Mikrobiologie II - Überblick

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1 Mikrobiologie II - Überblick Vorbemerkungen zum Zellmetabolismus Energiestoffwechsel von Mikroorganismen Gärungsformen, Substratkettenphosphorylierung Energiegewinnung durch die Atmungskette Energiegewinnung durch Photosynthese Mikroorganismen als Infektionserreger Pathogenitätsfaktoren Toxine

2 Mikrobiologie II - Überblick Energiestoffwechsel von Mikroorganismen Gärungsformen, Substratkettenphosphorylierung - Glycolyse (Embden-Meyerhoff-Weg) - Pentosephosphat-Weg - Entner-Douderoff-Weg - Phosphoketolase-Weg, Milchsäurebakterien - Reduktion von Pyruvat - Ethanolbildung in Hefen und Bakterien - Propionsäuregärung, Propionibakterien - Ameisensäuregärung, Enterobacteriaceae - Buttersäuregärung, Butanolgärung, Clostridien - Homoacetatfermentation in Clostridien

3 Mikrobiologie II - Überblick Energiestoffwechsel von Mikroorganismen Energiegewinnung durch die Atmungskette - Zitronensäurezyklus (Krebs-Zyklus) - Elektronentransportkette (Atmungskette) - Anaerober Elektronentransport - Aerobe chemolithotrophe Bakterien - Unvollständige Oxidation - Toxische Wirkung des Sauerstoffs

4 Mikrobiologie II - Überblick Energiestoffwechsel von Mikroorganismen Energiegewinnung durch Photosynthese - Struktur und Funktion photosynthetischer Reaktionszentren - Calvin-Zyklus - Purpurbakterien - Grüne Bakterien - Cyanobakterien - Halobakterien (Archaeen), Bakterienrhodopsin

5 Mikrobiologie II - Überblick Mikroorganismen als Infektionserreger Pathogenitätsmechanismen: Anheften, Invadieren Bakterielle Toxine - Diphtherietoxin - Choleratoxin - Pertussis-Toxin - Clostridien-Neurotoxine

6 Grundprinzipien der Biochemie Um die Vorgänge des Zellmetabolismus verstehen zu können, sind Grundkenntnisse der Thermodynamik (in welche Richtung läuft eine Reaktion, Einfluß von Energie und Entropie) und Kinetik (Reaktionsgeschwindigkeit) unbedingt erforderlich.

7 Energieinhalt (Freie Standard- Enthalpie) wichtiger Energiemetaboliten*

8 Energieinhalt (Freie Standard- Enthalpie) wichtiger Energiemetaboliten Die Werte geben die Enthalpie des jeweiligen Gruppenübertragungspotentials an, also die Enthalpie, die in der Bindung zum (bei ATP äußersten) Phosphat steckt, also keinesfalls eine Art Gesamtenergie des Moleküls (Was wäre das überhaupt? Die Energie, die bei Verbrennung frei würde? Die Energie, die bei Kernreaktionen frei würde?) In der Tabelle auf der vorigen Seite geht es jeweils um die hydrolytische Abspaltung eines Phosphatrestes (also + 1 H 2 O, 1 H 3 PO 4 geht ab).

9 Gibb sche Freie Enthalpie Zur Erinnerung (Physikalische Chemie, Biochemie) ΔG = ΔH - TΔS (Freie Enthalpie = Enthalpie - absolute Temperatur * Entropie Enthalpie H entspricht der Wärme (Wert negativ: exotherme Reaktion, Wärme wird frei). Entropie ist ein Maß für die Unordnung, nimmt insgesamt immer zu (2. Hauptsatz der Thermodynamik)

10 Gibb sche Freie Enthalpie ΔG = ΔH - TΔS Eine Reaktion läuft nur ab, wenn die Freie Enthalpie abnimmt. Eine Teilreaktion mit positivem ΔG kann ablaufen, wenn es mit einer anderen Teilreaktion so gekoppelt ist, dass ΔG insgesamt negativ ist. Das Δ bedeutet immer den Unterschied von Produkten der chemischen Reaktion zu den Edukten (Ausgangsverbindungen).

11 Gibb sche Freie Enthalpie ΔG = ΔH - TΔS Aus der Tabelle der Energiemetaboliten könnte man nun schließen, dass z.b. aus Kreatinphosphat (ΔG =-43,1 kj/mol) und ADP ATP und Kreatin entstehen können, nie aber umgekehrt (ATP>ADP ΔG =-30,5 kj/mol). Tatsächlich spielt aber die Konzentration der Substanzen noch eine entscheidende Rolle. Diese -Zahlen sind Standardwerte, die bei gleichen Konzentrationen (je 1 molar) gelten. Im Muskel liegt viel ATP und wenig ADP vor, dadurch kommt im Gleichgewichtszustand ( steady state ) auch Kreatinphosphat in nutzbaren (Energiespeicher) Mengen vor.

12 ΔG = ΔH - TΔS Gibb sche Freie Enthalpie Die Definition für -Zahlen mit alles ist 1 molar schließt auch Protonen (H + ) ein. Diese Standardbedingungen entsprechen daher einer extrem konzentrierten Säure mit ph=0! Für physiologische (natürliche, zelluläre) Reaktionen nimmt man daher lieber ein (ΔG ) als Standardwert. Dabei ist alles 1 molar, nur der ph ist neutral (ph=7, also H + - Konzentration 10-7 molar), und die Konzentration von Wasser ist 55 molar (wässriges M). Unterschiede zwischen ΔG und ΔG treten nur auf, falls in der Reaktion H + (oder OH - ) oder Wasser vorkommt.

13 Gibb sche Freie Enthalpie ΔG = ΔH - TΔS Diese Konzentrationsabhängigkeit macht das Ziehen einer ungünstigen Reaktion durch eine günstige erst möglich. Vom ungünstigen Zwischenprodukt liegt im steady state immer nur eine geringe Konzentration vor (durch den schnellen Verbrauch durch die ziehende Weiterreaktion).

14 Ermöglichen ungünstiger Reaktionen Beispiel für ein energetisch ungünstiges Zwischenprodukt, das durch günstige Weiterreaktionen ständig abgezogen wird: Das Gleichgewicht der Aldolasereaktion liegt weit auf Seiten des Fructose-bisphosphats (ΔG =+22,8 kj/mol für Aldolspaltung). In der Zelle wird das GAP aber so schnell verbraucht, dass (wegen der extrem niedrigen Konzentration der Edukte GAP und DHAP) die Spaltung abläuft (ΔG=-5,9 kj/mol für die zellulären Konzentrationsverhältnisse).

15 Ermöglichen ungünstiger Reaktionen Im Fall der ATP-Bildung: ADP + P i ATP + H 2 O, ΔG =+30,5 kj/mol, kann der Trick mit der niedrigen Konzentration nicht genutzt werden, da die Zelle eine recht hohe Konzentration des Energielieferanten ATP unbedingt braucht. Ausweg ist hier die Kopplung an stark exergonische (negatives ΔG) Reaktionen, z.b. die GAPDH/PGK-Reaktion: GAP + P i + NAD + 1,3-Diphosphoglycerat + NADH + H + 1,3-Diphosphoglycerat +ADP 3-Phosphoglycerat + ATP Die energieliefernde Reaktion ist dabei die Oxidation des GAP: GAP + NAD + 3-Phosphoglycerat + NADH + H +

16 Ermöglichen ungünstiger Reaktionen In diesem Fall darf kein Enzym die Reaktion ADP + P i ATP + H 2 O katalysieren, da sonst das aufwendig produzierte ATP wieder hydrolysieren würde!

17 Gleichgewichtsreaktionen Überhaupt ist es wichtig, sich klar zu machen, dass prinzipiell alle Reaktionen auf einen Gleichgewichtszustand zulaufen, d.h., es sind am Ende, im Reaktionsgleichgewicht, auch noch Ausgangsverbindungen vorhanden. Ganz in eine Richtung verschoben kann das aber dadurch werden, das ein Produkt entfernt wird (Weiterreaktion, aber auch, wenn ein Gas entsteht und entweicht). Dann läuft die Reaktion (im Versuch, dies Produkt nachzuliefern) immer weiter, bis zum Verschwinden der Edukte.

18 Gleichgewichtsreaktionen Die Mengenverhältnisse von Edukten und Produkten im Gleichgewicht werden durch das Massenwirkungsgesetz beschrieben: Für a A + b B x X + y Y gilt im Reaktionsgleichgewicht: K c = [X] x [Y] y / [A] a [B] b

19 Gleichgewichtsreaktionen Konkret für die Kreatinphosphatbildung: ATP + Kreatin ADP + Kreatinphosphat K c = [ADP][Kreatinphosphat]/[ATP][Kreatin] (die eckigen Klammern bedeuten die Konzentration der jeweiligen Substanz, die Kleinbuchstaben a, b, x, y die Anzahl der Moleküle in der Reaktion, im Beispiel je 1. Das tiefgestellte c zeigt, das die Gleichgewichtskonstante mit Konzentrationen berechnet wurde (es geht auch mit Partialdrucken, das ist dann K p )).

20 Gleichgewichtsreaktionen Zwischen der Gibbschen freien Enthalpie und der Gleichgewichtskonstante besteht folgende Beziehung: ΔG = -RT lnk Dabei ist T die absolute Temperatur (0 C = 273,15 K) und R die allgemeine Gaskonstante, also ein fester Wert: R = 8,314 J/(K mol) Für unser Beispiel errechnen wir aus den Enthalpien der Teilreaktionen (+43,1 kj/mol und -30,5 kj/mol) die Reaktionsenthalpie mit +12,6 kj/mol

21 Gleichgewichtsreaktionen Zwischen der Gibbschen freien Enthalpie und der Gleichgewichtskonstante besteht folgende Beziehung: 12,6 kj/mol = -0, kj/(k mol) 310 K* lnk c *bei 37 C lnk c = -4,889 K c = e -4,889 = 0,00753 (Eulersche Zahl e ca. 2,71) Kleiner Trick mit natürlichen Logarithmen: ln x = 2,303 log x Also ist unser K c (-4,889/2,303) = 10-2,123

22 Gleichgewichtsreaktionen K c = 0,00753 Also ist das Produkt der Ausgangskonzentrationen 133 mal größer als das der Produkte. Klingt schlecht für die Kreatinphosphatbildung. Wenn aber im gut versorgten Muskel das ATP/ADP-Verhältnis 50:1 ist, kann immerhin (133/50 = 2,66, so wäre das Kreatin/Kreatin- Phosphat-Verhältnis) gut ein Viertel des Kreatins in Kreatinphosphat umgewandelt werden. Im Extremfall soll sogar ein ATP/ADP-Verhältnis bis 500 erreicht werden können, wodurch der Großteil des Kreatins in Kreatinphosphat umgewandelt werden könnte.

23 Gleichgewichtsreaktionen Mit steigenden ΔG-Werten verschiebt sich das Gleichgewicht aber bald extrem zu einer Seite. (Die Tabelle geht von 300 K, also Raumtemperatur aus):

24 Gleichgewichtsreaktionen Das schnelle Ausrechnen von K c aus ΔG geht mit 1,493 ΔG = K c für 300 K und 1,474 ΔG = K c für 310 K Wenn der Taschenrechner keine beliebige Basis zum Exponenten erlaubt, hilft die Webseite:

25 Kinetik Auch wenn eine Reaktion thermodynamisch begünstigt ist, also ein stark negatives ΔG hat, heißt das nicht, das sie auch stattfindet. Zwischen Edukt und Produkt liegen meist energetisch sehr ungünstige Übergangszustände, die einen Energieberg darstellen, der die Reaktion verhindert.

26 Kinetik

27 Kinetik - Katalyse Katalysatoren sind Stoffe, die diesen Energieberg vermindern bzw. Umwege mit weniger ungünstigen Übergangszuständen ermöglichen und dadurch chemische Reaktionen enorm beschleunigen oder überhaupt erst möglich machen.

28 Kinetik - Katalyse

29 Kinetik - Enzyme Die effektivsten und in der lebenden Zelle weitaus wichtigsten Katalysatoren sind die Enzyme. Sie biegen die Edukte und bringen sie in Umgebungen (Ladungen, ph, Wasserabschirmung...), die sie in optimale Reaktionsfähigkeit versetzen.

30 Enzymkatalysierte Reaktionen Zwei Punkte sollte man sich dabei immer im Hinterkopf halten: 1. Zwischen den vielen Komponenten der Zelle ist theoretisch eine Unzahl chemischer Reaktionen möglich. Die Enzyme legen fest, welche davon wirklich geschehen. Das müssen keineswegs die energetisch günstigsten sein. Unterschiedliche Organismen setzen dieselben Ausgangsstoffe ganz verschieden um, dazu haben sie verschiedene Sets von Enzymen.

31 Enzymkatalysierte Reaktionen 2. Enzyme können nur Reaktionen beschleunigen, aber sie können keine Reaktionsgleichgewicht verschieben. Ihr Effekt ist nur der, dass das Gleichgewicht schneller erreicht werden kann. Beschleunigt werden immer die Hin- und die Rückreaktion im gleichen Maße! Durch die schon genannte Kopplung mit anderen Reaktionen ermöglichen Enzyme aber scheinbar (!) unmögliche, energetisch ungünstige Umsetzungen.

32 Enzymkatalysierte Reaktionen Enzyme, Proteine mit katalytischen Eigenschaften, sind die Maschinen der Zelle. Sie haben Fähigkeiten, von denen der Chemiker nur träumen kann: Sie können chemische Reaktionen im wässrigen Medium und bei mäßigen Temperaturen (meist C) und neutralem ph durchführen, die im Labor oft nur bei großer Hitze, in konzentrierten Säuren oder in organischen Lösungsmitteln ablaufen. Außerdem sind Enzymreaktionen hochspezifisch, anders als beim Chemiker entstehen praktisch keine Nebenprodukte (Abfall), die Ausbeute der Reaktion ist 100% (davon können Chemiker nur träumen). Außerdem sind Enzyme stereoselektiv.

33 Enzymkatalysierte Reaktionen Durch die Zusammensetzung des aktiven Zentrums und die Abschirmung von der Umgebung verlaufen einige Reaktionen im aktiven Zentrum eines Enzyms in wasserfreiem organischen Lösungsmittel oder bei extremen ph-werten, während die Umgebung wässrig und ph-neutral ist.

34 Enzyme der Glycolyse Hexokinase oder Phosphotransferase Phosphohexose-Isomerase Phosphofruktokinase Fruktosebisphosphat-Aldolase (Aldolase) Triosephosphatisomerase Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase Phosphoglyceratkinase Phosphoglyceratmutase Enolase Pyruvatkinase

35 Ablauf der Glycolyse - Teil I

36 Der Einstieg in die Glycolyse Bei Eukaryonten wird die Glucose durch Hexokinase phosphoryliert, bei vielen Bakterien durch das Phosphotransferase-System während der Aufnahme in die Zelle. Durch das Anhängen des Phosphats wird der Zucker für die Zelle viel besser handhabbar: er kann nicht mehr entkommen (Phosphotransferasesystem), und kann durch die Ladung in aktiven Zentren schnell und eindeutig orientiert werden.

37 Das Phosphotransferase-System

38 Glucosephosphatisomerase Triosephosphatisomerase Bei beiden Enzymen liegt das Gleichgewicht der Isomere beim falschen : GPI 70% Glucose-6-P, TPI sogar 95% DHAP. Die schnellen Reaktionen liefern das benötigte Isomere aber ausreichend nach, so dass beide Schritte nicht bremsend ( geschwindigkeitsbestimmend ) wirken. Die TPI gilt als ideales Enzym. Ihre Geschwindigkeit ist allein diffusionskontrolliert (das Substrat muß ja mit dem Enzym in Kontakt kommen), d.h., die enzymatische Reaktion selbst geht fast unmeßbar schnell.

39 Aldolase: Aldolkondensation bzw. Aldol-Spaltung Durch die benachbarte Carbonylgruppe wird das C2 azide (Proton kann abgehen) und greift mit dem freien Elektronenpaar den Carbonylkohlenstoff (der durch den Elektronenzug des Carbonylsauerstoffs positiviert ist) des anderen Moleküls an.

40 Ablauf der Glycolyse - Teil II

41 Reaktion der GAPDH Die Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase sorgt für das Entstehen einer energiereichen Phosphatbindung, die im folgenden Schritt zur ATP-Bildung genutzt wird. Dabei bildet das GAP mit einer Cys-SH-Gruppe des Enzyms zunächst ein energiearmes Thiohalbacetal. Durch Oxidation (mit NAD + ) wird daraus ein energiereicher Thioester, der durch Phosphorolyse zu einem Säureanhydrid gespalten wird.

42 + NAD

43 GAPDH Statt Phosphat kann die GAPDH auch versehentlich Arsenat einbauen. Das Produkt, 1-Arseno-3-Phosphoglycerat, zerfällt in Wasser zu 3-PG, es wird kein ATP gebildet, damit fällt der Energiegewinn durch die Glycolyse komplett aus. Arsenat ist also ein Energiegift.

44 Phosphoglyceratmutase Beim Wandern des Phosphats von -3 nach -2 wird erst ein enzymgebundenes Phosphat auf 2 übertragen (es entsteht 2,3- Bisphosphoglycerat), dann das 3-P aufs Enzym rückübertragen (und landet auf dem nächsten Phosphoglycerat). Zur Erstphosphorylierung des Enzyms und um es bei Verlust des Phosphats (wenn versehentlich 2,3-BPG entkommt) zu regenerieren, werden kleine Mengen 2,3-BPG benötigt (die die PGM mit einer BPG-Mutase-Aktivität aus 1,3-BGP bildet, dasselbe passiert in den Erythrocyten mit einer spezifischen BPG-Mutase in großem Umfang (2,3-BPG erleichtert O 2 - Abgabe vom Hämoglobin)).

45 Phosphoenolpyruvat Bei der zweiten Energiegewinnung in der Glycolyse entsteht die energiereiche Verbindung PEP durch Wasserabspaltung aus dem energiearmen 2-Phosphoglycerat (Enzym Enolase). Die hohe Energie (ΔG=-61,9 kj/mol, ATP-Bildung ΔG=-30,5 kj/mol) steckt nur zu einem kleinen Teil (ΔG=-16 kj/mol) in der Phosphatbindung, sondern überwiegend in der Tautomerisierung des Enols ins Keton (ΔG=-46 kj/mol).

46 Enolase Enolase benötigt zur Substratbindung Mg 2+. Fluorid (F - ) bildet mit dem Magnesium einen Komplex im aktiven Zentrum des Enzyms und blockiert es so. Darauf beruht die Giftigkeit von Fluorid (wieder ein Energiegift).

47 Schicksal der Kohlenstoffatome in der Glycolyse

48 Gleichgewichtsreaktionen Um zu überprüfen, ob eine Reaktion mit den gemessenen Konzentrationen von Substraten und Produkten in die gewünschte Richtung läuft (ob diese Reaktionsrichtung ein negatives ΔG hat), modifiziert man die ΔG -Gleichung zu: ΔG = ΔG RT lnq wobei Q das wirkliche Konzentrationsverhältnis von Produkten/Substraten ist. Ergibt ΔG einen negativen Wert, läuft die Reaktion in die richtige Richtung. Die Beziehung von K und ΔG gilt auch für Q und ΔG, eine Verschiebung des Konzentrationsverhältnisses um 10x ändert die freie Enthalpie um 5,7 kj/mol.

49 Schritte der Glycolyse: Energiebilanz Diese ΔG-Werte sind aus Konzentrationsmessungen errechnet, sollten also den zellulären Bedingungen entsprechen. Der positive Wert der Triosephosphatisomerase muss auf Meßungenauigkeiten* beruhen, oder die Grundlagen der Physikalischen Chemie sind falsch.

50 Schritte der Glycolyse: Energiebilanz * Da hier die GAP-Menge ja extrem niedrig ist (sowohl bei Aldolase wie bei TIM liegt das Gleichgewicht ja weit auf der anderen Seite), bewirkt hier ein kleiner Bestimmungsfehler (ist hier zu viel oder zu wenig GAP bestimmt?) eine starke Verschiebung des Enthalpiewertes. Bei einem ATP:ADP-Verhältnis von 50:1 werden alle ATPverbrauchenden Reaktionen um -10,08 kj/mol (bei 310 K, - 9,775 kj/mol bei 300 K) begünstigt, und alle ATP-bildenden um den gleichen Betrag ungünstiger. Ein NADH:NAD + -Verhältnis von 1:1000 erleichtert Oxidationen (GAPDH) und erschwert Reduktionen um 17,8 kj/mol (bei 310 K).

51 Schritte der Glycolyse: Energiebilanz Die Tabelle zeigt schön, welche (drei) Reaktionen weit vom Gleichgewicht entfernt liegen - und genau da sind die Regulationsstellen:

52 Regulationsschritte in der Glycolyse Zur Regulation eines Ablaufes bieten sich die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte an. An zwei Stellen unterscheiden sich Glycolyse und der inverse Weg, die Gluconeogenese: bei der Umsetzung Fructose-6-P und Fructose-1,6-bisphosphat und den Schritten zwischen Phosphoenolpyruvat und Pyruvat. In beiden Fällen erfordert der Rückweg mehr Energie als beim Hinweg gewonnen wird. Liefen beide Prozesse gleichzeitig, würde als Nettobilanz Energie verschwendet ( futile cycle ).

53 Regulationsschritte in der Glycolyse Daher sind die Phosphofruktokinase und die Pyruvatkinase die Haupt-Regulationspunkte der Glycolyse, dazu kommt der Eintritt in die Glycolyse, die Phosphorylierung der Glucose (deren Rückweg durch Hydrolyse des Phosphats ebenfalls zu Energieverlust führt).

54 Bilanz der Glycolyse Beim Umsatz von einer Hexose (Glucose, Fructose...) zu zwei Pyruvat werden zwei ATP reingesteckt, aber vier gewonnen: Gesamtgewinn 2 ATP im Verlauf der Substratmetabolisierung: Substratkettenphosphorylierung. Außerdem sind zwei NAD + zu NADH reduziert worden. Um die Redox-Bilanz neutral zu halten (die NAD + wiederzugewinnen), werden die Reduktionsäquivalente entweder auf die Produkte rückübertragen (Gärung) oder in der Atmungskette auf Elektronenakzeptoren (meist O 2 ) übertragen. Bei diesem Prozeß kommt es zu einer weiteren Energieausnützung (ATP-Bildung).