ARBEITSTECHNIKEN IN DER PROTEINCHEMIE. Proteinimmobilisierung Chemisches Protein-engineering

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1 ARBEITSTECHNIKEN IN DER PROTEINCHEMIE Proteinimmobilisierung Chemisches Protein-engineering

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4 Immobilisierung 1 Bindung biologisch aktiver Komponenten an (H 2 O-)unlösliche, (inerte) Träger unter Erhaltung der biologischen Wirksamkeit Biologisch aktive Komponenten: Enzyme, Antikörper, Nucleinsäuren, Inhibitoren, Substrate, Coenzyme, Zellen, Organellen, Bruchstücke davon Kernprobleme: wie aktiv? wie stabil? Anwendung: Grundlagenforschung Analytik Organische Chemie Medizin Enzym-Engineering Biologische Reaktoren Affinitätschromatografie

5 Immobilisierung 2

6 Immobilisierung 3 Reaktive Reste von Proteinen

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8 Immobilisierung 4 Trägereigenschaften: hoher Preis schwer verfügbar unerwünscht Angreifbarkeit durch Mikroben, ph, Lösungsmittel zu kleine Oberfläche, zu enge Poren störende Ladungen geringe mechanische Festigkeit zu wenig oder zu viele aktivierbare Gruppen Stabilität gegen Mikroben, ph, Lösungsmittel möglichst große Oberfläche, große Poren keine (unerwünschten) Ladungen hohe mechanische Festigkeit kontrollierbare Menge an aktiven Gruppen billig überall erhältlich wünschenswert weiters zu überlegen: Physikalische Form (Kugel, Sheet, Röhre, ), Hydrophilie, Permeabilität, Derivatisierbarkeit

9 Immobilisierung 5 Träger: ADSORPTION: Aluminium, Ton, Hydroxylapatit, Bentonit, CaCO 3, Ca-Phosphatgel, Silicagel und Aktivkohle mit Cephalin- bzw. Lecithincoating, Cellulose (auch CM- u. DEAE-Derivate), Celluloseacetat-, Collagen- oder Collodiummembranen, poröses Glas, Ionenaustauschharze, DEAE [CM]-Sephadex, Stahlpulver (aktiviert durch TiO 2 Belag) ENTRAPMENT: Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Silicongummi, Stärke, Silicagel (MIKRO)EINKAPSELUNG: Nylon-Mikrokapseln, Fasern, Liposomen, flüssige Membranen QUERVERNETZUNG: Glutaraldehyd, bifunktionelle Isocyanate, Imprägnierung eines Gewebes (Membran) vernetzen, Enzyme mit sich selbst vernetzen, Enzyme covernetzen mit inertem Protein (in An- bzw. Abwesenheit von Füllmaterial), Kristalle vernetzen

10 Immobilisierung 6 Träger für kovalente Bindung: Polysaccharide: Cellulose, Stärke, Sepharose (Agarose), Dextran, Chitin Vinylpolymere: Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Polystyrol Polyaminosäuren Polyamide: Nylon Anorganische Träger: poröses Glas, Fe 2 O 3

11 Immobilisierung 7 Aktivierung funktioneller Gruppen am Träger 1: Bromcyanaktivierung:

12 Immobilisierung 7 Reaktionsmechanismus der Carbodiimidkopplung: +

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15 Immobilisierung 7 Aktivierung funktioneller Gruppen am Träger 2:

16 Immobilisierung 7 Reaktionen mit Glutaraldehyd F.A. Quiocho in Methods Enzymol. 44, 551 (1976)

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18 Immobilisierung 7 Aktivierung funktioneller Gruppen am Träger 3:

19 Immobilisierung 7 Kopplungen an anorganische Träger (Beispiele): Träger wie z.b. Glas H - O

20 kontrollierbar!

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22 Immobilisierung 8

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24 Immobilisierung 9

25 Immobilisierung 10 Charakterisierung der Immobilisate: Unterschiede zum nativen Enzym wegen: a) Microenvironment b) Schraubstockwirkung der Bindungen zur Matrix c) Sterische Einflüsse durch gebundene Nachbarmoleküle Eigenschaften: Konformationsänderungen durch das Immobilisierungsverfahren Einschränkung der Möglichkeiten zur Konformationsänderung auf Grund der Immobilisierung resultiert in Hitzestabilität, Resistenz gegen Harnstoff, organische Lösungsmittel, Problem der Heterogenität innerhalb einer Enzympräparation: Packungsdichte, relative Verteilung an der Matrixoberfläche Orientierung der Moleküle ( komplexe Kinetik) Zahl der kovalenten Bindungsstellen Natur der Matrix Einflüsse auf die Kinetik: Konformations- und sterische Effekte Verteilungseffekte Änderung des Reaktionsmechanismus (Teilschritte) Diffusionseffekte

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27 Immobilisierung 11

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30 Design Vorschläge für das Engineering von Enzymen für das Arbeiten in nichtwässrigen Lösungsmitteln 1: Schaffen von verbesserten Möglichkeiten zur Wechselwirkung der Enzymoberfläche mit dem organischen Lösungsmittel: ( hydrophobere Oberfläche ähnlich wie bei Membranproteinen) Entfernen von Oberflächenladungen: Verminderung der benötigten Wasserkonzentration möglicher Einfluss auf das ph Optimum Entfernen oder Absättigen von Gruppen an der Proteinoberfläche, die zu H-Brückenbildung neigen

31 Design Vorschläge für das Engineering von Enzymen für das Arbeiten in nichtwässrigen Lösungsmitteln 2: Maßnahmen zur Stabilisierung der Konformation: interne Quervernetzungen: Einführen neuer Disulfidbindungen (mit möglichst großem Loop in die flexiblen Regionen des Enzymmoleküls) Reduzierung der Konformationsentropie, Verminderung intermolekularer Aggregation, Verminderung irreversibler Inaktivierung (Proteinauffaltungen) Einführung neuer und Intensivierung bestehender H-Brücken od. Anderer elektrostatischer WW im Molekülinneren Verstärkung von v.d.waals WW, Aufrechterhaltung bzw. Verbesserung einer dichten Packung des Enzyms Optimierung von H-Brücken im Molekülinneren hoher Ordnungsgrad der Sekundärstruktur * Verwendung geeigneter Seitengruppen zum Aufbau zusätzlicher Bindungen mit H-Brücken fähigen Positionen d. Hauptkette * Begünstigung von elektrostatischen WW im Molekülinneren durch das organische Medium (Ionenpaare an der Moleküloberfläche eher Stabilitätsminderung)

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37 Beispiele für Enzymelektroden und Thermistoren: Glucose Elektrode (Einsatz in Blut, Plasma, ) a) Glucose + O + H O 2 2 GOD H O + Gluconsäure 2 2 Sauerstoffelektrode Pt-Elektrode ph Elektrode GOD b) Glucose + Chinon + H 2 O Hydrochinon + Gluconsäure Pt-Elektrode + - Chinon + 2 H + 2 e Harnstoff Elektrode (Einsatz in Blut, Harn, ) Urease Harnstoff + 2 H 2 O NH HCO3 + NH 4 Sensor CO Sensor 2 Aminosäure-Elektrode Aminosäure Decarboxylase Amin + CO 2 CO Sensor 2 Alkohol Elektrode RCH OH + O 2 2 ADH RCHO + H O 2 2 Pt-Elektrode

38 Prototypen für Enzymelektroden und Thermistoren:

39 Potentielle Vorteile einer enzymatischen Katalyse in nicht-wässrigen Lösungsmitteln Erzielung von günstigeren thermodynamischen Gleichgewichten Erhöhung der Löslichkeit unpolarer Substrate Veränderte Substratspezifität Weniger Nebenreaktionen, die H 2 O als Reaktant benötigen Erleichterte Produktrecovery Verbesserte Enzymstabilität (vor allem in mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln) Verminderte Gefahr mikrobieller Kontamination

40 Vorschläge für das Engineering von Enzymen für das Arbeiten in nichtwässrigen Lösungsmitteln Schaffen von verbesserten Möglichkeiten zur WW der Enzymoberfläche mit organischen Lösungsmitteln (hydrophobere Oberfläche, ähnlich wie bei Membranproteinen) Entfernung von Oberflächenladungen Verminderung der benötigten H 2 O-Konzentration möglicher Einfluss auf das ph Optimum Maßnahmen zur Stabilisierung der Konformation Interne Quervernetzungen: Einführen neuer Disulfidbindungen (mit möglichst großem Loop in die flexiblen Regionen des Enzymmoleküls) Reduzieren der Konformationsentropie Verminderung von intermolekularer Aggregation Verminderung von irreversibler Inaktivierung durch Proteinauffaltungen Einführung neuer und Intensivierung bestehender H-Brücken oder anderer elektrostatischer Wechselwirkungen im Molekülinneren Verstärkung von V.d.Waals WW; Aufrechterhaltung bzw. Verbesserung einer dichten Packung des Enzyms Optimierung von H-Brücken im Molekülinneren (hoher Ordnungsgrad der Sekundärstruktur) durch Verwendung geeigneter Seitengruppen zur Bildung zusätzlicher H-Brücken zur Hauptkette, Begünstigung elektrostatischer WW im Molekülinneren durch das organische Medium (Stabilitätsverminderung wenn in organischen Lösungsmitteln Ionenpaare an der Moleküloberfläche liegen)

41 Selektive chemische Modifikation zur Veränderung der Eigenschaften von Enzymen und Antikörpern Ziele: Höhere Stabilität Bessere Löslichkeit Maskierung von Antigenizität Modifizierung im Hinblick auf * Aktivierbarkeit * Inhibierbarkeit Verschiebung der ph Optima Veränderung der Substratspezifität Kombinieren von chemischen Eigenschaften diverser prosthetischer Gruppen mit der Bindungsspezifität des aktiven Zentrums

42 Selektive chemische Modifikation zur Veränderung der Eigenschaften von Enzymen und Antikörpern Beispiele 1 Enzym-PEG Konjugate: O N O O O O O (CH 2 CH 2 O)nCH 3 NH 2 Methoxy-polyethylenglycolsuccinimidyl-succinat NH O O O O (CH 2 CH 2 O)nCH 3 katalytische Aktivität wird meist schwächer, bleibt aber erhalten resistenter gegen proteolytische Spaltungen nicht mehr allergen (als Drug einsetzbar z.b. PEG-Asparaginase gegen Tumoren) arbeitet auch in hydrophobem Ambiente Aktiv in mit H 2 O nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln (z.b. PEG Enzym doppelt so aktiv in Benzol wie natives Enzym in Puffer)

43 Selektive chemische Modifikation zur Veränderung der Eigenschaften von Enzymen und Antikörpern Beispiele 2 Peptidligasen durch Modifikation des aktiven Zentrums diverser Proteasen: CH 2 OH PMSF O CH 2 O S CH 2 HX - O CH 2 XH PMSF: Phenylmethylsulfonylfluorid X = S bzw. Se Hydrolyse unterdrückt (keine Bildung von Acyl-Enzym -Intermediaten) Ligase Wirkung drastisch verstärkt Gruppenspezifische Nucleasen: N S S oligonucleotid SH unspezifische Phosphodiesterase S S olig onucleotid gruppenspezifische Nuclease für einsträngige DNA bzw. RNA mit komplementären Sequenzen

44 Selektive chemische Modifikation zur Veränderung der Eigenschaften von Enzymen und Antikörpern Beispiele 3 Künstliche Redoxenzyme: Br O CH 3 N N O SH N O N CH 3 S O CH 3 N N O zb.: Papain, Pyruvat DECARBOXYLASE (Thiamin-abhängig) ein 10-Methylisoalloxazin Derivat N Pyruvat OXIDASE (Flavogruppen-abhängig) O N CH 3 2-Oxosäuren Aldehyd + CO 2 Pyruvat Pyruvat + Phosphat + O 2 Acetyl-phosphat

45 Selektive chemische Modifikation zur Veränderung der Eigenschaften von Enzymen und Antikörpern Beispiele 4 Umwandlung von Antikörpern in Enzyme: Antigen Affinity-labelling als Strategie zum Einführen katalytischer Gruppen in die Biorecognitionsposition von Antikörpern Eingeführte Imidazolgruppen katalysieren diverse Hydrolysen AK 1) NH 2 S S N S S(CH 2 ) 3 CHO 2) NaCNBH 3 N HS N H AK NH S S 1) DTT 2) S S N N N H S S N Permethylierung von Lys-NH 2 Gruppen Vermeidung von Reaktionen mit reaktiven Substraten, die Quervernetzungen und Präzipitationen verursachen können 1) CH O 2 2) NaCNBH 3 NH 2 NCH 3 H