlen hier noch eindeutige Ergebnisse zum Energiegehalt der S1-Zustände der Carotinoide, sowie Daten zur Relevanz dieses Mechanismus in-vivo. Horton et al. (1996) schlugen eine indirekte Beteiligung der Deepoxyxanthophylle am NPQ vor und kreierten ein allosterisches Modell (Abbildung 1.2). Nach diesem Modell bewirkt der durch den Elektronentransport hervorgerufene ph zum einen die Protonierung von LHC- Proteinen. Dies führt zu einer Aggregation der LHC, begleitet von einer räumlichen Deepoxidierung V Z Protonierung V V Dissipation Z Z Dissipation V Dissipation Z Dissipation Abbildung 1.2: Allosterisches Modell zur Regulation von qe vereinfacht nach Horton (Horton et al., 1996) Annäherung der gebundenen Pigmente. Der aufgebaute ph führt außerdem zur Aktivierung der VDE und damit zur Synthese von Zeaxanthin. Dieses soll aufgrund seiner planaren Molekülstruktur ebenfalls zu einer sterischen Annäherung der Pigmentprotein-Komplexe beitragen und so die Dissipation von Wärme in den LHCII begünstigen, wohingegen das im Schwachlicht vorhandenen Violaxanthin als Aggregationshemmer gilt. Durch die Aggregation erhöht sich die Wahrscheinlichkeit von Chlorophyll-Chlorophyll-Interaktionen

12 Einleitung 12 oder Chlorophyll-Zeaxanthin-Interaktionen, die zu einem Rückfall der Moleküle in den Grundzustand unter Dissipation der Energie führen. Desweiteren liegen Hinweise darauf vor, dass ein erhöhter Zeaxanthinanteil in den Thylakoidmembranen deren Fluidität senkt und so die Thermostabilität der Photosysteme steigert (Havaux et al., 1993; Tardy et al., 1997). Die hier beschriebenen Prozesse stellen einen Teil des nicht-photochemischen Quenchings (NPQ), das high-energy-state quenching oder qe. Sie sind via PAM-Fluoreszenz messbar (Muller et al., 2001; Schreiber et al., 1994). Die Stellung der Xanthophyllzyklen innerhalb der Biosynthese der Xanthophylle und ihre regulatorische Funktion wird in Kapitel 1.3 vorgestellt. Die Carotinoide sind theoretisch nicht nur in der Lage angeregtes Chlorophyll oder Triplett- Chlorophyll zu quenchen, sondern auch Singulett-Sauerstoff. Allerdings ist derzeit noch unklar, ob und wenn ja, in welchem Maße, es in-vivo dazu kommt. Eventuell könnte hier enzymatischen SOD-Metabolisierung über Superoxid-Dismutase oder Peroxidreduktase oder aber andere Antioxidantien wie α-tocopherol, Glutathion und Ascorbat der Vorzug gegeben werden (Niyogi, 1999). Alternativer Elektronentransport In Abbildung 1.1 sind verschiedenen Wege des alternativen Elektronentransports aufgezeigt, die an verschiedenen Stellen des Photosyntheseapparates Elektronen aus der Redox-Kette abziehen oder einführen und so den Reduktionsgrad der einzelnen Komponenten beeinflussen können. Dies kann unter Umständen die Wahrscheinlichkeit zur effektiven Ladungstrennung im PSII Reaktionszentrum erhöhen und so die Lebensdauer der angeregten Chlorophylle und dadurch die Ausbeute des intersystem-crossing vermindern. Im Falle der Chlororespiration wird durch die Oxidation von NADPH zu NADP + Bereitstellung neuer Elektronenakzeptoren für das Ferredoxin am PSI unterstützt. So kann eine weitere SOD-Quelle entschärft werden. Insbesondere unter CO 2 -limitierten Bedingungen kann es zu einer Überproduktion von NADPH bei nur langsam ablaufender CO 2 -Fixierung durch den Calvin-Zyklus kommen (Niyogi, 2000). Photoinhibition Als Photoinhibition bezeichnet man im Allgemeinen das Phänomen einer Absenkung der Ausbeute photochemischer Ladungstrennung am PSII unter Starklichtbedingungen. Auch die Photoinhibition stellt einen Anteil des NPQ, das sogenannte qi ((Muller et al., 2001). Jedoch ist die im PAM-Fluorometer zu beobachtende Löschung der Chl a-fluoreszenz, die auf qi zurückgeführt wird, deutlich langsamer aufzuheben als das bei qe der Fall ist. Die die

13 Einleitung 13 physiologischen Prozesse die zur Entstehung von qi beitragen sind vermutlich vielfältig und im Detail derzeit noch nicht aufgeklärt. Ein Teil des qi wird auf eine reduzierte Anzahl aktiver PSII Reaktionszentren zurückgeführt. Schon einige Jahre ist bekannt, dass insbesondere der turn-over (engl. Umsatz) des D1 Proteins im PSII unter Starklichtbedingungen deutlich erhöht wird (Kettunen et al., 1991), jedoch nicht unbedingt in einem Nettoverlust an Protein resultieren muss. Über die Frage, ob Photoinhibition eine Art Netto-Schaden darstellt, der durch Reparatur und Neusynthese nicht kompensiert werden kann, oder ob eine gezielte Inaktivierung der PSII stattfindet, wird derzeit noch diskutiert. Ebenso über den Mechanismus der einer Regulation dieses Protein-turn-overs zugrunde liegen könnte (Georgakopoulos et al., 2002; Jahns et al., 2000; Kruse et al., 1997). Es wird außerdem die Möglichkeit diskutiert, dass in inaktiven Reaktionszentren ein dissipative Energieableitung erfolgt und diese eventuell den Energiedruck auf die aktiven Zentren mindert (Horton et al., 1996). Allgemein wird davon ausgegangen, dass es sich bei qi um eine Mischung aus Photoschäden und gezielten regulativen Mechanismen handelt Die Biosynthese der Carotinoide In Chloroplasten dienen die Stoffwechselintermediate Pyruvat und Glycerinaldehyd-3- phosphat (GA3P) als Ausgangsstoffe der Carotinoidbiosynthese. Aus ihnen entsteht zunächst unter Decarboxylierung des Pyruvats ein C5-Körper, das Isopentenylpyrophosphat (IPP). IPP ist ein im Pflanzenreich weit verbreiteter C5-Baustein (Isopreneinheit), der das Grundelement eines wichtigen Stoffwechselzweiges, der Terpenoidbiosynthese, liefert. Zu den Terpenoiden zählt neben den Carotinoiden auch das Phytol, welches im letzten Schritt der Chlorophyllsynthese an Chlorophyllid a oder b gebunden wird, sowie in höheren Pflanzen zahlreiche Sekundärstoffe wie die Phytohormone Abscisinsäure und die Giberelline. Für den weiteren Weg der Carotinoidsynthese wird zunächst durch die IPP-Isomerase (IPI) IPP zu Dimethylallylpyrophsphat (DMAPP) isomerisiert. Diese Reaktion wird als limitierender Schritt der Biosynthese der Carotinoide diskutiert (Cunningham et al., 1998). DMAPP wird dann mit 3 mol IPP schrittweise zu Geranylgeranylpyrophsphat (GGPP) kondensiert. Die Reaktion wird durch die GGPP-Synthase (GGPS) katalysiert. GGPP ist zugleich letzter gemeinsamer Schritt von Carotinoid und Phytol-Synthese. GGPP kann durch die GGPP- Reduktase (GGPR) reduziert und zu Phytol umgesetzt werden. Das Phytoen, das erste symmetrische C40-Kohlenstoffgerüst der Carotinoidbiosynthese entsteht durch die Kondensation von zwei Molekülen GGPP, vermittelt durch die Phytoen- Synthase (PSY). In das Phytoen werden durch zwei verschiedene Desaturasen, die Phytoen-

14 Einleitung 14 Desaturase (PDS) und die ζ-carotin-desaturase (ZDS) jeweils zwei C-C-Doppelbindungen eingeführt und das Produkt der Desaturierung, das Lycopin, ist durch ein 11 Doppelbindungen umfassendes konjugiertes π-elektronen-system charakterisiert. Lycopin stellt damit das erste Intermediat der Carotinoidbiosynthese mit Farbstoffeigenschaften, das heißt, mit der Fähigkeit Licht zu absorbieren, dar. Lycopin dient als Substrat von Cyclasen (LCY), die die beiden Enden des Moleküls zu β (durch die Lycopin--Cyclase, LCYB) oder ε Iononringen (durch die Lycopin-ε-Cyclase, LCYE) schließen. Besitzt das Produkt zwei -Iononringe, so ist -Carotin entstanden und der -Weg der Carotinoidbiosynthese eingeschlagen. Durch diverse Oxidationssschritte entstehen aus -Carotin zum Beispiel die Carotinoide des Violaxanthinzyklus, sowie das Neoxanthin, Diadino- und Fucoxanthin. Wird eines der Molekülenden zu einem ε-ring geschlossen, so entsteht α-carotin, das Ausgangssubstrat für alle Xanthophylle des α-weges. In den Gefäßpflanzen gehört hierzu als wichtigstes Xanthophyll das Lutein, in der Alge Mantoniella squamata (Prasinophyceae) wird das Hauptxanthophyll Prasinoxanthin über den α-weg gebildet (Boehme et al., 2002; Egeland et al., 1995). Cunningham und Gantt (1998) postulierten, dass die LCY als Dimer zusammen mit PDS und ZDS membrangebundene Enzymkomplexe bilden. Hierbei sollen nur LCYB/LCYB-Homodimere oder LCYB/LCYE-Heterodimere möglich sein und so die Bildung von ε Carotin, das zwei ε-iononringen enthält, unterbunden werden. Bisher ist nur eine aus Lactuca sativa var. romaine isolierte LCYE in der Lage ε-carotin zu synthetisieren. In jedem Fall liefern die Carotine die Substrate zur Synthese der Xanthophylle, ihren Oxidationsprodukten. Auf dem -Weg führen -C 3 -Hydroxylasen (CHYB) an den Iononringen des -Carotins Hydroxyl-Gruppen ein. Das Produkt dieser Reaktion ist das Zeaxanthin. Auf dem α-weg entsteht auf analoge Weise im Zusammenspiel einer CHYB mit einer ε-c 3 -Hydroxylase Lutein aus α-carotin. Zeaxanthin dient als Substrat der Zeaxanthinepoxidase (ZEP), die in einer zweistufigen Reaktion zunächst Antheraxanthin (5,6-Epoxid) und dann Violaxanthin (5,6-5,6 -Diepoxid) synthetisiert. Auf die Funktion der ZEP, sowie der durch die Violaxanthindeepoxidase (VDE) ausgeführten Gegenreaktion wurde im Kapitel 0 eingegangen. Die Neoxanthinsynthase (NSY) vermittelt die Entstehung von Neoxanthin aus Violaxanthin. Unter der Öffnung des Epoxyringes und der Abspaltung zweier Protonen entsteht die allenische Gruppe zwischen dem sechsten und achten Kohlenstoff (C=C=C). In Gefäßpflanzen stellt Neoxanthin das Endprodukt der Carotinoidbiosynthese dar, dient aber vermutlich als Vorstufe des Phytohormons Abscisinsäure. In Algen dagegen finden sich noch zahlreiche vom Violaxanthin abgeleitete Xanthophylle, deren Synthese und die dafür

15 Einleitung 15 CO 2 Pyruvat GA3P Chlorophyllid a/b IPI IPP DMAPP 3x GGPS GGPR Phytol GGPP PSY GGPP Phytoen PDS ζ-carotin Chlorophyll a/b ZDS Lycopin LCYB LCYB/LCYE β-carotin CHYB Zeaxanthin α-carotin Lutein CHYB und CHYE VDE Antheraxanthin Violaxanthin NSY Neoxanthin ZEP Fucoxanthin allenische Gruppe Diadinoxanthin Diatoxanthin acetylenische Gruppe Abbildung 1.3: Schematische Darstellung der Carotinoidbiosynthese. Das Schema ist nicht speziell auf einen bestimmten Organismus bezogen, sondern soll die bis dato charakterisierten Enzyme (kursiv, Abkürzungen nach Cunningham und Gantt (1998); Näheres im Text) und die wichtigsten Verzweigungsstellen der Xanthophyllsynthese aufzeigen. verantwortlichen Enzyme noch nicht im Detail bekannt sind. Martin Lohr (Lohr et al., 1999; Lohr et al., 2001; Lohr, 2000) konnte jedoch in einer umfassenden Arbeit an Chlorophyll a/c enthaltenden Algen starke Hinweise darauf finden, dass Violaxanthin als Vorstufe sowohl der Carotinoide mit allenischer Gruppe wie Neoxanthin und Fucoxanthin, als auch derer mit acetylenischer Gruppe (C-C-Dreifachbindung zwischen dem siebten und achten Kohlenstoff, Strukturformeln im Anhang) wie Diadino- und Diatoxanthin dient. Bei der Synthese von

16 Einleitung 16 Diadinoxanthin aus Violaxanthin wurde ein Mechanismus mit Neoxanthin als Intermediat vorgeschlagen. In Versuchen mit Phaeodactylum tricornutm (Bacillariophyceae) zeigte sich zudem eine weitere mögliche Funktion der Xanthophyllzyklen unter fluktuierenden Lichtbedingungen: Sie können als ein Regulationsventil innerhalb der Carotinoidbiosynthese (Lohr, 2000) angesehen werden. Unter Starklichtbedingungen kam es zu einer ausgeprägten Akkumulation der Pigmente des Diadinoxanthinzyklus, Diadino- und Diatoxanthin, bei einem Nettozuwachs des Gesamtcarotinoidgehaltes. Zusätzlich tauchten außerdem die Pigmente des Violaxanthinzyklus auf, wohingegen keine Zunahme der Fucoxanthingehalte festzustellen war. Fucoxanthin ist das Hauptxanthophyll der Diatomeen und ein typisches Lichtsammelpigment. Auf die photoprotektive Bedeutung der Deepoxyxanthophylle im Starklicht wurde schon in Kapitel 1.2 hingewiesen, zusätzlich verhindert die Deepoxidase- Aktivität im Licht offensichtlich aber auch die Synthese von Lichtsammelpigmenten. In einer angeschlossenen Schwachlichtphase dagegen war nur ein äußerst geringer Zuwachs der Gesamtcarotinoid-Gehalte zu verzeichnen. Der Fucoxanthingehalt jedoch stieg stark an und war korreliert mit einer entsprechenden Konzentrationsabnahme der Xanthophyllzykluspigmente. Dies lässt vermuten, dass Algen im Starklicht akkumulierten Pigmente im folgenden Schwachlicht in Fucoxanthin umzuwandeln vermögen und so sehr schnell und effizient aus Lichtschutz- Lichtsammelpigmente synthetisieren. Diese Vermutung konnte anhand von Versuchen mit Norflurazon, einem Hemmstoff der Phytoendesaturase, untermauert werden. Eine am Ende der Starklichtexposition mit Norflurazon behandelte Kultur der Diatomeen zeigte bei somit ausgeschlossener Neusynthese von Carotinoiden die gleiche Umsetzung der Pigmente der Xanthophyllzyklus-Pools zu Fucoxanthin. Der Chlorophyll a Gehalt korrelierte während der Starklicht- und Schwachlichtexposition mit dem Fucoxanthingehalt. Das heißt im Starklicht stagnierte die Chlorophyll a-synthese bei fortlaufender Carotinoidsynthese und setzte erst mit Beginn der Schwachlichtexposition wieder ein. Eine andere Regulationsmöglichkeit zeigte sich unter fluktuierenden Lichtbedingungen in der Prasinophycee Mantoniella squamata (Boehme et al., 2002). Diese Mikroalge besitzt sowohl auf dem α- als auch auf dem -Weg ein breites Spektrum verschiedener Xanthophylle, wobei das Hauptxanthophyll, das Prasinoxanthin, ein vom α-carotin abgeleitetes Xanthophyll ist. Starklicht bewirkte auf dem -Weg erwartungsgemäß eine Akkumulation der Xanthophyllzykluspigmente. Auf dem α-weg dagegen mündete die Carotinoidsynthese im Starklicht in signifikanten Mengen von Lutein und Dihydrolutein. Lutein gilt als Vorstufe des

17 Einleitung 17 Prasinoxanthins und Dihydrolutein weiterer für Mantoniella squamata typischer Xanthophylle (Egeland et al., 1995). Somit können in Mantoniella squamata auf beiden Wegen der Xanthophyllsynthese Pigmentpools angelegt werden, die unter Starklichtbedingungen die Synthese von Lichtsammelpigmente verhindern oder vermindern, ohne das es zu einem kompletten Stopp der Carotinoidsynthese kommen muss. Übersichten und spezifische Informationen zu Enzymen und zur Regulation der Carotinoidbiosynthese finden sich in den Artikeln von (Bohne et al., 2002; Bouvier et al., 1994; Bouvier et al., 1996; Bouvier et al., 1998; Bouvier et al., 2000; Cunningham et al., 1998; Cunningham et al., 2001; Hirschberg, 2001; Lohr et al., 2001; Sandmann, 1994) Der Protagonist: Euglena gracilis Die Gattung Euglena stellt nach van den Hoek (Van den Hoek et al., 1993) den Prototyp der Klasse der Euglenophyceae, die als Euglenophyta eine eigene Abteilung mit rund 40 Gattungen und 800 Arten bilden. Charakteristisch sind einzellige, limnische Flagellaten mit zumeist zwei anterioren Geißeln, die ausgeprägte sowohl positive als auch negative phototaktische Mobilität zeigen. Die Chloroplasten sind von drei Hüllmembranen umgeben und enthalten bei autotropher Anzucht die Chlorophylle a und b, sowie nach van den Hoek (1993) Diadinoxanhtin, Neoxanthin und β-carotin als Hauptcarotinoide, außerdem geringere Mengen Echinenon, Diatoxanthin und Zeaxanthin. Britton und Young (Britton et al., 1993) und darin angegebenen Quellen) geben weiterhin Heteroxanthin, 3,4 -Anhydrodiatoxanthin, Alloxanthindiester, Astaxanthin, 7,8-Didehydroastaxanthin, Canthaxanthin, α- Cryptoeutreptiellanon, β-cryptoeutreptiellanon, Echinenon, Hexadehydro-β-carotin-3-ol, Octadehydro-β-carotin-3-ol, Pectenolon, Pectenolondiester und Siphonein als innerhalb der Euglenophyceae vorkommende Carotinoide an. Martin Lohr (Lohr, 2000) fand im Rahmen seiner Dissertation geringe Mengen violaxanthinähnlicher und antheraxanthinähnlicher Xanthophylle in Euglena gracilis, isolierte aber keine ausreichenden Mengen, um deren Identität abzusichern. Euglena gracilis ähnelt somit im Vorhandensein der Chlorophylle a (Chl a) und b (Chl b) den höheren Pflanzen und Grünalgen, fällt allerdings durch ein stark vermindertes Chl b zu Chl a- Verhältnis auf. Cunningham und Schiff (Cunningham et al., 1986) zogen als Grund hierfür eine veränderte Struktur des LHCII mit einem geringerem Chl b zu Chl a-verhältnis als in höheren Pflanzen in Betracht. Außerdem konnten sie zeigen, dass die bei unterschiedlichen Anzuchtsbedingungen schwankenden Chl b zu Chl a- Verhältnisse mit der Menge an LHCII korrelieren. Die peripheren Antennen, genauer die LHCIIb Proteine, sind auch in höheren

18 Einleitung 18 Pflanzen der Ort, an dem fast das gesamte Chl b gebunden ist (Scheer, 1999). Im Hinblick auf die Carotinoid-Komposition mit Diadinoxanthin als Hauptpigment und dem fehlenden α-weg der Carotinoidbiosynthese erinnert Euglena gracilis jedoch, neben anderen Klassen, eher an die Chl a/c-haltigen Bacillariophyceen. Im Rahmen ihrer Dissertation über die Fluoreszenzlöschung in Euglena gracilis konnte Maria Doege (1998) weitere Besonderheiten des Flagellaten in Bezug auf den Photosyntheseapparat herausarbeiten. Sie unterschied drei, aufgrund ihrer Relaxationskinetik deutlich voneinander zu trennende, Komponenten der Fluoreszenzlöschung im Licht. Erstens eine innerhalb von rund fünf Minuten relaxierende ph-abhängige Komponente, die sie mit dem high-energystate quenching oder qe der höheren Pflanzen in Beziehung setzte (siehe auch Kapitel 1.2). In höheren Pflanzen wird dieses zum größten Teil vom Zeaxanthingehalt und der Aggregation von trimeren LHCII bestimmt und nur ein geringer Teil lässt sich auf Rekombinationsprozesse im PSII-Reaktionszentrum zurückführen (Wagner et al., 1996). In Euglena gracilis bringt sie diese Komponente, aufgrund des Fehlens von relevanten Mengen an Zeaxanthin und trimerem LHCII, in Verbindung mit einer strahlungslosen Dissipation im PSII-Reaktionszentrum. Zweitens zeigte sich eine innerhalb von 15 min relaxierende Komponente, die unabhängig vom Protonengradienten, aber abhängig von einer Phosphatasereaktion und dem Vorhandensein von bisher nur in Euglena gracilis nachgewiesenen LHCI/II-Komplexen war. Doege (1998) diskutiert in diesem Zusammenhang die Möglichkeit, dass mobile Antennenkomplexe (LHCI/LHCII) vom Reaktionszentrum abgekoppelt werden und so den Energiedruck auf das Photosystem vermindern helfen. Die dritte Komponente der Fluoreszenzlöschung, wird der Fluoreszenzlöschung durch Photoinhibition, also dem qi, zugeordnet und war auch nach einer 30 minütigen Fernrot- Inkubation noch nachweisbar. Obwohl die Flagellaten beide Pigmente des Diadinoxanthinzyklus, Diadinoxanthin und Diatoxanthin, besitzen, zeigen sie keine reversible Pigmentumwandlung im Sinne eines Xanthophyllzyklus. Allerdings herrscht über die Rolle der beiden Pigmente in Euglena gracilis im Zusammenhang mit photoprotektiven Mechanismen noch Unklarheit. Weiterhin zeigte Euglena gracilis ein Dunkelquenching, das sich durch schwaches Licht oder fernrotes Licht unterdrücken ließ. Doege (1998) bringt dies mit einer möglichen Chlororespiration in Verbindung. Durch den auch im Dunkeln vorhandenen ph könne es zu Phosphorylierungsreaktionen an den Antennenproteinen kommen, was zu einer Abkopplung der LHC vom PSII Reaktionszentrum führen kann und somit eine Fluoreszenzlöschung

19 Einleitung 19 bewirkt. Diese Theorie konnte sie durch die Fixierung des Dunkelquenches mit NaF, einem Phosphataseinhibitor, trotz Fernrot-Inkubation stützen. Die Thylakoidstruktur von Euglena gracilis lässt außerdem keine Unterscheidung zwischen Stroma- und Granathylakoiden erkennen (Van den Hoek et al., 1993), es liegt also keine räumliche Trennung der Photosysteme I und II vor, derart, wie sie für höhere Pflanzen üblich ist. Euglena gracilis ist zudem in der Lage den Stoffwechsel komplett auf Heterotrophie umzustellen und kann dann innerhalb von acht Generationen das gesamte Chlorophyll verlieren (Van den Hoek et al., 1993) Zielsetzung In Algen mit Xanthophyllzyklus kann die Carotinoidbiosynthese im Starklicht unabhängig von einer Chlorophyllsynthese weiterlaufen. Die Carotinoidbiosynthese mündet in diesem Fall in der Akkumulation von Lichtschutzpigmenten. In dieser Arbeit sollte am Beispiel von Euglena gracilis untersucht werden, wie sich die Synthese der Carotinoide im Starklicht verhält, wenn kein Xanthophyllzyklus vorhanden ist. Läuft die Carotinoidbiosynthese weiter und wenn ja bis zu welchem Punkt? Existiert ein regulatives Element vergleichbar mit der Luteinakkumulation in Mantoniella squamata? Ist die Synthese der Carotinoide gekoppelt an die Chlorophyll-Synthese? Oder kommt es zum Stopp der gesamten Pigmentsynthese? Weiterhin sollte die ökologische Bedeutung der fluktuierenden Lichtbedingungen für den Flagellaten eingeschätzt und mögliche photoprotektive Mechanismen diskutiert werden, die es den Algen erlauben, auf einen Xanthophyllzyklus zu verzichten.

20 Material und Methoden Material und Methoden 2.1. Allgemeines Die Sterilisation von Materialien und Nährmedien erfolgte im Autoklaven (Varioklav Typ 500, H + P LABORTECHNIK AG, Deutschland) bei 121 C für 20 min. Die Lichtintensitäten wurden mit einem planaren Quantensensor (Q21646) und dem Anzeigegerät LI-250 (LI-COR, USA) gemessen. Für die statistischen Berechnungen wurde das Programm Statistica 6.0 (STATSOFT, USA) genutzt Algen und Anzucht Euglena gracilis Klebs Stamm Z wurde zu Beginn der Arbeiten von der Göttinger Sammlung von Algenkulturen SAG bezogen (1224-5/25) und in autotrophem Nährmedium nach Wiessner (Wiessner, 1968) kultiviert. Die Zusammensetzung des Nährmediums ist im Anhang aufgeführt. Eine Stammkultur wurde in 500 ml Erlenmeier-Kolben bei einer Lichtintensität 40 µmol Photonen m -2 s -1 und einem Licht-Dunkel-Rhythmus von 14:10 h bei 20 C als Standkultur angezogen und alle vier Wochen in frisches Nährmedium überimpft. Für die Vorversuche wurden Airlift-Kulturen genutzt. Diese wurden über einen Schlauch mit Druckluft besprudelt, was zu einer guten CO 2 -Versorgung der Algen beitrug und außerdem eine ständige Durchmischung der Kultur gewährleistete. Homokontinuierliche Turbidostatkultur Für die Langzeitversuche wurden die Zellen in einer Durchflusskultur angezogen. Diese gewährleistet, dass im Verlauf der mehrwöchigen Kulturdauer keine Alters- oder Mangelerscheinungen die Messdaten beeinflussen. Ein Zulauf an frischem Nährmedium wurde automatisch über Photorezeptoren, die hinter den Kulturgefäßen platziert waren, reguliert (Lohr, 2000). Die Optische Dichte der Kultur wurde auf einen Chlorophyllgehalt von 1.8 mg L -1 Chlorophyll a geeicht, die Abweichung der Chlorophyll a-konzentration lag während der Versuche nie über ± 0.18 mg L -1 des Sollwertes (10%). Anhand des täglich bestimmten Überlaufvolumens konnten außerdem die Wachstumsraten bestimmt werden. Hierfür wurde zunächst das Überlaufvolumen gegen die Zeit aufgetragen und im Tabellenkalkulationsprogramm Excel 2000 (MICROSOFT, USA) die Steigung und der Bestimmtheitsgrad der Funktion berechnet. Teilt man die Steigung m [ml h -1 ] durch das

21 Material und Methoden 21 Volumen der Kulturgefäße erhält man die stündliche Wachstumsrate, die durch Multiplikation mit 24 in tägliche Wachstumsraten umgerechnet werden kann. µ [d -1 ] = 24*m/V mit m = dem Anstieg der Graden [ml h -1 ], V = Volumen der Kulturgefäße [ml] Die täglich entnommenen Probenvolumina wurden zum Überlaufvolumen addiert. Die Kulturen wurden zudem permanent mit wassergesättigter und gefilterter Druckluft begast und im Anzuchtsthermostaten (KNIESE, Deutschland) bei einer konstanten Temperatur von 20 C gehalten. Das Schwachlicht (Weißlicht) mit einer mittleren Photonenflussdichte (PFD) von 40 µmol Photonen m -2 s -1 lieferten Leuchtstoffröhren (Typ 36W/25-1, OSRAM, Deutschland). Für das Starklicht mit einer PFD von 800 µmol Photonen m -2 s -1 wurden zwei 500 Watt Quarz- Halogen-Strahler (PHILIPS, Deutschland) vor dem Anzuchtsthermostaten plaziert. Um eine Überhitzung des Thermostaten zu vermeiden, wurde während der Starklichtphasen zusätzlich ein Ventilator zur Kühlung der Thermostatoberfläche eingesetzt. Der Langzeitansatz Für die Langzeitversuche wurden jeweils zwei Kulturen im Turbidostaten im Schwachlicht angezogen bis konstante Wachstumsraten erreicht waren. Diese wurden dann sechs Tage lang mit einem Starklicht/Schwachlicht-Rhythmus von 6 zu 18 h belichtet. An den ersten fünf Tagen wurden jeweils vor Beginn und am Ende der Starklichtexposition Proben zur Pigmentanalyse, für PAM-Fluoreszenzmessungen, Tieftemperatur-Fluoreszenz- Emissionsspektren und Absorptionsspektroskopie entnommen. Aus dem Turbidostaten wurden hierzu ml der Zellsuspension steril entnommen (Details in Lohr, 2000) und davon zunächst 10 ml für die HPLC-Proben abgesaugt und schockgefroren (Kapitel 2.7). Direkt im Anschluss wurde 1 ml der verbeibenden Zellsuspension in die Küvette des PAM- Fluorometers überführt und die Fernrot-Belichtung gestartet (Kapitel 2.5). Im Anschluss daran wurden die Versuche zur Fluoreszenz- bzw. Absorptionsspektroskopie durchgeführt. Am sechsten Versuchstag wurden während der Starklichtphase und in der darauf folgenden Schwachlichtphase in kürzeren Abständen Proben entnommen. Die Zeitpunkte sind aus Tabelle 2.1 zu entnehmen.

22 Material und Methoden 22 Tabelle 2.1: Zeitpunkte der Probennahme am sechsten Versuchstag. Die Kulturen waren an den vorangegangenen Tagen mit 6:18 h Starklicht (HL) /Schwachlicht (LL) bestrahlt worden. Die HL-Intensität betrug 800 µmol Photonen m -2 s -1, die LL-Intensität 40 µmol Photonen m -2 s -1. Licht Zeit [h] HPLC TT-Fluoreszenz PAM-Fluoreszenz Absorption HL HL HL HL HL 4 + HL HL LL LL LL LL LL Bestimmung des Chlorophyllgehaltes Diese Methode zur Bestimmung des Chlorophyll a-gehaltes der Algenkulturen wurde zur Eichung der Turbidostat-Kultur, sowie zur Determination der Chlorophyll a-gehalte der Air- Lift-Kulturen eingesetzt. Zur Bestimmung des Chlorophyll-Gehalts wurden jeweils 5 ml der Algenkultur auf einen Glasfaserrundfilter mit einem Durchmesser von 26 mm (SCHLEICHER & SCHUELL, Deutschland) abgesaugt und im gleichen Volumen Aceton (80%), sowie einer Spatelspitze CaCO 3 und einem Löffel Glasperlengemisch (Durchmesser mm und mm im Massenverhältnis 3:1) in einer Duranglasflasche aufgenommen. Das Gemisch wurde unter CO 2 -Kühlung (MESSER GRIESHEIM, Deutschland) für 20 s im Zellhomogenisator (MSK, BRAUN, Deutschland) homogenisiert, anschließend der Überstand in zwei 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße dekantiert und 1 min bei g zentrifugiert (HERMLE, Z231M, Deutschland). Von der acetonischen Pigmentlösung wurde dann nach einem Nullabgleich bei 750 nm im Zweistrahlphotometer (HITACHI U-2000, Japan) die Absorptionswerte bei 664 und 647 nm bestimmt und die Konzentration von Chlorophyll a nach der Funktion von Ziegler und Egle (1965) berechnet: Chla [mg L -1 ] = 11,78 * E * E647

23 Material und Methoden Absorptionsspektroskopie Die in-vivo-absorptionsspektren wurden in einem zweistrahligen Spectral-Photometer (Specord M500, ZEISS, Deutschland) mit Probeneinsatz für streuende Proben gegen Nährmedium als Referenz gemessen. Vor jeder Probennahme und -messung wurde ein Korrekturspektrum erstellt. Die Spektren wurden bei einer Schrittweite von 2 nm von nm erfasst. Die Spaltbreite betrug 2 nm und die Integrationszeit 0.2 s. Es wurden jeweils drei Spektren erstellt und gemittelt PAM-Fluoreszenz Das eingesetzte Meßsystem Die PAM-Fluoreszenzmessungen wurden mit einem Chlorophyll Fluorometer 101 (WALZ, Deutschland) nach der Sättigungspulsmethode (siehe zum Beispiel Schreiber et al., 1994) durchgeführt. Die standardmäßigen Einstellungen waren eine Meßlichtintensität von zwei bei einer Frequenz von 1.6 khz, eine Verstärkung (Gain) von drei und eine Dämpfung (Damping) von sechs. Die Intensität der Sättigungsblitze betrug 3000 µmol Photonen m -2 s -1, deren Dauer 0.8 s, die Messlichtfrequenz wurde während der Sättigungspulse automatisch auf 100 khz erhöht. Als Lichtquelle diente eine Kaltlichtlampe KL 1500 (SCHOTT, Deutschland). Das aktinische Licht (300 µmol Photonen m -2 s -1 ) wurde von einer zweiten Kaltlichtlampe KL 1500 (SCHOTT, Deutschland) geliefert. Zur Dunkeladaptation und zur Unterdrückung des Dunkelquenches in Euglena gracilis wurde eine Fernrot-LED (FR102, WALZ, Deutschland) mit einem Emissionsmaximum bei 730 nm und einer Lichtintensität von 14 µmol Photonen m -2 s -1 genutzt. Das System war über eine Steuerungseinheit PDA100 (WALZ, Deutschland) an einen PC angeschlossen, der zur Steuerung und Datenaufnahme diente. Die System-Software WinControl (WALZ, Deutschland) wurde hierzu benutzt. Der Versuchsablauf An den ersten fünf Versuchstagen wurde die Relaxation der Chl a-fluoreszenz unter Fernrot- Belichtung (14 µmol Photonen m -2 s -1 ) vor Beginn und am Ende der Starklichtexposition aufgenommen. Dazu wurden entsprechend Euglena-Proben aus dem Turbidostaten entnommen und 1 ml der Zellsuspension in die PAM-Küvette überführt. Die Chlorophyll a- Konzentration in der Küvette betrug somit 1.8 mg L -1 ± 10%. Im Abstand von 2.5 min wurden Sättigungspulse gegeben und die Relaxation der Fluoreszenz verfolgt. An den ersten fünf Versuchstagen wurde kein aktinisches Licht gegeben, sondern lediglich die

24 Material und Methoden 24 Fluoreszenzlöschung während der Fernrot-Inkubation aufgenommen und die folgenden Parameter bestimmt. Der erste Sättigungsblitz diente in Anlehnung an die Nomenklatur von van Kooten und Snel (vankooten et al., 1990) zur Bestimmung der apparenten Quantenausbeute des PSII in gequenchtem Zustand Fv /Fm. Mit dem achten Blitz nach 17.5minütiger FR-Inkubation und Erreichen eines stabilen Fluoreszenzniveaus wurde Fv/Fm (= (Fm-F 0 )/Fm) bestimmt. Da Fv/Fm bei der ersten Messung am ersten Tag des Belichtungsversuchs, also bei den Zellen aus Anzuchtslicht, maximal war, wurde die apparente Quantenausbeute nach Fernrot-Inkubation an den Folgetagen mit Fv/Fm rec (engl. recovery) bezeichnet (Abbildung 3.3). Am sechsten Versuchstag wurden entsprechend dem in Tabelle 2.1 dargestellten Schema in kürzeren Abständen Proben entnommen und, wie im vorigen Abschnitt beschrieben, die apparente Quantenausbeute und Fv/Fm rec bestimmt. Im Anschluss an die Relaxationsphase wurde jeweils noch eine Induktionskinetik mit aktinischer Belichtung (300 µmol Photonen m - 1 s -1 ) durchgeführt. Hierzu wurde das in der Software integrierte Belichtungsprogramm für Induktionskurven eingesetzt. Während der 10minütigen aktinischen Belichtung lagen die Blitzintervalle bei 1 min Fluoreszenzspektroskopie Die Probenaufbereitung Für die Erstellung der Tieftemperatur-Fluoreszenzspektren wurde die Zellsuspension aus dem Turbidostaten im Verhältnis 2:3 mit Glycerin (100%) verdünnt, um beim Einfrierprozess die Eiskristallbildung zu verhindern. Die Chlorophyll a Konzentration in der Küvette (Plastibrand 1.5 ml semi-mikro, BRAND, Deutschland) betrug somit 0.72 mg/l in 60% Glycerin. Das Einfrieren erfolgte in flüssigem Stickstoff. Durch die extreme Abkühlung der Proben werden molekulare Vibrations- und Rotationsterme stark eingeschränkt und so die Energieniveau der verschiedenen Anregungszustände schärfer begrenzt. Dies führt zu einer schärferen Abgrenzung der Fluoreszenzbanden im Vergleich zu Messungen bei höheren Temperaturen. Das benutzte Meßsystem Die Fluoreszenzemissions-Spektren (77k) wurde am Fluoreszenz-Spectrophotometer F-3000 (HITACHI, Japan) erstellt. Die Excitationswellenlänge betrug 440 nm bei einer Spaltbreite von 10 nm. Die Emissionsspektren wurden von 600 bis 800 nm bei einer Spaltbreite von 3 nm und

25 Material und Methoden 25 einer Geschwindigkeit von 120 nm/min erstellt. Vor jeder Messung wurde bei 600 nm eine Nullwertkorrektur durchgeführt RP-HPLC Probenvorbereitung, Lagerung und Pigmentextraktion Für die quantitative Pigmentanalysen mittels RP-HPLC wurden jeweils 10 ml Algen auf einen Glasfaserrundfilter mit einem Durchmesser von 26 mm (SCHLEICHER & SCHÜLL, Deutschland) abgesaugt, in ein Eppendorfreaktionsgefäß (1.5 ml) überführt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Bis zur Gefriertrocknung (Lyovac GT2, AMSCO FINN-AQUA, Deutschland), die in der Regel nach maximal einer Woche erfolgte, wurden die Proben bei - 80 C aufbewahrt, nach dem Gefriertrocknen bei -20 C. Zur Pigmentextraktion wurde ein Filter mechanisch zerkleinert und in einer Duranglasflasche mit 1.5 ml Extraktionsmedium, ½ Löffel Glasperlengemisch und einer Spatelspitze CaCO 3 für 20s unter Trockeneiskühlung homogenisiert (Zellhomogenisator, BRAUN, Deutschland), zentrifugiert (analog zur Chlorophyllbestimmung, Kapitel 2.3) und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Extraktionsmedium 81 % Methanol 10 % Ethylacetat 9 % 0.2 mm Ammoniumacetat Das eingesetzte Trennsystem Die Auftrennung der Pigmente erfolgte an einem Chromatographie-System (WATERS CHROMATOGRAPHIE SERVICE, MILLIPORE, Deutschland) bestehend aus einer Pumpeneinheit mit System Controller (600-MS), einem Dioden Array (996) und einem Autosampler (717). Zur Steuerung, Speicherung und Weiterbearbeitung der Daten wurde ein angeschlossener PC mit der System-Software Millenium (WATERS CHROMATOGRAPHIE SERVICE, MILLIPORE, Deutschland) eingesetzt. Die Trennung wurde mit einer reversed phase Säule vom Typ ET 250/4 Nucleosil C 18 (MACHERY-NAGEL, Deutschland) bei Raumtemperatur durchgeführt. Während der Trennung wurden mit Hilfe des Photodioden-Array alle 4s Absorptionsspektren von Zusammensetzung der Eluenten sind in Tabelle 2.2 zusammengestellt. Die Flußrate betrug 0.8 ml min -1. nm aufgenommen. Der genutzte Gradient und die

26 Material und Methoden 26 Die Eluenten wurden vor Beginn jedes Meßtages für 10 bis 15 min mit Helium entgast. Tabelle 2.2: Der Gradient der HPLC-Trennung und die Zusammensetzung der Eluenten. Zeit [min] Eluent A Eluent B Eluent C 85% MeOH 15% 0.5 M Ammoniumacetat 90% Acetonitril 10% H % Ethylacetat Qualitativer Pigmentnachweis Die Identifizierung der Peaks erfolgte anhand von Referenzspektren und Retentionszeiten, die von Becker und Lohr im Rahmen ihrer Dissertationen (Becker, 2000; Lohr, 2000) angefertigt worden waren. Für den Nachweis der in Euglena gracilis geringer konzentrierten Carotinoide wurden Algen aus der Anzucht bei 40 µmol Photonen m -2 s -1 über einen Zeitraum mit 800µmol Photonen m -2 s -1 belichtet. Nach sechs Stunden wurden 50 ml der wie oben beschrieben vorbehandelten Algensuspension auf einen Filter mit einem Durchmesser von 55 mm (Kapitel 2.3) gezogen und gefriergetrocknet. Wie bereits beschrieben wurden die Pigmente in 5 ml Extraktionsmittel extrahiert. Die Pigmentlösung wurde dann mit jeweils 5 ml Diethylether und 5 ml 5M NaCl- Lösung versetzt. Nach Phasentrennung wurde die untere, wässrige Phase abgezogen und verworfen. Der Waschvorgang wurde noch je zweimal mit NaCl-Lösung und Aqua dest. wiederholt. Der verbleibende Diethylether-Pigmentextrakt wurde unter N 2 -Strom bis zur vollständigen Trockene eingedampft, zur Verseifung der Chlorophylle in 8%iger ethanolischer KOH gelöst, und 1.5 h bei 30 C im Dunkeln inkubiert. Das alkalische Milieu führt zur Abspaltung der veresterten Phytole des Chlorophyll. Die entstandenen Emulsion wird erneut mit Diethylether versetzt und mit NaCl-Lösung und Aqua dest. (s.o.) gewaschen.

27 Material und Methoden 27 Mit der wässrigen Phase werden die Chlorophyllide entfernt, so dass eine gelb-rote carotinoidhaltige Etherphase entsteht. Diese wird erneut eingedampft, in 200 µl Extraktionsmittel aufgenommen und direkt mittels HPLC aufgetrennt. Zum Nachweis des Violaxanthins wurde ein, wie im vorigen Abschnitt beschrieben, verseiftes Extrakt erneut eingedampft, dann in 850 µl Ethanol aufgenommen und mit 150 µl HCl/Ethanol (1:50 v/v) versetzt. Das Gemisch wurde für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend, wie beschrieben, mit Diethylether ausgeschüttelt, gewaschen, eingedampft, aufgenommen und mittels HPLC analysiert. Die Ansäuerung des Extraktes hat die säurekatalysierte Isomerisierung von 5,6-Epoxygruppen zu Furanoiden (5,8-Epoxid) unter Verlagerung einer C-C-Doppelbindung zur Folge (Britton et al., 1993; Britton, 1995). Dabei verkürzt sich der Chromophor, was zu einer hipsochromen Verschiebung des Absorptionsspektrums um 20 nm pro Epoxygruppe führt. Für das Di-Epoxyxanthophyll Violaxanthin bedeutet das eine Absorptionsverschiebung um 40 nm ins Kurzwellige. Die III/II-Werte wurden nach Liaaen-Jensen (1962) nach folgender Formel berechnet: III/II-Wert = (E III -E v )/(E II -E v ) Mit E III = die Extinktion im langwelligen Maximum, E v = Extinktion am Tiefpunkt zwischen E III und E II, E II = Extinktion im mittleren Maximum Pigmentquantifizierung Für die HPLC-Anlage wurde keine neue Eichung durchgeführt, sondern auf die Arbeit von Lohr (2000) zurückgegriffen. Lohr erstellte eine Chlorophyll a-eichung und berechnete die Umrechnungsfaktoren für die weiteren photosynthetischen Pigmente. Die Eichfaktoren und die Quantifizierungswellenlängen der einzelnen Pigmente sind in Tabelle 2.3 zusammengestellt. Die Quantifizierungswellenlängen sind so gewählt, dass sie möglichst nicht in einem Bereich des Absorptionsspektrums mit starker Steigung, sondern nahe eines (lokalen) Maximums lagen. Dies vermindert den Fehler durch eventuelle leichte Verschiebungen im Absorptionsspektrum oder Schwankungen in der Wellenlängeneinstellung des Detektors. Für Alloxanthin musste der Eichfaktor errechnet werden. Zwischen dem Absorptionskoeffizienten bei der Quantifizierungswellenlänge, α(λ quant ) (hier = α(480)), dem Absorptionskoeffizienten bei λ max (α(λ max )) und der Extinktion besteht folgende logische Beziehung: α(λ quant ) = α(λ max )* E(λ quant )/ E (λ max )