Abteilung für Radioonkologie, Universitätsklinikum Tübingen 2. Abteilung für Zellbiologie, Universität Duisburg-Essen

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1 Die Initiierung der intrinsischen Apoptose in -T- Zellen durch Celecoxib führt zur -Aktivierung nach Freisetzung aus der Interaktion mit den anti-apoptotischen Proteinen und. Justine Rudner 1, Simon Elsässer 1, Stephan M. Huber 1 und Verena Jendrossek 2 1 Abteilung für Radioonkologie, Universitätsklinikum Tübingen 2 Abteilung für Zellbiologie, Universität Duisburg-Essen justine.rudner@med.uni-tuebingen.de

2 Einleitung: 1. Der intrinsische/mitochondriale Apoptoseweg kann durch Bestrahlung oder durch den Cyclooxygenase-2-Inhibitor Celecoxib aktiviert werden. 2. Die mitochondriale Homöostase wird durch Mitglieder der Bcl- 2-Proteinfamilie (,, und ) kontrolliert. 3. Pro-apoptotische Multidomänproteine Bax und können durch die anti-apoptotischen Proteine, und sequestriert und inhibiert werden. 4. Weitere Mitglieder der -Proteinfamilie (BH3-only- Proteine) können durch Interaktion mit Bax/ diese aktivieren oder durch Interaktion mit // die antiapoptotische Funktion der letzteren aufheben. Apoptose Cyt C Zytosol // Fragestellung: Mitochondrium Wie regulieren die einzelnen Mitglieder der -Proteinfamilie Apoptose nach Aktivierung des intrinsischen Apoptoseweges? Methoden: Zellen: Stimulus: Bax-negative T-Zell-Lymphomzellen, (Vector-Kontrollen, -überexprimierende, überexprimierende) Cyclooxygenase-2-Inhibitor Celecoxib (-1 µm) Messung der Apoptose: Aktivierung von : a) fluoreszenzmikroskopisch (Hoechst 33342/Propidiumiodid-Doppelfärbung) b) durchflußzytometrisch (Nicoletti, sub G1-Messung) durchflußzytometrisch mit einem Antikörper gegen die aktive Konformation des Proteins Herunterregulierung von und erfolgte mittels sirna nach Elektroporation. Als Kontrolle wurde unspezifische sirna (nt = non-targeting) verwendet.

3 1) Expression von,, und in -Vector-, -Bcl- 2- und --Zellen 2) Überexpression von aber nicht von schützt vor Celecoxib-induzierter Apoptose (Hoechst/PI 12h nach Celecoxib) µm 5 µm 75 µm 1 µm J. J. A549 Vector 1 3 α/β-tubulin 4 2 3) Überexpression von aber nicht von schützt vor -Aktivierung 6h nach Behandlung mit Celecoxib counts Vector K C µm C 5 µm C 75 µm C 1 µm IgG 1: gesunde Zelle, 2: frühe Apoptose, 3: späte Apoptose, 4: Nekrose 4) Überexpression von aber nicht von verhindert die Freisetzung von Cytochrom C ins Zytosol 6h nach Behandlung mit Celecoxib J. J h C 75 µm Aktivierung Zytosolische Extrakte Cyt C GAPDH

4 5) Apoptoseinduktion in -Vector- und --Zellen nach Herunterregulierung von und mittels sirna 7) interagiert mit und nicht aber mit in unstimulierten -Zellen. Nach Stimulierung mit Celecoxib (6h, 75 µm) wird aus der Interaktion mit und freigetzt Vector time (h) nt mcl1 bcl-x nt mcl1 bcl-x WCL h 3h 6h Celecoxib IP: IgG Celecoxib: h h 3h 6h IP: IgG Celecoxib: h h 3h 6h IP: IgG Celecoxib: h h 3h 6h 6) Herunterregulierung von in -überexprimierenden Zellen sensitivert die Zellen gegenüber Celecoxib-induzierter Apoptose J. nt J. bcl-x J. sirna: nt bcl-x -- IP: IgG Celecoxib: h h 3h 6h µm Celecoxib GAPDH

5 Zusammenfassung: 1. Überexpression von aber nicht von schützt vor Celecoxib-induzierten Apoptose, -Aktivierung und Freisetzung von Cytochrom C ins Zytosol. 2. Herunterregulierung von induziert Apoptose in -Vector-Zellen, aber nicht in überexprimierenden Zellen. 3. Herunterregulierung von in -überexprimierenden Zellen sensitivert gegenüber Celecoxib-induzierter Apoptose. 4. In unstimulierten Zellen interagiert mit den anti-apoptotischen Proteinen und, nicht aber mit. Nach Stimulierung mit Celecoxib wird abgebaut und die Interaktion von mit und aufgehoben Schlussfolgerung: Für eine erfolgreiche Induktion von Apoptose in -Zellen müssen und neutralisiert werden! Im unstimulierten Zustand wird durch die anti-apoptotische Proteine und sequestriert. Celecoxib induziert Apoptose über Aktivierung von Noxa und Herunterregulierung von. Das dabei freigesetzte wird aktiviert. Die Aktivierung von kann durch Überexpression von verhindert werden. Da nicht mit interagiert, kann die Überexpression von die Herunterregulierung von nicht kompensieren. Bad Bad Celecoxib Noxa