Monoklonale Antikörpervermittelte Tumorregression. durch Induktion von Apoptose

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1 Monoklonale Antikörpervermittelte Tumorregression durch Induktion von Apoptose

2 Forschungsergebnisse: monoklonale Antikörper wurden gegen entartete Lymphozyten der Zelllinie SKW6.4 hergestellt; ein mak (anti-apo-1) bindet an APO-1 Geringste Mengen von anti-apo1 reichen aus um die Proliferation von APO-1+ Zellen in vitro zu blockieren und die Zellen durch Apoptose zu eliminieren

3 Mögliche Therapien von Tumorerkrankungen durch die Induktion von Apoptose über Signalwege der Rezeptoren der TNF- Familie wie Apo-1

4 Tumornekrosefaktor (TNF) (TNF-x) sind, zu den Zytokinen zählende, körpereigene Botenstoffe der Zellen des Immunsystems TNF Rezeptoren sind Multimere und besitzen Todesdomänen (DD) Zur Familie der Tumornekrosefaktoren gehören eine Vielzahl von Molekülen, insbesondere aber die Tumornekrosefaktoren TNF-α und TNF-β; auch Apo-1

5 Apoptose vs Nekrose programmierter Zelltod genetisch programmiert Wichtig für Embryogenese Metamorphose Gewebehomömstase Zelltod durch physikalische Beschädigungen Bei Entzündung

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7 Apoptose vs Nekrose Stimuli für Apoptose Wachstumsfaktorentzug Intrazellulärer Calcium Anstieg DNA- Schäden Virale Infektionen Chemotherapeutika Toxine Stimulation proapoptotischer Rezeptoren Auslöser für Nekrose: Hypotoxische, toxische Physikalische Mikrobielle Zellschädigungen Immunologische Zellbeschädigungen bei der die Mechanismen der Apoptose nicht eingreifen Durchblutungsstörungen Schädigungen von Membranen Elektrolytverschiebungen Erniedrigter ph- Wert

8 Apoptose vs Nekrose Merkmale der Apoptose: Verlust von Zellverbindungen und Mikrovilli Chromatinkondensation DNA- Fragmentierung (ca. 180 bp) Cytoplasmatische Kontraktion Dichte Packung von Mitochondrien und Ribosomen Bildung von Membranbläschen in denen endoplasmatisches Reticulum und die Zellplasmamembran verschmelzen; Unterteilung der Zelle in mehrere membrangebundene Vesikel apoptotische Körper Merkmale der Nekrose: Zerfall der Zellorganellen Nucleus verkleinert sich (Kernpyknose) und löst sich auf (Karyolyse) Integrität der Membrane verschwindet aufgrund Sauerstoffmangels; Lysosomen geben Inhalt frei Durch Ansammlung saurer Stoffwechselprodukte denaturieren Proteine und präzipieren Enzymatische Auflösung der Zellund Gewebsbestandteile Stoffe aus Cytoplasma werden unkontrolliert freigesetzt Macrophagen werden angelockt und lösen Entzündungsreaktion (Inflammation) aus

9 Apoptose vs Nekrose

10 Signalwege der Apoptose Zwei Signalwege der Apoptose: Extrinische Weg (Apo1-Signalweg; Typ I) Intrinische Weg (mitochondriale Weg; Typ II)

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12 MECHANISMUS DER CD95 VERMITTELTEN APOPTOSE CD95 besitzt keine enzymatischen Aktivitäten Signal wird durch Signalproteine übertragen CD95 besitzt eine ProteinProtein Interaktions Domäne in der cytoplasmatischen Region CD95 besitzt death domain DD (charakteristisch für die death receptor Unterfamilie der TNF Superfamilien)

13 MECHANISMUS DER CD95 VERMITTELTEN APOPTOSE Nach Bindung eines spezifischen Liganden oder Antikörpers, ist CD95 in der Lage den DISC ( death inducing signaling complex ) zu bilden Ligand muss ein Trimer sein FADD (Mort1) interagiert über seine DD mit der DD von CD95 Zusätzlich zur DD besitzt FADD am NTerminus DED ( death effector domain ) Procaspase 8 bindet an die DED des FADD

14 MECHANISMUS DER CD95 VERMITTELTEN APOPTOSE Aktivierung der Procaspase 8 durch Oligomerisation zur Caspase 8 (Heterodimer; 2 kleine, 2 große UE) Caspase 8 (CysteinProtease) wird ins Cytoplasma freigesetzt und spaltet einige Proteine (v. a. Procaspase 3) die zum Mechanismus der Apoptose beitragen

15 MECHANISMUS DER CD95 VERMITTELTEN APOPTOSE Caspase 3 aktiviert CAD, welches in den Zellkern eindringt und die DNA fragmentiert APOPTOSE

16 2. Methoden 2.1 Herstellung von monoklonalen Antikörpern 2.2 Immunpräzipitation zur Bestimmung des Molekulargewichtes von Proteinen 2.3 Nachweis für Apoptose: Darstellung der DNA-Leiter durch Gelelektrophorese 2.4 Nachweis für die Teilungsfähigkeit der Zellen: [³H]-Thymidin- Aufnahme 2.5 Bestimmung der Anzahl an lebenden Zellen: [51Cr]-Freisetzung

17 2.1 Herstellung von monoklonalen Antikörpern (nach Milstein und Köhler) Immunisierung: Über einen Zeitraum von 4 Wochen wurden BALB/c Mäusen wöchentlich 1*10 7 SKW6.4 Zellen (APO-1+) in die Bauchhöhle injiziert Bildung von B- Lymhozyten gegen SKW6.4 Zellen in der Milz Fusionierung von Milzzellen mit Myelom-Zellen Hybridomzellen entstehen (vereinigen Eigenschaften ihrer Ursprungszellen) Selektionierung: Abtöten der nicht- fusionierten Myelom-Zellen (Mangelmutanten) durch HAT- Medium Absterben lassen der nicht fusionierten Milz-Zellen in 3 Wochen

18 2.1 Herstellung von monoklonalen Antikörpern (nach Milstein und Köhler) Nach 12 Tagen werden Hybridom-Zellen auf anti-apo-1produktion getestet Antikörper werden monoklonal genannt, weil sie aus einer einzigen Ursprungs-B-Zelle stammen und daher alle identisch sind Auswählen der Hybridom-Zelllinie, die AK bilden, die am besten (höchste Affinität) das gewünschte Epitop auf dem Antigen binden Aufreinigung der gewünschten AK aus dem Zellüberstand

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20 2.2 Immunpräzipitation zur Bestimmung des Molekulargewichts von Proteinen Zellen wachsen in Medium das Methionin* (* =radioaktiv markiert) enthält Einbau bei der Translation neu synthetisierte Proteine sind radioaktiv markiert

21 2.2 Immunpräzipitation zur Bestimmung des Molekulargewichts von Proteinen Überführen der Zellen in Methionin*- freies Medium Waschen der Zellen und danach mit Kontroll- AK und anti-apo-1 inkubieren Waschen der Zellen und Lysepuffer dazu geben Zentrifugieren: Im Überstand sind evtl. AntigenAntikörper-Komplexe

22 2.2 Immunpräzipitation zur Bestimmung des Molekulargewichts von Proteinen Zugabe von Protein A- Sepharose: Bindet Humanes Immunglobulin (anti-apo-1 oder Kontroll- AK )

23 2.2 Immunpräzipitation zur Bestimmung des Molekulargewichts von Proteinen Waschen des an Sepharose gebundenen Immunkomplexes mit Puffer Freisetzen des Antigens mit SDS-Puffer und Mercaptoethanol (zerstört Disulfidbrücken des Antikörpers) Proben auf 95 C erhitzen, zentrifugieren und cpm des Überstandes mit dem ﻻ Zähler messen- Beladen der Bahnen eines SDS-Gels mit cpm Gel laufen lassen und Ergebnis mit Autoradiographie sichtbar machen

24 2.3 Nachweis von Apoptose: Darstellung der DNA-Leiter durch Gelelektrophorese Hintergrund: CAD kann nur zwischen den einzelnen Nukleosomen schneiden, dadurch entstehen DNAFragmente die die Länge der Nukleosom- DNA oder ein Vielfaches davon haben

25 2.3 Nachweis von Apoptose: Darstellung der DNALeiter durch Gelelektrophorese Durchführung: Lyse der Zellen mit NTE- Puffer Extrahieren der DNA mit Phenol + Chloroform Fällung der DNA mit Ethanol Lösen der DNA in NTE- Puffer Verdauen mit Ribonuclease Zugabe von Ladepuffer und Auftragen auf ein 1% Agarosegel Sichtbarmachen der DNA-Banden mit Ethidiumbromid

26 2.4 [³H]-Thymidin- Aufnahme als Nachweis für die Teilungsfähigkeit der Zellen Hintergrund: Thymidin wird bei der Zellteilung benötigt um neue DNA zu synthetisieren, dadurch wird [³H]-Thymidin von den Zellen, die sich teilen aufgenommen Die Menge des aufgenommenen [³H]-Thymidin repräsentiert die Teilungsfähigkeit der Zellen und ist direkt proportional zu dieser Je weniger [³H]-Thymidin aufgenommen wird, desto weniger teilen sich die Zellen

27 2.4 [³H]-Thymidin -Aufnahme als Nachweis für die Teilungsfähigkeit der Zellen Durchführung: Inkubation von SKW6.4 Zellen mit Kontroll-AK und antiapo-1 in verschiedenen Konzentrationen Überführen in Wachstumsmedium und Zugabe von [³H]Thymidin Inkubieren für 4 Stunden Waschen der Zellen Zählen der Ausschläge mit einem ﻻ Zähler-

28 2.5 [51Cr]- Freisetzung zur Bestimmung der Anzahl an lebenden Zellen Hintergrund: Cr* wird von den Zellen aufgenommen; tote Zellen setzen Cr* wieder frei Mit Hilfe eines ﻻ Zähler, eines Werts für den Hintergrund,eines Werts für 100% lebende Zellen, und eines Werts für 0% lebende Zellen wird der Anteil an lebenden Zellen in einer Kultur bestimmt

29 2.5 [51Cr]- Freisetzung zur Bestimmung der Anzahl an lebenden Zellen Durchführung: Herstellung der Ansätze: Eine bestimmte Anzahl von Zellen wird in Cr*- haltigem Medium kultiviert, so dass alle Zellen Cr* aufgenommen Waschen der Zellen und Überführen in ein Cr*-freies Medium Messen der cpm des Überstandes der unbehandelten Zellen gemessen (Wert für 100% lebende Zellen) Bestimmun des Hintergrundwertes: Zugabe von Kontroll- AK zu den Zellen und zählen der cpm dieses Zellüberstandes; dieser Hintergrund wird zuletzt von allen erhaltenen Werten abgezogen. In einem Ansatz werden alle Zellen abgetötet und davon wiederum die cpm des Überstandes gemessen (Wert für 0% lebende Zellen) Zugabe von anti-apo-1 zu einem Ansatz, zählen der cpm dieses Zellüberstandes ( Mit Hilfe der Referenzwerte wird nun die Anzahl der lebenden Zellen bestimmt)

30 3. Ergebnisse

31 Ziel: Charakterisierung von Apo-1 (CD 95, FAS) 1.) Verwendung monoklonaler Antikörper (mak): gegen SKW6.4 = menschliche B-Lymphoblast- Zell-Linie 2.) Wirkungsweise von mak 3.) Versuch (in vitro): Reaktion von Anti-Apo-1 in aktivierten oder entarteten menschlichen Lymphozyten (LZ) 4.) Versuch (in vivo): Funktion von Anti-Apo-1 in nu/nu- Mäuse (tragen Xenotransplant eines menschliche B-Zell-Tumors) 5.) Bestimmung der Lokalisierung von mak 6.) Histologische Untersuchungen 7.) mak als Therapeutikum

32 1.) Verwendung monoklonaler AK mak wurde gefunden: Anti-Apo-1 Blockiert Wachstum und vermittelt Apoptose (SKW6.4) Bindet an ca. 4x104 Stellen auf der Oberfläche von SKW6.4 Anti-Apo-1 = IgG3 Isotyp mit sehr hoher Affinität (KD=1,9x10-10) Bindungsstelle = endogen synthetisiertes Apo-1 (52kD)

33 1.) Verwendung monoklonaler AK: Immunpräzipitation zur Molekulargewichtsbestimmung Linke Spur: Kontroll- AK Rechte Spur: Apo-1 Aktin (Hauptbestandteil des Cytoskelett) Hintergrund Anti-Apo-1 (Abbauprodukt o. nicht kovalent mit Apo-1 gebunden

34 2.) Wirkungsweise von mak Kein Effekt: Isotype Kontroll- mak (FII20) bindend mak (FII23) nicht bindend 18 nichtbindende und 9 bindende mak vom IgG3-Isotyp mak gegen bekannte Antigene auf SKW6.4 (CD19, CD20, CD22, MHC- Klasse 2, IgM) SKW6.4-Idiotyp Besonderheit: nur Anti-Apo-1 vermittelt Apoptose 10ng/ml Anti-Apo-1 blockieren das Wachstum zu 95% von SKW6.4Zellen in 200µl-Kulturen

35 2.) Wirkungsweise von Anti-Apo-1: Anti-Apo-1-Zelltod ist Komplementunabhängig Veränderte Morphologie und Ausbildung einer DNA-Leiter ( CAD schneidet nur zwischen Nukleosomen) Exogenen Ca2+-Kanäle besitzen keine Wirkung Verzögerte Trypanblau- Aufnahme und 51Cr-Abgabe (Bestimmung der Anzahl der lebenden bzw. toten Zellen) Trypanblaue Färbung nur bei toten Zellen Cr-Aufnahme nur bei lebenden

36 2.) Wirkungsweise von Anti-Apo-1: DNA-Leiterbildung von CCRF-CEM.S2 Bahn 1: Marker Bahn 2: Kontroll- mak (I3B1) Bahn 3-8: Anti-Apo1-Zugabe

37 2.) Wirkungsweise von Anti-Apo-1 Induktion von Apoptose (Membran- Blebbing) T-Zell-Linie CCRF-CEM.S2

38 2.) Wirkungsweise von Anti-Apo-1: [3H]-Thymidin-Aufnahme von SKW6.4: Maß für die Zellteilung

39 3.) Versuch (in vitro): Reaktion von Anti-Apo-1 Expression von Apo-1 in versch. Zelltypen Apo-1 positiv: Menschliche lymphoide B- und T-Zell-Linien Frisch isolierte Leukämiezellen Aktivierte B-Zellen Aktivierte T-Zellen Apo-1 negativ: Gibbon- oder MausT-Zell-Linie Menschliche monocystische Zell-Linie Ruhende B-Zellen Peripher liegende ruhende T-Zellen

40 Reaktivität von Anti-Apo-1 ( Apo-1 = spezies-spezifisches AG)

41 4.) Versuch (in vivo): Funktion von Anti-Apo-1 in nu/nu Mäuse A) Injektion von BJAB- Zellen Vorteil von BJAB: (EBV- negativ, Burkitt- ähnliches Lymphom): Produziert die größten Tumor-Mengen in nu/nu- Mäusen Nachteile: Am wenigsten empfindlich gegen Apo-1 Exprimiert nur 1,5x104 Apo-1-Epitope pro Zelle 5 Wochen nach der Injektion: Tumorwachstum (Durchmesser: 1,0-2,5cm)

42 4.) Versuch (in vivo): Funktion von Anti-Apo-1 in nu/nu-mäusen B) Injektion von mak (500µg/Maus) Injektion von mak: Kontroll- mak FII20 Nichtbindende mak FII23 oder I3B1 Gereinigtes Anti-Apo-1 Als Kontrolle wurden 3 nu/numäuse (Apo-1-negativen BZell-Tumor) mit Anti-Apo-1 injiziert Effekt nach 2 Tagen: Keinen Effekt Keinen Effekt Schnelle Rückbildung des Tumors (in 10 von 11 Mäusen innerhalb 14 Tage) bei 3 Mäusen kam es sogar zur kompletten Rückbildung Kein Effekt

43 4.) Versuch (in vivo): Anti-Apo-1 induzierte Tumorrückbildung von BJABTumoren in nu/nu- Mäuse

44 5.) Bestimmung der Lokalisierung und Anreicherung der mak Autoradiographie: Markierungsexperimente: mit markiertem Anti-Apo-1 und FII20 Ausgeprägte Bindung von Anti-Apo-1 und FII20 im peripheren Gewebe Nach 48h 4-fache Vermehrung von Anti-Apo-1 und FII20 Im Zentrum nur geringe Bindung von Anti-Apo-1 und FII20 Nach 96h 6-fache Vermehrung Der nichtbindende mak FII23 konnte wie erwartet nicht lokalisiert werden

45 5.) Lokalisierung von Anti-Apo-1 in BJABGewebezellen und Induktion von Apoptose Aufnahme von 125I-markierten Anti-Apo-1: Bild 1-3:bei 12h, 48h u. 96h Aufnahme von 125I-markierten Bild 4: Anti-Apo-1 Bild 5: FII20 Bild 6: FII23 (nicht bindend)

46 6.) Histologische Untersuchungen des BJABTumors (Dünnschnitt-Präparation) FII20-Injektion: Anti-Apo-1-Injektion: (nach 10 Tagen) (nach 10 Tagen) fester BJAB- Tumor (durchdrungen von Wirtsgefäßen für die Ernährung) Tumorzellen mit starken besteht aus dicht verpackten Blasen mit vielen Mitosen, einigen Riesentumorzellen und seltenen apopotischen Gebilden morphologischen Veränderungen (MembranBlebbing, Kondensation des Zytoplasmas) Anzeichen für Apoptose

47 6.) Histologische Untersuchungen Bild 1: fester BJAB-Tumor Bild 2: Apoptose-Induktion

48 6.) Histologische Untersuchungen zeigten: Anti-Apo-1 vermittelt Apoptose in vivo genauso effektiv wie in vitro Anti-Apo-1 bildet den BJAB- Tumor zurück, obwohl es sich nur in der Peripherie anreichert. Diese Barriere zeigt keine Wirkung, da die Aktivität und die Aufenthaltszeit groß genug ist. FII20 bindet zwar stark an BJAB, aber bewirkt keine Rückbildung Killer-Zellen oder Komplement sind zwar beteiligt an der Tumorrückbildung, aber sie bewirken alleine keine BJABRückbildung in vivo

49 7.) mak als Therapeutikum Standardtherapie gegen maligne Lymphome: Polychemotherapie und Immuntherapie (Interferonen etc.) In den letzten Jahren: Immuntherapie mit mak immer mehr Bedeutung Anti-Apo-1 erste entdeckte AK mit direkter Apoptose-Induktion Problem: Apo-1-Rezeptor wird von verschiedenen Gewebearten recht unspezifisch exprimiert entsprechende mak wie Anti-Apo-1 für die Therapie zu risikoreich Erfolgreiche mak: Rituximab/ Mabthera Trastuzumab/ Herceptin Allein oder in Verbindung mit Chemotherapie verabreicht Entartete Zellen durch AK markiert und durch zelleigene Abwehrzellen zerstört

50 7.) mak als Therapeutikum Weitere Möglichkeit: Indirekte Induktion von Apoptose durch gezielte Rekrutierung und Aktivierung immunologischer Effektorzellen mittels bispezifischer AK besonders wirkungsvoll: rekombinante bispezifische single- chain AK (bestehen nur aus der variabler Region) kl. Moleküle aus nur einer Peptidkette (einfach und billig herzustellen dafür weniger stabil) höhere Tumorpenetration möglich