Zwischenergebnisse 2015 Mitoskopie

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1 Zwischenergebnisse 2015 Mitoskopie: Mitochondriales Monitoring von Stoffwechseländerungen bei neurologischen Erkrankungen mittels optischer Systeme (18239 N) Zielstellung Ziel dieses interdisziplinären Verbundprojektes, welches von den beiden Forschungsstellen Core Facility für konfokale und Multiphotonen Mikroskopie der Universität Ulm und der Abteilung Neurologie des Universitätsklinikums Ulm gemeinsam durchgeführt wird, ist das in vitro und in vivo Monitoring von mitochondrialen Stoffwechselveränderungen in Zell- und Tiermodellen für neurodegenerative Erkrankungen. Dem zu Grunde liegt die Arbeitshypothese, dass die parallele optische Messung mehrerer Stoffwechselparameter zur verbesserten Analyse in der Diagnostik und Therapie einer Vielzahl volkswirtschaftlich relevanter Erkrankungen beitragen kann. Das übergeordnete Ziel dieses Projekts ist die Evaluation eines in vivo FLIM/PLIM Systems, das das Monitoring verschiedener Aspekte des mitochondrialen Stoffwechsels sowohl im Zellmodell, in murinen ex vivo Hirn-Schnitten als auch in vivo durch ein Glasfenster im Schädelknochen (cranial window) in transgenen Tieren ermöglicht. Das angestrebte Produkt leistet einen innovativen Beitrag zur Erforschung der Krankheit AD und anderen neurodegenerativen Erkrankungen und eignet sich zur Entwicklung neuer Therapeutika. Als Ergebnis soll ein in vivo Imaging System mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung entstehen, das die Analyse mitochondrialer Stoffwechsel-Marker sowohl im Zellmodell, in primären hippokampalen Neuronen, als auch letztendlich in transgenen Tieren einfach und zuverlässig ermöglicht. Dadurch wird die Möglichkeit geschaffen, durch ein in vivo Screening System neue potentielle Medikamente (wie z.b. Methylenblau) gegen mitochondriale Störungen zu testen, was von hoher klinischer und auch wirtschaftlicher Relevanz ist. Ergebnisse Zunächst wurde ein System etabliert, mit dem simultan FLIM (fluorescence lifetime imaging) und PLIM (phosphorescence lifetime imaging) durchgeführt werden konnte. Zur Anregung von FLIM und PLIM im Laser Scanning Mikroskop (LSM 710 NLO, Carl Zeiss, Jena) wurde, wie in Abb. 1 demonstriert, ein zwischen 690 und 1040 nm durchstimmbarer fs Ti:Sa Laser (Spectra Physics, Darmstadt) mit einer Pulswiderholrate von 80 MHz verwendet. Alternativ wurde uns ein zweiwellenlängen fs gepulsten Faserlaser leihweise zur Verfügung gestellt. Erste Messungen wurden mit diesem Laser erfolgreich durchgeführt. NAD(P)H FLIM und PLIM eines Sauerstoffsensors wurden in der Regel mit 2 Photonen bei 780 nm angeregt. Als phosphoreszierender Sauerstoffsensor wurde ein Ruthenium Komplex, Ruthenium tris-(2,2 - bipyridyl) dichloride (Ru(BPY)3) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri), verwendet. Wie in Abb. 1 zu erkennen, wurden die Signale von FLIM und PLIM über ein Zweikanal TCSPC (time correlated single photon counting) System spektral getrennt. Die Detektoren am NDD Ausgang des Mikroskops waren für den NAD(P)H Kanal und den Ru(BPY)3 Kanal ein HPM sowie ein HPM Hybrid. Damit wurde das Fluoreszenzsignal zwischen 430 und 490 nm detektiert, das Phosphoreszenzsignal zwischen 615 und 690 nm. Zwischenergebnisse /5

2 Abb. 1: System zur simultanen Detektion von FLIM und PLIM, am NDD Ausgang des LSM 710. Im Rahmen des projektbegleitenden Ausschusses wurde uns außerdem ein weiterer HPM Hybrid Detektor leihweise zur Verfügung gestellt, um diesen am sogenannten DD Ausgang des LSM710 zur Messung der verzögerten Fluoreszenz von Protoporphyrin IX, zu testen. Mit Hilfe von FLIM/PLIM Messungen sollten mitochondriale Veränderungen detektiert werden. Die mitochondriale Funktion und der Sauerstoffverbrauch in den Zellen wurde durch Inhibierung des Coenzyme Q-cytochrome c Reductase Komplexes (Komplex III) in der mitochondrialen Membran durch Antimycin A (AA) manipuliert. Wie in Abb. 2 zu erkennen ist, induzierte dies eine signifikante Abnahme der Phosphoreszenz Abklingzeit des Sauerstoffsensors Ru(BPY)3, was auf eine erhöhte Sauerstoffkonzentration in der mitochondrialen Membran hindeutet. Abb. 2: Simultanes NAD(P)H-FLIM ( mean) und Ru(BPY)3 -PLIM ( ph) ohne (control) und mit Antimycin A Zwischenergebnisse /5

3 Gleichzeitig nahm die Fluoreszenz Abklingzeit von NAD(P)H signifikant ab, was mit einer Zunahme an sogenanntem freiem NAD(P)H korreliert und typisch für einen Stoffwechsel ist, bei dem die Glykolyse im Gegensatz zur oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) die wichtigere Rolle spielt. Unsere Methode der simultanen FLIM/PLIM Detektion ist damit in der Lage, metabolische Veränderungen in der Zelle und in den Mitochondrien aufzuklären und mit der Funktion des Sauerstoffs in der mitochondrialen Membran zu korrelieren, was für die Erforschung der Alzheimer Demenz von enormer Wichtigkeit ist. Des Weiteren konnten die FLIM Messungen so optimiert werden, dass durch die Änderungen der NADH Lebenszeiten alleine schon eine Aussage über die Atmungsleistung der Zellen getätigt werden kann. Hierzu wurden die FLIM Messungen mit denen der hochauflösenden Respirometrie (Oroboros) verglichen. Die Messungen des Sauerstoffverbrauchs lassen sich mit den NADH Lebenszeiten korrelieren, wodurch sich ein lineares Verhältnis zwischen der NADH Lebenszeit bzw. Intensität und dem Sauerstoffverbrauch ergibt. Um Stoffwechseländerungen in neuronalen Zellen messen zu können, musste das System auf primäre hippocampale Neurone (PHN) angepasst werden. Dazu wurden zunächst mittels hochauflösenden Respirometrie (Oroboros) die Atmungsleistung der PHNs bestimmt und die Modifikatoren der Atmungskette ein titriert. Anschließend konnte das Entkoppler-Inhibitor Protokoll im NADH FLIM angewendet werden. Wie in Abb. 3 zu sehen ist, sind die Änderungen in der Atmungskettenleistung auch in PHNs über die Änderungen der NADH Fluoreszenzlebenszeiten messbar. e Abb. 3: NADH FLIM von primären hippocampalen Neuronen. Am Beispiel der Alzheimer Erkrankung soll mittels dieses Verfahrens die gleichzeitige optische Erfassung veränderter Parameter des zellulären Energiestoffwechsels (NADH, FAD+ und po2) durch parallele FLIM/PLIM Messungen in neuronalen Zellkulturlinien (SH-SY5Y, Neuro-2a, HEK) durchgeführt werden. Hierzu wurden zunächst die im Labor bereits vorhandenen Vektoren von APP und BACE1 in neuronalen Zellkulturlinien (Neuro-2a, HEK293) exprimiert. Zur Messung des oxidativen Stoffwechsels wurde eine hochauflösende Respirometrie mittels eines Oroboros Oxygraph-2K durchgeführt. Dabei zeigte sich bei APP transfizierten N2A und Zwischenergebnisse /5

4 HEK293 Zellen (Abb. 4A) sowohl eine Abnahme der Routineatmung als auch der maximalen Kapazität der Elektronentransportkette. a b Abb. 4: Messung der veränderten Respiration nach APP Überexpression in intakten HEK 293 Zellen mittels hochauflösender Respirometrie (a) und NADH-FLIM (b), transfiziert mit einem Kontrolvektor (schwarz), einem APP Expressionsvektor (dunkelgrau) und einem APP Expressionvektor plus 0,1nM gamma secretase inhibitor (GSI) (hellgrau). Die Expression von BACE1 hingegen zeigte in keiner der Zelllinien eine Veränderung des mitochondrialen Stoffwechsels. Die Gabe eines Inhibitors der Gamma-Sekretase, welcher die Produktion von Aβ reduziert, führt zur Aufhebung der verringerten Atmungskettenleistung. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass hauptsächlich Aβ und nicht APP selbst für die beobachtete Abnahme des mitochondrialen Stoffwechsels verantwortlich ist. Zwischenergebnisse /5

5 In nachfolgenden Experimenten wurden die Veränderungen in der Atmung durch APP Expression auch mittels NADH-FLIM untersucht. Wie in Abb. 4B zu sehen ist, lässt sich auch im NADH-FLIM die veränderte Atmungskettenleistung nach APP Expression messen. Auch mittels FLIM lässt sich der beobachtete Effekt wieder durch die Gabe des Gamma-Sekretase Inhibitors aufheben. In ersten Versuchen im Oroboros Oxygraph-2k konnten wir feststellen, dass die Atmung bei HEK293 Zellen, deren Komplex I durch Rotenon inhibiert wurde, durch die Kombination von Methylenblau und anschließender Bestrahlung konzentrationsabhängig wiederhergestellt werden konnte. Im weiteren Verlauf des Projektes soll dies mit NADH-FLIM Messungen überprüft werden. Zwischenergebnisse /5